circUTRN在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物

circutrn在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及circutrn在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物。


背景技术：

2.心脏病的危害极大，几乎所有的心血管疾病最终都会导致心力衰竭的发生，心肌梗死、心肌病、血流动力学负荷过重、炎症等任何原因引起的心肌损伤，均可造成心肌结构和功能的变化，最后导致心室泵血和/或充盈功能低下，严重威胁着人类的生命。其中，缺血性心肌病是危害我国国民健康的重大疾病之一，及时进行再灌注是挽救缺血心脏的必需步骤，然而该过程伴随着严重的心肌缺血/再灌注(i/r)损伤，临床仍缺乏有效的干预手段。目前临床上治疗缺血性心肌病的手段主要由溶栓治疗、介入治疗及手术治疗。但是治疗过程多引起各种并发症，例如出血、空气栓塞、穿刺点出血、感染等。
3.环状rna(circular rna，circrna)是一类特殊的非编码rna分子，与传统的线性rna(linear rna，含5
’‑
和3
’‑
末端)不同，circrna分子呈封闭环状结构，不受核糖核酸外切酶影响，表达更稳定，不易降解。在功能上，circrna可以作为微小rna或蛋白质的海绵体，从而实现对下游分子和信号通路的调控；部分circrna还具有编码潜能，能够翻译成蛋白质或小肽发挥功能。越来越多的证据，circrna在疾病的发生发展中发挥着重要的调控作用。在心血管领域，已有研究表明，circznf292在心肌发育过程中促进内皮细胞的增殖；circanril在动脉粥样硬化疾病中促进细胞凋亡；circhrcr通过上调心脏保护蛋白arc从而抑制病理性心肌肥厚和心力衰竭的发生；circfoxo3在心肌病中起到蛋白质海绵的作用，调控心脏衰老等。因此，需要找到一种普遍的缺血再灌注损伤相关的调节基因，并对其进行干预，才能够广泛实现对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭的治疗。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了circutrn在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物。本发明利用circutrn制备的治疗心力衰竭药物可以治疗或改善心力衰竭，尤其是对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭有很好治疗效果。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了circutrn在制备治疗心力衰竭药物中的应用，所述circutrn的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7.优选的，所述心力衰竭包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭。
8.本发明还提供了一种表达circutrn的重组载体，所述重组载体包括核苷酸序列如seq id no.1所示的circutrn和成环载体。
9.优选的，所述成环载体包括含有启动子cmv的成环载体。
10.优选的，所述成环载体包括慢病毒过表达载体或腺病毒过表达载体。
11.优选的，所述circutrn序列位于慢病毒过表达载体的ecori和ndei酶切位点之间。
12.优选的，所述circutrn序列位于aav过表达载体的ecori和bamhi酶切位点之间。
13.本发明还提供了一种治疗心力衰竭的药物，所述药物包括：上述重组载体。
14.优选的，所述药物还包括慢病毒载体系统或腺病毒载体系统。
15.优选的，所述心力衰竭包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭。
16.有益效果：
17.本发明提供了circutrn在制备治疗心力衰竭药物中的应用，所述circutrn的核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明通过实验证明了circutrn制备的治疗心力衰竭药物可以治疗或改善心力衰竭，尤其是对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭有很好治疗效果；具体包括circutrn具有改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全的作用；另外，circutrn还可以减小急性心肌缺血再灌注损伤的梗死面积；过表达circutrn能够抑制氧糖剥夺/恢复所诱导的心肌细胞凋亡。
附图说明
18.图1为荧光定量pcr检测尾静脉注射腺相关病毒9(aav9)包装的circutrn后心肌组织中circutrn的表达明显上调；
19.图2为超声心动图检测静脉注射aav9包装的circutrn改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全；
20.图3为静脉注射aav9包装的circutrn后降低了急性心肌缺血再灌注损伤引起的心肌梗死严重程度；aar/lv：area at risk/left ventricle weight，危险区/左心室；inf/aar：infarct size/area at risk，梗死区/危险区；
21.图4为circutrn能够抵抗ogd/r(氧糖剥夺/再恢复模型)诱导的新生小鼠心肌细胞凋亡(n＝6)；ev，对照载体；circutrn，circutrn过表达载体；tunel阳性指示心肌细胞凋亡阳性；图中白色箭头指示心肌细胞凋亡；α-actinin，α-actinin阳性表示该细胞是心肌细胞；dapi，指示细胞核；
22.其中，sham，假手术；iri 3w，iri后3周；aav9-ev，aav9对照病毒；aav9-oe-circutrn，circutrn过表达aav9；*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001。
具体实施方式
23.本发明提供了circutrn在制备治疗心力衰竭药物中的应用，所述circutrn的核苷酸序列如seq id no.1所示，具体如下：5
’‑
tggatctcttagagctgaatacgacgaatgaagttttcaagcagcacaaactgaaccaaaatgatcagctcctgagtgtcccagacgtcatcaactgtctgaccaccacttacgatgggcttgagcagctgcacaaggacttggtcaatgttccactctgcgtcgatatgtgtctcaactggctgctcaacgtatacgacacgggccggactggaaaaattcgggtacagagtctgaagattggattgatgtctctctccaaaggcctcttagaagagaaatacagatgtctctttaaggaggtggcagggccaacagagatgtgtgaccagcggcagcttggcctgctacttcacgatgccatccagatccctaggcagctgggggaagtagcagcctttgggggcagtaacattgagcccagtgtccgcagctgcttccagcagaataacaacaagccagaaatcagtgtgaaggagtttatagactggatgcatttggaaccccagtccatggtgtggttgccggttctgcatcgggtcgcagctgctgagactgcaaaacatcaggccaaatgcaacatctgcaaagaatgcccgattgttgggttcagatacaggagcctaaagcattttaattatgatgtct
gccagagttgcttcttttctggaagaacagcaaagggccacaagttacattacccgatggtagaatactgcataccg-3’。在本发明中，所述circutrn的circatlas id为mmu-utrn_0055。本发明通过实验证明了circutrn制备的治疗心力衰竭药物可以治疗或改善心力衰竭，尤其是对缺血再灌注损伤引起的心力衰竭有很好治疗效果；具体包括circutrn具有改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全的作用；另外，circutrn还可以减小急性心肌缺血再灌注损伤的梗死面积；过表达circutrn能够抑制氧糖剥夺/恢复所诱导的心肌细胞凋亡。
24.在本发明中，所述心力衰竭优选包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭，更优选包括缺血再灌注损伤引起的心力衰竭。
25.本发明还提供了一种表达circutrn的重组载体，所述重组载体包括核苷酸序列如seq id no.1所示的circutrn和成环载体。
26.在本发明中，所述成环载体优选包括含有启动子cmv的成环载体，进一步优选包括慢病毒过表达载体或腺病毒过表达载体，更优选包括慢病毒过表达载体plo-cir或腺病毒过表达载体pk5ssaav-cir。
27.在本发明中，所述circutrn序列优选位于慢病毒过表达载体的ecori和ndei酶切位点之间。本发明及实施例所述慢病毒过表达载体plo-cir优选购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为gs0103。本发明提供的重组载体可以使目的基因(seq id no.1所示的序列)在真核细胞内表达为环状rna circutrn，从而发挥改善和/或治疗心力衰竭的作用。
28.在本发明中，所述circutrn序列优选位于aav过表达载体的ecori和bamhi酶切位点之间。本发明及实施例所述aav过表达载体pk5ssaav-cir优选购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为gs0109。本发明提供的重组载体可以使目的基因(seq id no.1所示的序列)在真核细胞内表达为环状rna circutrn，从而发挥改善和/或治疗心力衰竭的作用。
29.本发明还提供了一种治疗心力衰竭的药物，所述药物包括：上述重组载体。在本发明中，当所述重组载体的成环载体为aav过表达载体时，所述药物的制备方法优选包括腺相关病毒包装；所述腺相关病毒优选包括aav9病毒。本发明对所述药物的包装没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的操作方式即可。本发明所述腺相关病毒不参与任何疾病的发生，免疫原性低，基因可持续表达半年以上，其中aav9病毒对心脏组织存在强的亲和性，可以作为载体将目的基因序列在心脏组织中稳定高效的表达。
30.在本发明中，当所述重组载体的成环载体为慢病毒过表达载体时，所述药物的制备方法优选包括慢病毒包装。本发明对所述药物的包装没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的操作方式即可。
31.在本发明中，所述药物优选还包括药学上可接受的辅料。
32.在本发明中，所述心力衰竭优选包括急性心力衰竭或慢性心力衰竭，更优选包括缺血再灌注损伤引起的心力衰竭。
33.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的circutrn在制备治疗心力衰竭药物中的应用、重组载体和治疗心力衰竭的药物进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
34.实施例1
35.一种表达circutrn的重组载体，由以下步骤构建得到：
36.1)将小鼠心脏组织总rna逆转录后依次进行pcr扩增，双酶切，回收获得circutrn
的cdna序列(如seq id no.1所示)；所述pcr扩增的上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示，具体如下：5
’‑
cggaattctgaaatatgctatcttacagtggatctcttagagctgaatacgacg-3’，所述pcr扩增的下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示，具体如下：
[0037]5’‑
ggaattccatatgtcaagaaaaaatatattcaccggtatgcagtattctaccatcgg-3’；
[0038]
每50μlpcr扩增反应体系中，由以下组分组成：上游引物(10μm)1μl(终浓度为0.2μm)、下游引物(10μm)1μl(终浓度为0.2μm)、2
×
transstart fastpfupcr supermix(全式金生物，货号as221)25μl、cdna模板(500ng/μl)1μl和无酶水22μl。
[0039]
pcr反应进程为：95℃预变性2min；95℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸30s，36个循环；4℃，保温。
[0040]
所述双酶切的体系为：ecori-hf(星选酶)1μl、ndei(星选酶)1μl、10x cutsmart缓冲液5μl、pcr产物/或者载体1μg和无酶水(体积定容到50μl)。
[0041]
双酶切反应：37℃，4h；
[0042]
双酶切后的pcr产物采用天根生物超薄dna产物纯化试剂盒(货号dp203)清洁回收。
[0043]
2)将成环载体(慢病毒过表达载体plo-cir，购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为gs0103)进行双酶切(方法同步骤1)后，采用天根生物超薄琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(货号dp208)回收大片段载体。
[0044]
3)将步骤1)回收的片段插入步骤2)回收的成环载体上，得到连接产物。具体反应体系如下：t4 dna连接酶1μl、10
×
t4 dna连接酶缓冲液1μl、双酶切的载体(100ng)2μl、双酶切的基因(100ng)1μl和无酶水5μl，总体积为10μl。
[0045]
反应条件为：16℃，8h；
[0046]
4)50μl感受态细胞(感受态细胞transstbl3 chemically competent cell全式金生物，货号cd521)冰上化开，加入5μl步骤3)制备的连接产物，轻弹混匀，在冰上放置25min；42℃热激45s，然后放置回冰上2min；后加入500μl培养基(无抗lb培养基，品牌为全式金，货号为cat#cd521)，混匀后37℃，180转/min培养1h，复苏细菌。涂布在氨苄抗性的培养平板上过夜培养。过夜培养后挑取单克隆摇菌，送sanger测序。
[0047]
实施例2
[0048]
一种与实施例1相似的表达circutrn的重组载体，区别在于：
[0049]
1、将步骤1)中的下游引物替换为核苷酸序列如seq id no.4所示的下游引物，具体如下：
[0050]5’‑
cgggatccagttgttcttaccggtatgcagtattctaccatcgg-3’；2、将步骤1)中的ndei(星选酶)替换为bamhi-hf(星选酶)；
[0051]
3、将步骤2)中的成环载体替换为aav过表达载体pk5ssaav-cir(购自广州吉赛生物科技股份有限公司，货号为gs0109)。
[0052]
实施例3
[0053]
一种治疗心力衰竭的药物，所述药物的制备方法如下：
[0054]
使用293t细胞在合适的细胞密度(80％)时加入包装体系；每皿10cm培养皿加入1ml包装体系：10μgaav2/9(购自addgene plasmid，货号#112865)、10μg paddeltaf6质粒(购自addgene plasmid，货号#112867)、10μg实施例2构建的重组载体，加dmem培养基(无
fbs无双抗)至910μl，加90μl pei转染试剂(总体积：1ml)；细胞转染60h之后收集上清及其细胞；采用碘克沙醇浓缩超速离心纯化病毒(收集上清后用浓缩柱(merck ufc905096)4000rpm 4℃，将所有上清离心浓缩至10～15ml即可)，得到的病毒悬液为所述药物；所述病毒悬液滴度为1
×
10
13
vg/ml。
[0055]
应用例1
[0056]
心肌缺血再灌注损伤(iri)模型建立：iri模型采用最严重的损伤效果，通过结扎冠状动脉左前降支造成心肌缺血30min后再进行血液复灌。取8～10周龄的野生型雄性小鼠，给小鼠以10μl/g的剂量腹腔注射4％水合氯醛对小鼠进行麻醉，麻醉后使用医用胶带将小鼠腹部朝上固定在恒温毯上，使用脱毛膏去除小鼠后颈部毛发。75％乙醇对脱毛部分进行消毒，在显微镜下，使用小剪刀将小鼠胸骨左缘第四第五肋间位置做一横形切口，切口长约1.2cm，并逐层分离胸壁肌肉直至肋间肌暴露，使用显微镊钝性分离肋间肌肉，暴露心脏，结扎左前降支动脉(左心耳至肺动脉圆锥间，因肉眼不可见，故结扎成功视下方心尖部缺血(变白)情况而定)。缝合肋间肌和胸壁肌肉。30min后再次打开胸腔，将结扎线剪断取出。将小鼠至于恒温毯上保温等待复苏后转移至鼠笼中饲养24小时(iri急性模型)或21天(iri 3周，长期重构模型)后处死小鼠，称量小鼠体重、胫骨长度、心脏重量等称重后留样进行后续检测。本实施例中所述假手术与上述iri手术相似，唯一区别在于，未进行结扎处理。
[0057]
实验分组分为4个组，具体分组信息：
[0058]
第1组对照病毒组(实施例3中的avv2/9)+假手术组，对小鼠心脏进行注射对照病毒，均按照10^
11
vg/只小鼠，一周后进行假手术，样本数为10只；
[0059]
第2组aav9-circutrn病毒(实施例3制备的药物)+假手术组，对小鼠心脏进行注射aav9-circutrn病毒，均按照10^
11
vg/只小鼠，一周后进行假手术，样本数为10只；
[0060]
第3组对照病毒(实施例3中的avv2/9)+iri手术组，对小鼠心脏进行注射对照病毒，均按照10^
11
vg/只小鼠，一周后进行上述iri手术，样本数为14只；
[0061]
第4组aav9-circutrn病毒(实施例3制备的药物)+iri手术组，对小鼠心脏进行注射aav9-circutrn病毒，均按照10^
11
vg/只小鼠，一周后进行上述iri手术，样本数为13只。
[0062]
利用rnaiso plus提取上述4组小鼠心脏组织中的总rna，采用荧光定量pcr法检测假手术及iri手术后三周的circutrn相对表达量；
[0063]
具体如下：以18s作为内参引物(具体序列为f1：5
’‑
tcaagaacgaaagtcggagg-3’，seq id no.5和r1：5
’‑
ggacatctaagggcatcac-3’，seq id no.6)；circutrn的qpcr引物序列为：f2：5
’‑
ggccacaagttacattacccg-3’，seq id no.7和r2：5
’‑
acgttgagcagccagttgag-3’，seq id no.8，qpcr的结果采用相对定量法进行分析，运用2-δδct进行计算，如下：δct＝靶基因ct值-内参ct值，δδct＝各实验组δct值-对照组δct平均值；
[0064]
具体实时荧光pcr(10μl体系)方法如下：
[0065]
配制引物工作液：储液(100μm)稀释20倍变成母液(5μm)，母液稀释10倍变成工作液(0.5μm)；
[0066]
配制cdna和sybr混合液：常用体积比是cdna:sybr＝1:20(5μl/孔)。
[0067]
加板：加板顺序为：先加5μl引物工作液，后加5μl cdna和sybr的混合液，共10μl体系。
[0068]
pcr反应程序：bio-rad 2step
[0069]
95℃预变性30s；95℃变性15s，60℃退火60s，循环40次；
[0070]
熔融曲线分析：95℃1s，60℃1s，95℃continuous
[0071]
(65～95℃0.5℃increments at 2-5sec/step)
[0072]
cooling 40℃30s。
[0073]
具体的，第1组10只小鼠相对rna含量为0.838568、1.141555、1.018185、1.334223、0.75576、0.835667、0.777007、1.236275、1.249196、1.014663；
[0074]
第2组10只小鼠相对rna含量为1.848045、1.522033、1.718322、1.470187、2.940375、2.631709、3.108029、1.712377、1.913216、1.181812；
[0075]
第3组14只小鼠相对rna含量为0.454074、0.753145、0.557097、0.503827、0.541863、0.491751、0.560972、0.592957、0.484981、0.473357、0.368823、0.410655、0.373971、0.483303；
[0076]
第4组13只小鼠相对rna含量为1.83528、1.575708、2.167452、1.223488、1.516768、2.613531、2.455471、1.53262、0.796088、1.454981、1.642621、2.057653、0.911301。统计结果如图1所示，*，p＜0.05，***，p＜0.001。
[0077]
结果表明，circutrn在急性iri手术三周后表达下调；尾静脉注射aav9包装的circutrn后心脏组织中circutrn的表达明显上调。
[0078]
应用例2
[0079]
采用应用例1相同的分组及处理方式，选取c57bl/6j成年公鼠施行冠状动脉左前降支结扎，结扎30min后松开，在iri手术3周后，进行心脏超声测量上述四个组心功能相关指标(射血分数(ef)和短轴缩短率(fs))。小动物心脏超声测定小鼠心功能：将小鼠胸部脱毛后，用异氟烷吸入麻醉法将小鼠麻醉，在超声平板上固定好小鼠四肢，并将适量螯合剂涂抹于小鼠腹部心脏处，用探头找到小鼠心脏，待心率稳定在400bpm左右，取胸骨旁左心室长轴及左心室短轴进行检查，测量并计算心功能，获得心功能相关指标：左室射血分数ef和左心室短轴缩短率fs。结果见图2。
[0080]
具体数据为：第1组10只小鼠fs(％)值为26.57607、28.73468、30.00613、34.14948、32.35228、29.93588、22.36367、26.9502、27.2448、26.21533；
[0081]
第2组10只小鼠fs(％)值为28.37145、34.25649、31.288、26.87928、31.41054、37.83692、27.23812、22.8164、34.70449、32.0555；
[0082]
第3组14只小鼠fs(％)值为25.7799、25.72851、17.9281、16.89639、16.79336、18.24466、17.54019、20.96864、16.8033、23.96844、14.63545、24.6609、16.61429、23.86121；
[0083]
第4组13只小鼠fs(％)值为31.41518、30.00557、30.17961、28.22829、27.84015、34.28185、34.86179、29.70271、28.46201、22.60534、34.172137、27.64563、24.13351。
[0084]
第1组10只小鼠ef(％)值为52.58755、55.87751、58.14579、64.05795、61.45018、57.95299、45.50572、53.6604、53.85443、52.0395；
[0085]
第2组10只小鼠ef(％)值为55.51394、64.23814、59.70567、53.01966、60.23159、68.61732、53.49452、46.05206、65.00643、60.71237；
[0086]
第3组14只小鼠ef(％)值为51.63186、51.77215、37.77709、35.63613、35.49855、38.65654、37.26884、43.38542、35.61092、48.38518、32.21303、49.7293、35.34495、
49.15511；
[0087]
第4组13只小鼠ef(％)值为60.09334、57.32902、58.13966、55.29248、54.55704、64.67837、65.48337、57.59445、56.06144、46.36027、63.965966、54.38887、49.07793。统计结果如图2所示，**，p＜0.01。
[0088]
由图2可知，尾静脉注射circutrn过表达aav9能够改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全。
[0089]
应用例3
[0090]
ttc染色实验分组分为2个组，每组各10只小鼠，具体为：
[0091]
第1组：在iri模型造模1周前开始，采用一次性1ml无菌注射器通过尾静脉注射对照aav9(实施例3中的avv2/9)，按照10^
11
vg/只小鼠的浓度进行处理；
[0092]
第2组：在iri模型造模1周前开始，采用一次性1ml无菌注射器通过尾静脉注射aav9-circutrn(实施例3制备的药物))，按照10^
11
vg/只小鼠的浓度进行处理。一周后两组采用应用1所述的方法进行iri手术，24小时之后取样。
[0093]
ttc(triphenyltetrazolium chloride，2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色：将接受iri手术后的小鼠用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉，按照每20g体重200μl麻醉。待小鼠麻倒后，将小鼠腹部向上平躺固定在泡沫板上，剪刀剪开胸部皮肤、肌肉和肋骨，露出心脏。首先，用7-0带线针再次结扎缺血手术时的心脏结扎位点，结扎完成后，用1ml胰岛素注射器吸取1～2ml 1％的evans blue，注射入小鼠心脏左心室，观察小鼠鼻尖和四肢，直到鼻尖和四肢变蓝色，注射完成。取出心脏后将心脏置于1.5ml离心管，-20℃冰箱暂存。待心脏冷冻变硬后便可进行切片。将心脏放与切片模具的凹槽里，按凹槽空格依次将刀片经心脏表面由上向下插进空格。待刀片插满后，平行按压刀片，将心脏切成每片1mm的厚度，取下刀片，将心脏切片放进1.5ml离心管。将事先配好的1％的ttc溶液加到离心管中，每管1ml，加好后将离心管置于37℃避光水浴10min。将4％的pfa溶液加到96孔板中，用于固定心脏切片。水浴结束后，将心脏切片从离心管中取出，放入96孔板中固定，每孔一片。固定时间1.5小时。切片固定后1.5小时拍照，防止时间过久颜色流失。96孔板中取出每片心脏称重，记录。使用image j软件手动圈绘统计心脏切片正面整片面积，正面白色梗死面积，正面红色面积和反面整片面积，反面白色梗死面积，反面红色面积。将统计得到面积数据对应每片切片重量填入表格。
[0094]
具体实验结果见附图3，具体的，第1组aar/lv比值为0.546797124、0.498411923、0.573749793、0.478128607、0.502519571、0.474636482、0.466649783、0.501469873、0.504364335、0.445463737；
[0095]
第2组aar/lv比值为0.420656141、0.501991857、0.504419175、0.412981739、0.596882045、0.560244519、0.55786186、0.475217199、0.523069062、0.459159742；
[0096]
第1组inf/aar比值为0.412583、0.558483、0.544388、0.485926、0.573036、0.541956、0.484268、0.498673、0.548814、0.542946；
[0097]
第2组inf/aar比值为0.278354675、0.261470747、0.473479359、0.387369342、0.245335、0.367833474、0.349436683、0.497779168、0.404129982、0.296345906。统计结果如图3所示，**，p＜0.01。
[0098]
结果表明，尾静脉注射circutrn过表达aav9能够改善心肌缺血再灌注损伤引起的
心肌梗死面积。
[0099]
应用例4
[0100]
心肌细胞氧葡萄糖剥夺恢复(ogd/r)模型建立及质粒转染：nmcm用正常心肌细胞培养基培养，待细胞铺展至80％孔面积时换无血清培养基饥饿处理7小时；将6μl2000加入100μl无血清培养基(dmem)中，预混5分钟(轻轻吹打混匀后静置5分钟)，记为a液；将2μg质粒加入100μl无血清培养基(dmem)中，预混5分钟(轻轻吹打混匀后静置5分钟)，记为b液；预混结束将a液与b液混匀，室温静置20分钟后，以100μl/孔的量加入到96孔板中，转染7小时后，弃转染培养基，换成无血清培养基，于37℃，5％co2的恒温培养箱中继续培养；换液20h之后，将细胞的培养基换成无糖培养基，并将细胞培养板放置在缺氧盒(一个缺氧盒中放置一个缺氧袋，并用无菌填充物尽量排尽缺氧盒中的空气)中孵育8h；从缺氧盒中取出细胞培养板行复氧操作，并将无糖培养基换回正常心肌细胞培养基孵育12h至实验终点。
[0101]
在新生小鼠心肌细胞中，转染实施例1制备的表达circutrn的重组载体(0.02mg/l)，处理72h后收集细胞，在实验终点前20小时构建ogd/r模型(缺氧缺糖8h，复氧复糖12h)完成功能获得性实验。具体分组为：1)circutrn对照组(实施例1中的慢病毒过表达载体plo-cir)，2)circutrn对照+ogd/r处理组，3)circutrn过表达组(实施例1制备的表达circutrn的重组载体)，4)circutrn过表达+ogd/r处理组。实验终点以tunel与α-actinin/hoechst免疫荧光共染检测circutrn对心肌细胞凋亡的保护作用。
[0102]
由图4可知，ogdr模型中，nmcm凋亡水平与对照组相比显著上升；并且在基础水平过表达circutrn对凋亡没有影响；而在ogdr刺激下，过表达circutrn能够保护nmcm缺血再灌注损伤引起的凋亡。具体的，第1)组凋亡率(％)为4.164398、3.660825、3.954054、5.02763、5.036923、6.062882；
[0103]
第2)组凋亡率(％)为4.35287、5.562385、4.304403、5.45163、3.801478、4.991256；
[0104]
第3)组凋亡率(％)为12.97532、15.21066、15.17345、17.85742、14.54959、15.53715；
[0105]
第4)组凋亡率(％)为9.172941、9.148951、8.449327、11.39639、7.821497、10.04349。统计结果如图4所示，**，p＜0.01。
[0106]
综上所述，circutrn具有改善心肌缺血再灌注损伤3周所致的心脏收缩功能不全的作用；另外，circutrn还可以减小急性心肌缺血再灌注损伤的梗死面积；过表达circutrn能够抑制氧糖剥夺/恢复所诱导的心肌细胞凋亡。
[0107]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。