一种生物材料及其制备方法和应用与流程

1.本技术涉及生物技术领域，特别是涉及一种生物材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.每年有数以千万计的人会遭受到组织损伤，其中包括意外损伤、外科损伤、慢性溃疡等，严重者会导致截肢甚至威胁生命。缝合线与缝合钉是目前的临床上封闭伤口首选的方法。然而，伤口缝合在手术过程中是一个耗时较长的步骤，拆线会导致组织的二次伤害，不仅增加了患者的就医次数，而且易导致疤痕增生、挛缩和感染等风险。不需要拆线的组织粘合剂的发明给外科手术带来巨大技术进步，与伤口缝合方法相比，其更便于操作，大幅缩短手术时间，显著减低组织的二次损伤和感染的风险。
3.目前，临床上广泛应用的组织粘合剂主要是人工合成的氰基丙烯酸酯(如医用504和508胶)和纤维蛋白粘合剂(如猪源纤维蛋白粘合剂和冻干人纤维蛋白粘合剂)。但是，氰基丙烯酸酯在与组织粘合固化过程中急速聚合反应而产热，固化后则呈现玻璃样刚性固体，力学性能上与软组织的匹配性差，其生物降解性能极差，长期滞留组织内使周围组织持续产生炎症反应，不良的生物相容性限制其只能外用。猪源纤维蛋白粘合剂可用于止血、封闭创面、促愈合、防粘连、药物缓释。冻干人纤维蛋白粘合剂为局部止血药，辅助用于处理烧伤创面、普通外科腹部切口、肝脏手术创面和血管外科手术创面的渗血。因纤维蛋白粘合剂成胶后的机械强度差，对于身体活动部位的创面和纵切伤口因其粘附力不足而易撕裂产生二次伤害。上述两类纤维蛋白粘合剂为血液制品，均有可能会发生过敏反应和潜在的病毒传播风险。因此，临床上亟需生物兼容性好、粘合力大且潜在风险低的组织粘合剂。


技术实现要素：

4.本技术实施例提供了一种生物材料及其制备方法和应用。
5.第一方面，本技术实施例提供的一种生物材料，包括经干燥来源于腹足纲动物的黏性物质得到的组合物；可选地，腹足纲动物包括腹足纲柄眼目动物；进一步可选地，腹足纲动物包括石磺科、玛瑙螺科、肋齿螺科、蛞蝓科、嗜黏液蛞蝓科和巴蜗牛科中的一种或多种。
6.在一些实施例中，组合物包括酸性多糖，以组合物的重量计，酸性多糖的质量百分含量a满足a≥5％，可选地，酸性多糖的质量百分含量a满足5％≤a≤25％。
7.在一些实施例中，酸性多糖包括式(i)所示的化合物，
8.9.式(i)中，
10.a环为α-d-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖基α-d-glcn，
11.r1为乙酰基-coch3或磺酸基-so
3-；
12.b环为α-l-艾杜糖醛酸基α-l-idoa或α-d-葡萄糖醛酸基α-d-glca，
13.r2为羟基-oh或硫酸酯基-oso
3-，
14.r3为羧基-coo-及其无机盐；
15.n为大于100的整数；
16.酸性多糖的重均分子量mw为400kda≤mw≤1600kda，且其多分散系数pdi值小于5.0，
17.其中，以酸性多糖的质量计，硫酸酯基-oso
3-的质量百分含量c为c≥8％。
18.在一些实施例中，酸性多糖由a环中的α-d-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖基α-d-glcn与b环中的α-l-艾杜糖醛酸基α-l-idoa或α-d-葡萄糖醛酸基α-d-glca以(1
→
4)糖苷键交替连接而成。
19.在一些实施例中，组合物还包括多肽，以组合物的质量计，多肽的质量百分含量b为b≥10％，且a+b≥50％。
20.在一些实施例中，以多肽的质量计，多肽包括大于等于5％的第一氨基酸组和大于等于10％的第二氨基酸组以及大于等于30％的第三氨基酸组。第一氨基酸组包括酪氨酸与苯丙氨酸。第二氨基酸组包括赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。第三氨基酸组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸以及丙氨酸。
21.在一些实施例中，组合物还包括尿囊素和乙醇酸。
22.第二方面，本技术实施例还提供了一种制备第一方面任一实施例的生物材料的方法，该方法包括提供腹足纲动物；刺激腹足纲动物的表皮，以使腹足纲动物分泌黏性物质；干燥黏性物质得到组合物；可选地，干燥为减压干燥或冷冻干燥。
23.第三方面，本技术实施例还提供了一种用于组织粘合、修复、止血、组织液渗透封堵、美容或者作为细胞培养基、蛋白或药物载体的产品，产品包括如本技术第一方面实施例中任一项的生物材料；可选地，产品为粉末状、片状、海绵状、凝胶状或膏状。
24.在一些实施例中，产品为医用粘合剂。
25.本技术天然生物材料为一种基于未经改性的蜗牛粘液制备的医用粘合剂，具有强效粘附皮肤、肌肉、内脏等人体软组织的功能，可用于组织黏附和伤口愈合及修复，综合性能优于现有的如氰基丙烯酸酯和纤维蛋白胶等医用粘合剂。
26.本技术天然生物材料具有使用时不需要外加其他试剂、操作方便、易于改性、生物兼容性好等优点，为皮肤、脆弱器官和不可触及的内部组织的伤口提供了一种实用性强且无需缝合即可黏附的创新选择。
27.本技术天然生物材料的生物力学性质接近于人体软组织，且具有适宜的刚性、弹性、变形性和强粘附性，以及良好的生物相容性和生物降解性，克服既有产品的缺陷和限制。
28.本技术天然生物材料具有显著促进急性和慢性伤口组织的血管重建与表皮再生功能，能够持续有效愈合各类伤口，并且伴随伤口愈合期逐步降解而避免更换药物时带来二次伤害。
29.本技术天然生物材料的制备方法，具有工艺简洁、操作简便、过程环保、易于放大和生产成本低等显著技术优势。
附图说明
30.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对本技术实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据附图获得其他的附图。
31.图1为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液的理化性质；其中，图1a为白玉蜗牛；图1b为光亮大蜗牛；图1c为白玉蜗牛新鲜粘液；图1d为光亮大蜗牛新鲜粘液；图1e为白玉蜗牛粘液冻干品状态；图1f为光亮大蜗牛冻干品外观；图1g为白玉蜗牛冻干品电镜扫描图；图1h为光亮大蜗牛粘液冻干品电镜扫描图；图1i为两种蜗牛粘液冻干品对湿润的皮肤黏附效果的展示，i左：白玉蜗牛粘液冻干品，i右：光亮蜗牛粘液冻干品；图1j与图1k分别为蜗牛粘液及其冻干品的水性凝胶的流变学曲线；图1l为蜗牛粘液冻干品的主要化学成分组成及含量。
32.图2为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液多肽电泳图；其中，图2a为白玉蜗牛粘液多肽电泳结果；图2b为光亮蜗牛粘液多肽电泳结果。
33.图3为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液酸性多糖的结构解析；其中，图3a为蜗牛粘液酸性多糖的1h nmr谱图；图3b为蜗牛粘液酸性多糖的13c nmr谱图；图3c为蜗牛粘液酸性多糖的1h-1h cosy谱图；图3d为蜗牛粘液酸性多糖的hsqc谱图。
34.图4为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液及其冻干品的组织黏附性能测试；其中，图4a为新鲜蜗牛粘液与冻干品对内脏组织的黏附性能展示；图4b为搭接剪切黏附性测试，其中i为测试方法示意图，ii为剪切力-时间曲线，iii为各组的剪切黏附强度柱状统计图；图4c为抗拉伸黏附测试，其中i为测试方法示意图，ii为拉伸力-时间曲线，iii为各组的抗拉黏附强度柱状统计图；图4d为180
°
剥离测试，其中i为测试方法示意图，ii为剥离力-时间曲线，iii为各组的界面黏附能柱状统计图(*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001)。
35.图5为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液冻干品的体内外止血性能评价；其中图5a为各组血凝指数随时间的变化趋势；图5b为红细胞及血小板在各种材料表面的粘附状态的扫描电镜照片(比例尺：10μm和2μm)；图5c为150s时各组血凝状态展示；图d为大鼠肝脏止血评价示意图；图5e为各组肝脏出血量统计(*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；)；图5f为用滤纸收集的各组肝脏出血量展示。
36.图6为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液冻干品对皮肤切口粘合效果的评价；其中，图6a为术后0、3、5、7时各组皮肤粘合效果图或切口愈合效果图(比例尺：0.5cm)；图6b为术后第7天各组组织切片h&e染色照片(比例尺：1mm，200μm)；图6c为各组切口愈合过程中伤口大小随时间变化的的热图；图6d为各组切口愈合率统计(*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001)。
37.图7为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液冻干品对急性创面伤口愈合效果评价；其中，图7a为各组伤口愈合效果；图7b为各组伤口愈合率统计(*表示p《0.05，**表示p《
0.01，***表示p《0.001；)；图7c为术后5天与15天的组织切片h&e染色结果(比例尺：1mm和100μm))。
38.图8为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液冻干品对糖尿病大鼠慢性伤口愈合效果评价其中，图8a为动物实验设计示意图；图8b为各组伤口愈合情况展示；图8c为各组愈合率统(*表示蜗牛粘液冻干品与生理盐水组的显著性差异；表示蜗牛粘液酸性多糖与生理盐水组的显著性差异；
§
表示藻酸盐敷料
tm
组与生理盐水组的显著性差异；其中单个表示p《0.05，两个表示p《0.01，三个表示p《0.001)；图8d为各组术后第7天与第14天时伤口组织切片h&e染色结果(比例尺：1mm和300μm)；图e为各组术后第3/7/14天时的肉芽组织厚度统计；与图f为各组术后第7天与第14天时伤口组织切片马松染色结果(比例尺：1mm和300μm)；图8g为各组肉芽组织厚度统计(*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001)。
39.图9为本技术一些实施例提供的蜗牛粘液冻干品的生物相容性评价；其中，图9a为细胞活力测试统计图；图9b为smg皮下降解情况；图9c为d-smg皮下包埋处的组织切片h&e染色图)(*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001；比例尺：1mm)。
具体实施方式
40.为了使本技术的申请目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本技术，并非为了限定本技术。
41.为了简便，本文仅明确地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任何上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，尽管未明确记载，但是范围端点间的每个点或单个数值都包含在该范围内。因而，每个点或单个数值可以作为自身的下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
42.在本文的描述中，需要说明的是，除非另有说明，“若干”的含义是一个或者一个以上；“几个(种)”“多个(种)”的含义均是指两个(种)以上；“以上”、“以下”为包括本数；术语“上”、“下”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本文的限制。
43.在本文中，术语“可选地”和“可选为”是指在某些情况下可以提供某些益处的本技术的实施方式。然而，在相同或其他情况下，其他实施方式也可以是可选的。此外，对一个或多个可选实施方式的叙述并不意味着其他实施方式不可用，并且不意欲将其他实施方式排除在本公开的范围之外。
44.本技术的上述申请内容并不意欲描述本技术中的每个公开的实施方式或每种实现方式。如下描述更具体地举例说明示例性实施方式。在整篇申请中的多处，通过一系列实施例提供了指导，这些实施例可以以各种组合形式使用。在各个实例中，列举仅作为代表性组，不应解释为穷举。
45.自然界中，如贻贝这类软体动物可以在海水里牢牢地粘附于岩石、船舶、鲨鱼等表面，此类具有粘附性能的物质为软体动物分泌的富含多巴胺修饰的粘蛋白类成分。近年来，
贻贝粘蛋白通过现代生物技术提取后，可作为医用粘合剂，用于眼科手术、皮肤组织粘合、骨骼粘合等；也可作为外伤喷涂剂，具有较好的抑菌、止痛、止痒、促进愈合的作用。
46.受到贻贝等软体动物的启发，科学家们采用化学合成法进行各种仿生医用粘合材料的研发，已取得积极进展。
47.发明人发现，无论是天然来源还是仿生合成修饰的贻贝粘蛋白及衍生物，其中的多巴胺或其它多酚的邻苯二酚基团在碱性条件下氧化形成共价键，此为其发挥强粘附作用的关键。因此，在具体应用时需要氧化剂、碱性试剂或酶的参与，这限制了其临床应用范围。
48.为了寻找更合适的黏性物质，发明人将陆生的腹足纲动物作为研究对象，对腹足纲动物分泌的黏性物质进行研究，发现腹足纲动物分泌的黏性物质的化学成分完全不同于贻贝类等软体动物分泌的黏性物质，且发现了腹足纲动物分泌的黏性物质应用于医疗、护肤等领域具有预料不到的效果。
49.鉴于此，发明人提出了一种生物材料，该生物材料包括经干燥来源于腹足纲动物的黏性物质得到的组合物。发明人发现机械刺激腹足纲动物的腹足部分可大量分泌黏性物质，将黏性物质干燥后得到组合物具有优异的组织粘合和修复功能。
50.腹足纲动物是一类陆生软体动物，其足部能够从身体的腹部伸出，与地面接触进行爬行。可选地，腹足纲动物包括柄眼目(stylommatophora)动物和/或基眼目(basommatophora)。进一步可选地，所述腹足纲动物包括石磺科(onchididae)、玛瑙螺科(achatinidae)、肋齿螺科(pleurodontidae)、蛞蝓科(limacidae)、嗜黏液蛞蝓科(phiolomycidae)和巴蜗牛科(bradybaenidae)中的一种或多种。
51.示例性地，腹足纲动物包括褐云玛瑙螺、白玉蜗牛、光亮大蜗牛、南红蜗牛和法国田园蜗牛中的一种或多种；上述仅为举例性说明，并不用于限制本技术实施例的范围。
52.[酸性多糖]
[0053]
在一些实施例中，本技术实施例的组合物包括酸性多糖，以组合物的重量计，酸性多糖的质量含量a满足a≥5％；可选地，酸性多糖的质量含量a满足5％≤a≤25％。该类酸性多糖作为蜗牛糖胺聚糖，酸性多糖为水溶性大分子物质，具有较强的吸水保湿能力；并且在上述质量含量范围内，其吸水保湿能力更为优异。
[0054]
可选地，酸性多糖包括式(i)所示结构的同系化合物，
[0055][0056]
式(i)中，
[0057]
a环为α-d-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖基α-d-glcn，
[0058]
r1为乙酰基-coch3或磺酸基-so
3-；
[0059]
b环为α-l-艾杜糖醛酸基α-l-idoa或α-d-葡萄糖醛酸基α-d-glca，
[0060]
r2为羟基-oh或硫酸酯基-oso
3-，
[0061]
r3为羧基-coo-及其无机盐；
[0062]
n为大于100的整数；
[0063]
所述酸性多糖的重均分子量mw为400kda≤mw≤1600kda，且其多分散系数pdi值小于5.0，
[0064]
其中，以酸性多糖的质量计，所述硫酸酯基-oso
3-的质量百分含量c为c≥8％。
[0065]
酸性多糖为富含羧基和硫酸酯基的糖胺聚糖，由α-d-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖(α-d-glcn,glcn)和己糖醛酸的单糖组成，己糖醛酸包括α-l-艾杜糖醛酸(α-l-idoa,idoa)和α-d-葡萄糖醛酸(α-d-glca,glca)。酸性多糖可以是由单糖α-d-glcn与α-l-idoa或α-d-glca以(1
→
4)糖苷键交替连接形成大分子多糖。
[0066]
酸性多糖所包含的羧基、羟基等基团具有亲水性，分子之间和分子内部均易于形成氢键，酸性多糖分子之间能够发生分子交叉缠绕等，从而能够进一步提高其吸水保湿性能和与组织的粘附性能。
[0067]
[多肽]
[0068]
在一些实施例中，本技术实施例的组合物还可以包括多肽。以所述组合物的质量计，所述多肽的质量百分含量b为b≥10％，且a+b≥50％。
[0069]
多肽包括天冬氨酸(asp)、苏氨酸(thr)、丝氨酸(ser)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、胱氨酸((cys)2)、缬氨酸(val)、甲硫氨酸(met)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、酪氨酸(tyr)、苯丙氨酸(phe)、组氨酸(his)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)和脯氨酸(pro)。
[0070]
可选地，以所述多肽的质量计，第一氨基酸组的质量百分含量大于等于5％。第一氨基酸包括酪氨酸与苯丙氨酸。
[0071]
可选地，以所述多肽的质量计，第二氨基酸组的质量百分含量大于等于10％。第二氨基酸组包括赖氨酸、精氨酸以及组氨酸。
[0072]
可选地，以所述多肽的质量计，第三氨基酸组的质量百分含量大于等于30％。第三氨基酸组包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸以及丙氨酸。
[0073]
多肽为水溶性大分子物质，也具有吸水保湿能力。酸性多糖和多肽协同作用，酸性多糖包含的羧基和硫酸酯基阴离子能够和多肽包含的氨基和胍基等形成较强的离子键，而酸性多糖和多肽的大量羟基形成氢键，酸性多糖与多肽之间能够发生相互交叉缠绕，且相同分子之间或内部也能够发生相互交叉缠绕等等，在各类化学键及微观力学作用下，能够形成孔状结构，例如海绵状结构或凝胶状结构。
[0074]
在一些实施例中，本技术实施例的组合物还可以包括尿囊素和乙醇酸。尿囊素具有促进细胞生长、加快伤口愈合、软化角质蛋白等作用。乙醇酸包含羧基和羟基，易于与其他分子之间形成分子间作用力。可选地，本技术实施例的组合物还可以包括矿物质等。
[0075]
本技术实施例的组合物在经干燥处理后可以制备为粉状物质，也可以根据不同的应用场景制备为海绵状、片状、凝胶状或膏状等形态。海绵状、片状、凝胶状或膏状等形态也可以由粉状物质进一步制备得到。可选地，干燥处理可以采用减压干燥或冷冻干燥。
[0076]
在将本技术实施例的生物材料应用于生物组织修复时，粉状等形态的生物材料接触湿润生物组织后迅速吸水凝胶化，并体现出了优异的黏附性能；并且生物材料与生物组织尤其是人体软组织的生物力学性能较为接近，与生物组织的匹配性良好。在本文中，生物
组织包括皮肤、肌肉或内脏等。
[0077]
基于同一申请构思，本技术实施例还提供了一种制作生物材料的方法，该方法包括：
[0078]
提供腹足纲动物；
[0079]
刺激所述腹足纲动物的表皮，以使所述腹足纲动物分泌黏性物质；
[0080]
干燥所述黏性物质得到组合物；
[0081]
可选地，所述干燥为减压干燥或冷冻干燥。
[0082]
根据本技术实施例提供的方法，其工艺简洁、操作简便、生产成本低、易于工业化。且制备得到的生物材料同上述各实施例所述的生物材料，具有优异的吸水保湿、黏附性能。
[0083]
本技术实施例还提供了一种用于组织粘合、修复、止血、组织液渗透封堵、美容或者作为细胞培养基、蛋白或药物载体的产品，该产品包括上述各实施例的生物材料。可选地，产品为粉末状、片状、海绵状、凝胶状或膏状。
[0084]
本技术实施例的产品可以用于组织粘合、修复；示例性地，产品为医用粘合剂，即，本技术实施例提供了一种生物材料在制备外科手术、皮肤组织粘合和骨骼粘合等粘合剂的应用。
[0085]
该医用粘合剂黏附于生物组织时，其黏附力基本不会受到水和血液的影响。医用粘合剂在接触湿的生物组织时可以瞬间吸收界面水，避免界面水的干扰，拉近医用粘合剂与生物组织两者界面之间的空间距离，以达到易于形成分子间作用力的程度；医用粘合剂中包含酸性多糖，其富含羧基和硫酸酯基阴离子，能够与生物组织的蛋白质中的氨基和胍基等形成较强的离子键，医用粘合剂中包含多肽，多肽的氨基和和胍基或羧基，能够与生物组织的蛋白质中的羧基或氨基和胍基等形成离子键，而酸性多糖和多肽的大量羟基与生物组织之间亦可形成丰富的氢键等等，从而提高其黏附性能。
[0086]
本技术实施例的产品还具有封闭创面、止血、促进伤口愈合和修复的良好性能，也可作为外伤喷涂剂，用于烧伤、烫伤、手术等造成的皮肤、粘膜修复、神经修复等。即，本技术实施例提供了一种生物材料在创面组织修复-皮肤创伤修复上的应用。
[0087]
因生物材料包括与生物组织相容性较好的生物材料，其具有较低的血凝指数，在将生物材料应用于止血时，血液中的红细胞以及血小板可以粘附于生物材料的表面或镶嵌于生物材料的微小孔洞中形成聚集状态，从而能快速止血，降低出血量并缩短出血时间。因此，该生物材料具有良好的粘合伤口及止血功能。
[0088]
本技术实施例的生物材料还可以用于糖尿病足在内的慢性伤口创面封闭和修复。包括糖尿病足在内的糖尿病皮肤组织溃疡，是糖尿病患者中一种常见的高危并发症，糖尿病患者受到不同程度的足部溃疡影响，严重时可导致患者截肢，给糖尿病患者带来严重的健康威胁，造成了沉重的社会经济负担。本技术实施例的产品可以作为外用敷料，能够显著促进糖尿病足等皮肤伤口和/或创面和/或溃疡的愈合，故该敷料具有重要的预防和/或治疗糖尿病皮肤组织溃疡的应用价值。基于此，本技术实施例还提供了一种生物材料在糖尿病足和/或压疮、褥疮、烧伤等难以愈合的组织创伤愈合中的用途。
[0089]
本技术实施例的生物材料的主要组成为酸性多糖和多肽，且其冻干贴片和冻干海绵呈多孔海绵状或蜂窝状，生物材料可吸收组织液渗透，而进一步用于组织液渗透封堵用品的制备。因此，本技术还提供了一种生物材料在用于制备组织液渗透封堵用品的应用。
[0090]
本技术实施例的生物材料包含酸性多糖，而且酸性多糖因富含羟基、羧基和硫酸酯基等官能团而可与小分子药物、蛋白质、核酸和细胞形成氢键、离子键等相互作用，因此，所述产品中的生物材料可作为载体负载药物、蛋白质、核酸和细胞等功能性成分，这些化学键因为可逆而起到缓慢释放的作用。为此，本技术还提供了一种生物材料在创面封闭以及作为药物、蛋白质和细胞的载体在组织工程和再生医学中应用。
[0091]
本技术实施例的生物材料可以作为美容化妆品等功能性原料，添加到化妆品中进一步制备成液体或固体或半固体等各类面膜、膏霜、水剂等。因此，本技术还提供了一种生物材料在制备美容产品上的应用。
[0092]
实施例
[0093]
下述实施例更具体地描述了本技术公开的内容，这些实施例仅仅用于阐述性说明，因为在本技术公开内容的范围内进行各种修改和变化对本领域技术人员来说是明显的。除非另有声明，以下实施例中所报道的所有份、百分比、和比值都是基于重量计，而且实施例中使用的所有试剂都可商购获得或是按照常规方法进行合成获得，并且可直接使用而无需进一步处理，以及实施例中使用的仪器均可商购获得。
[0094]
实施例1
[0095]
蜗牛粘液冻干品的制备及其化学组成分析
[0096]
1.1实验材料
[0097]
原料：白玉蜗牛(achatina fulica"white")和光亮大蜗牛(helix lucorum)为市售途径购买。
[0098]
试剂：bicinchoninic acid蛋白检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司；曲拉通x-100、1,9-二甲基亚甲蓝、碱性蛋白酶、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、n,n,n
′
,n
′‑
四甲基乙二胺、尿囊素、乙醇酸、nacl、naoh等试剂均为市售分析纯试剂。
[0099]
1.2蜗牛粘液收集及冻干品制备
[0100]
将蜗牛洗净放置于洁净的培养皿中，用无菌木签刺激蜗牛的腹足部，蜗牛分泌出粘液(snail mucus gel，简写：smg)，将获取的新鲜粘液置于液氮中15min或者在冰箱-20℃冷冻结冰，经冻干机减压干燥后得到蜗牛粘液冻干品(简写为d-smg)。
[0101]
1.3蜗牛粘液冻干品中多肽含量、氨基酸组成及凝胶电泳分析
[0102]
(1)多肽含量分析：称取蜗牛粘液冻干品25mg，溶于20ml含0.5％的曲拉通x-100的pbs缓冲液中，定容至25.00ml，即得供试品溶液。以牛血清白蛋白为蛋白质标准品，采用bicinchoninic acid蛋白检测试剂盒进行标准曲线绘制。供试品溶液按照说明书进行操作，将测得的吸光度值带入标准曲线方程中计算相应的蛋白浓度，计算蜗牛粘液冻干品中的多肽含量。样品取三次进行平行试验。
[0103]
(2)氨基酸组成分析：称取蜗牛粘液冻干品25mg，加入6mol/l盐酸10ml，氮气保护下，110℃加热20h，冷却至室温后，过滤，滤液定容至25ml。取1.00ml溶液60℃脱酸2h，加入1.00ml样品稀释液即得供试品溶液，采用阳离子色谱进行分离，茚三酮柱后衍生法进行检测的方法，对标准品与供试品先后进行分析。样品取三份进行平行试验。
[0104]
色谱条件如下：
[0105]
色谱仪：amino acid analyzer a300
[0106]
色谱柱：磺酸型阳离子树脂，4.0
×
125mm
[0107]
进样量：20μl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
柱温：40～70℃
[0108]
流动相：钠盐缓冲液
ꢀꢀꢀ
流速：0.24ml/min
[0109]
检测器：微型二极管光度计(570nm，440nm两种检测波长)
[0110]
(3)电泳分析：称取三羟甲基氨基甲烷4.5375g，加水溶解，盐酸调ph 8.8,水稀释至25ml，得分离胶缓冲液。称取三羟甲基氨基甲烷1.5125g，加水溶解，盐酸调ph 6.8，水稀释至25ml，得浓缩胶缓冲液。称取十二烷基硫酸钠0.2g，水溶解稀释至2ml，即得10％sds溶液。称取过硫酸铵0.2g，水溶解稀释至2ml，即得10％过硫酸铵溶液。称取n,n,n
′
,n
′‑
四甲基乙二胺0.2g，水溶解稀释至2ml，即得10％temed溶液。取4ml的30％acr-bis、2.5ml的分离胶缓冲溶液、0.1ml的10％sds溶液、0.1ml 10％过硫酸铵溶液、0.004ml temed溶液、3.3ml水于烧杯中，均匀，灌入模具中加水封顶，放置30min；取5.8ml去离子水、1.5ml的30％acr-bis、2.5ml的浓缩胶缓冲溶液、0.1ml的10％sds溶液、0.1ml10％过硫酸铵溶液、0.01ml temed溶液于烧杯中，待分离胶聚合完成，吸去上层水，灌入浓缩胶溶液，插入样品梳。取蜗牛粘液冻干品2.5mg，加入1ml磷酸缓冲盐溶液，37℃超声溶解30min后，离心(15000rpm
×
10min)取上清得待测样品液。将蛋白标准品与样品分别上样进行凝胶电泳，蛋白条带电泳至合适位置后取出凝胶，进行染色分析。样品取三份进行平行试验。
[0111]
1.4蜗牛粘液冻干品中酸性多糖的含量测定
[0112]
取8mg 1,9-二甲基亚甲蓝、1.52g甘氨酸和1.185g nacl置于烧杯中，加去离子水溶解后，定容于500ml容量瓶，摇匀即得染料储备液。称量白玉蜗牛酸性多糖对照品，加水制成每1ml含糖胺聚糖0.1mg的溶液。分别量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0ml，各置1.5ml试管中，加水至1.0ml，摇匀。量取上述各溶液0.1ml于比色皿中，加入染料贮备液3ml，即得对照品测定溶液。照紫外-可见分光光度法在592nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，酸多糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
[0113]
称取白玉蜗牛粘液冻干品100mg，加入5ml去离子水，超声至无颗粒状态。6m naoh溶液调节ph至9后，加入2mg碱性蛋白酶，60℃水浴下搅拌36h，酶解过程中控制ph 9。酶解液离心(4000rpm
×
20min)，得到上清，定容至25ml容量瓶，量取100μl稀释10倍。量取500μl置于1.5ml试管中，加水至1ml，摇匀，即得供试品溶液。重复上述操作，测得供试品吸光度值，代入标准曲线方程中计算对应浓度，计算蜗牛粘液冻干品中多糖的含量。样品取6份进行平行试验。
[0114]
1.5蜗牛粘液冻干品中尿囊素的含量测定
[0115]
采用高效液相色谱法(hplc)对蜗牛粘液冻干品中尿囊素进行含量测定，在高效液相色谱仪(agilent 1260,usa)上，采用hilic亲水色谱柱(3μm,150
×
2mm,phenomenex,usa)分析。
[0116]
色谱条件如下：流动相体系：乙腈:10mm甲酸铵溶液(ph 2.70)＝90:10；流速：0.2ml/min；检测波长：200nm；柱温：30℃；进样量：0.5μl。
[0117]
配制尿囊素标准品溶液，浓度分别为0.04、0.06、0.08、0.12和0.16mg/ml。称取蜗牛粘液冻干品15mg，加入10ml流动相，超声10min混匀，于60℃下加热溶解1h，离心(15000rpm
×
15min)取上清液为供试品。样品取三次进行平行试验。
[0118]
标准品和供试品进测得的积分面积代入标准曲线方程中计算供试品中尿囊素浓度，进而计算出蜗牛粘液冻干品中尿囊素的含量。
[0119]
1.6蜗牛粘液冻干品中乙醇酸的含量测定
[0120]
采用离子色谱法对蜗牛粘液冻干品中乙醇酸进行含量测定。称取100mg蜗牛粘液冻干品，加入40ml去离子水超声浴中溶解30min，溶液定容至50.0ml，溶液离心(3000g
×
15min)，取上清液，即得供试品溶液。供试品及标准品采用ics-1100离子色谱仪(thermo dionex,usa)进行分析测定。
[0121]
1.7实验结果
[0122]
实验结果如图1和图2所示，并请一同参阅表1。
[0123]
发明人观察到，蜗牛的腹足部分泌粘液，将自身粘附于其他物体(树枝、树叶等)表面，是一种可逆的粘附方式，这个现象明显不同于贻贝足丝粘附于海底岩石、船舶和鲨鱼等物表面。
[0124]
新鲜的白玉蜗牛粘液呈半透明凝胶状，光亮蜗牛粘液呈乳白色凝胶状，都具有很好的弹性与延展性；其冻干品呈多孔海绵状，在湿润的皮肤表面与界面水混合可形成黏性胶状物，并具有很强的粘附性。
[0125]
按照本技术制备蜗牛粘液及其冻干品的方法，平均每10只蜗牛可取新鲜粘液约20g；以蜗牛粘液冻干后干基计算，白玉蜗牛粘液的固含量为3.2％，光亮蜗牛粘液的固含量为5.3％。
[0126]
以干基计，白玉蜗牛和光亮大蜗牛的粘液冻品中，酸性多糖含量分别为15.91
±
0.23％和9.26
±
0.17％。
[0127]
以干基计，白玉蜗牛和光亮大蜗牛的粘液冻品中，蜗牛粘液多肽含量分别为33.27
±
1.78％和35.71
±
1.45％；电泳结果显示，白玉蜗牛粘液多肽的分子量在45kda、60～100kda、》100kda这三个区域有分布；光亮蜗牛粘液多肽在15～35kda、45kda、60kda、75kda、》100kda范围有分布。
[0128]
氨基酸组成分析结果显示，蜗牛粘液多肽由天冬氨酸(asp)、苏氨酸(thr)、丝氨酸(ser)、谷氨酸(glu)、甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、胱氨酸((cys)2)、缬氨酸(val)、甲硫氨酸(met)、异亮氨酸(ile)、亮氨酸(leu)、酪氨酸(tyr)、苯丙氨酸(phe)、组氨酸(his)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、脯氨酸(pro)等数十种氨基酸组成(表1)，其中，两种蜗牛粘液多肽的芳香类氨基酸占比分别为10.38％和10.65％，碱性氨基酸占比分别为16.98％和15.29％，非极性氨基酸占比分别为38.34％和36.80％。
[0129]
表1.蜗牛粘液多肽氨基酸含量(mg/g)
[0130][0131]
以干基计，白玉蜗牛和光亮大蜗牛的粘液冻干品中，尿囊素的含量分别为2.74
±
0.07％和1.03
±
0.04％，乙醇酸的含量分别为7.13
±
0.41mg/g和0.98
±
0.18mg/g。
[0132]
实施例2
[0133]
蜗牛粘液冻干品中酸性多糖的化学结构分析
[0134]
2.1试剂：
[0135]
d-2-乙酰氨基-葡萄糖(d-glcnac)为alfa aesar产品；l-艾杜糖醛酸(l-idoa)，英国carbosynth产品；葡萄糖(glc)为中国药检产品；3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(pmp)，为阿拉丁产品；右旋糖酐标准品d1(2500da)、d2(4600da)、d3(7100da)、d4(10000da)、d5(21400da)、d6(41100da)、d7(84400da)、d8(133800da)和d2000(2000000da)中国药品生物制品鉴定所；3000da透析袋，美国spectrum laboratories；碱性蛋白酶、苄索氯铵、乙酸钾、硝酸银、三氟乙酸、nacl、naoh等试剂均为市售分析纯试剂。
[0136]
2.2蜗牛粘液冻干品中酸性多糖的提取纯化
[0137]
称取20g实施例1的蜗牛粘液冻干品和400mg碱性蛋白酶置于烧瓶中，加入200ml水，2m naoh调节ph 9，60℃水浴连续搅拌条件下，酶解反应提取36h，冷却至室温，4℃静置过夜，离心(4000rpm
×
15min)得上清。上清中加入11.6g乙酸钾和95％乙醇至终浓度75％，离心(4000rpm
×
15min)，得沉淀。沉淀水复溶后，搅拌下滴加4％苄索氯铵溶液至无白色沉淀生成为止，离心(4000rpm
×
15min)，得沉淀。沉淀去离子水反复洗涤3次后，加入等体积的饱和食盐水搅拌后，加无水乙醇至终浓度80％(v/v)，离心(4000rpm
×
15min)得沉淀，该盐交换步骤重复操作3次。将沉淀用适量水溶解，3000da透析袋对水透析，用0.1m硝酸银检测至透析水中无cl-为止，浓缩冻干，得到蜗牛粘液酸性多糖。
[0138]
2.3蜗牛粘液冻干品中酸性多糖的结构解析
[0139]
(1)单糖组成分析：按照本领域技术人员熟悉的柱前pmp衍生化法进行单糖组成分析，酸性多糖先用三氟乙酸完全水解后，在碱性条件下与pmp反应，萃取后，经高效液相色谱仪c18柱分析，色谱条件为zorbax sb-c18(4.6mm
×
150mm
×
5μm)色谱柱，流动相为0.1m乙酸铵(ph5.5)缓冲液-乙腈(83:17)，柱温25℃，流速1ml/min。
[0140]
(2)-oso
3-/-coo-摩尔比分析：采用电导率滴定法分析蜗牛酸性多糖中所含硫酸酯基与羧酸基的摩尔比，并计算硫酸酯基(-oso
3-)占酸性多糖中的含量。称取样品各5mg，分别溶于1ml去离子水，配成5mg/ml水溶液。经dowex 50w
×
8 50-100h强酸型阳离子交换树脂交换为氢型，流速3s/d，收集40ml洗脱液。0.02m naoh滴定液滴定，每次50μl，记录滴定体积和电导率数值。根据naoh的消耗体积计算-oso
3-/-coo-摩尔比和-oso
3-的质量分数。
[0141]
(3)分子量及其分布测定：取约10mg样品加流动相配制为10mg/ml的溶液，过0.22μm微孔滤膜，滤过液液相分析；称取已知分子量的右旋糖酐对照品，配制成10mg/ml的溶液；数据采用gpc软件处理，绘制标准曲线，应用此曲线对蜗牛粘液酸性多糖进行分子量标定。色谱分析条件如下：
[0142]
色谱仪：agilent technologies 1260series高效液相色谱仪
[0143]
色谱柱：shodex sb-804hq(8.0
×
300mm)
[0144]
进样量：10μl
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
柱温：40℃
[0145]
流动相：0.1m nacl
ꢀꢀꢀꢀ
流速：0.5ml/min
[0146]
检测器：示差折光检测器(rid)和二极管阵列检测器(dad)
[0147]
(3)核磁共振波谱法：取样品约10mg，经3次d2o交换，d2o溶解至20mg/ml，800mhz核磁仪检测1d 1
h、
13
c nmr和2d 1
h-1
h(cosy,tocsy,roesy)和1h-13
c(hsqc,hmbc,hsqc-tocsy)。
[0148]
2.4实验结果
[0149]
实验结果见图3、表2和表3。
[0150]
单糖组成分析结果表明，白玉蜗牛黏液酸性多糖由d-2-氨基-2-脱氧-葡萄糖(d-glcn,glcn)和l-艾杜糖醛酸基(l-idoa,idoa)组成，光亮大蜗牛酸性多糖由n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)、d-葡萄糖醛酸(glca)和艾杜糖醛酸(idoa)等组成。
[0151]
白玉蜗牛粘液中的酸性多糖的重均分子量(mw)和数均分子量(mn)分别为696.7kda和540.7kda，多分散系数(pdi)为1.29；光亮大蜗牛粘液中的酸性多糖的mw和mn分别为900.0kda和725.8kda多分散系数(pdi)为1.24。
[0152]
白玉蜗牛和光亮大蜗牛粘液中，酸性多糖的硫酸羧酸摩尔比分别为1:1.02和1:1.25；以硫酸酯基(-oso
3-)占酸性多糖的质量分数计，分别为15.4％和13.6％。
[0153]
表2.蜗牛粘液酸性多糖的理化性质
[0154][0155]
如图3所示，1h、
13
c和2d nnr谱图解析表明，两种蜗牛黏液的酸性多糖为d-glcn与l-idoa和/或α-d-glca以α(1
→
4)糖苷键交替连接而成。
[0156]
以白玉蜗牛粘液酸性多糖为例，可对多糖的glcnac和idoa 的h和c进行nmr谱图的
完全归属，结果见表3。
[0157]
表3.白玉蜗牛粘液中酸性多糖的h和c的化学位移表
[0158][0159]
实施例3
[0160]
蜗牛粘液冻干品的扫描电镜观察
[0161]
将蜗牛粘液水凝胶置于样品槽中，将样品槽放入液氮中冷冻10min，随后取出样品槽置于冷冻真空室中(-90℃)升华10min，样品表面镀铂后进行电镜扫描。选取800
×
，1200
×
，1600
×
三个放大倍数，随机寻找平整区域进行图像记录。
[0162]
结果如图1g和1h所示，白玉蜗牛粘液冻干品内部呈类蜂窝或海绵状三维空间结构，光亮大蜗牛粘液冻干品与其类似，但孔径大小略有不同。
[0163]
实施例4
[0164]
蜗牛粘液冻干品水凝胶的流变学性能测试
[0165]
采用mcr302型流变仪(德国)进行流变学测试。
[0166]
取0.5g蜗牛粘液水凝胶，将其均匀的铺在测试平台上，振幅范围设定为5％，频率范围为0.1～10hz，测试台恒温25℃进行测试。
[0167]
两种蜗牛新鲜粘液及粘液冻干品水化凝胶在不同固含量时的储能模量(g
′
)与损耗模量(g
″
)的结果见图1j和1k以及表4。两种新鲜的蜗牛粘液的模量数值表明二者均为弹性较好的凝胶状物质；蜗牛粘液冻干品水化后，均有着类似并强于新鲜粘液的粘弹性。随着固含量的增加，凝胶化的蜗牛粘液冻干品的储能模量随之增加数倍，与人体多种器官组织的弹性模量范围较匹配。
[0168]
表4.新鲜蜗牛黏液及其冻干品水化后凝胶的储能模量和损耗模量
[0169][0170]
备注：表中为频率在0.631hz时的数据。
[0171]
实施例5
[0172]
蜗牛粘液冻干粉的体外黏附性能测试
[0173]
5.1实验材料
[0174]
蜗牛粘液冻干粉：由实施例1制备。
[0175]
大鼠全血和新鲜离体内脏采集自其他实施例中即将安乐死的sd大鼠；猪源纤维蛋白粘合剂(简称纤维蛋白胶)，医用级，广州倍绣生物技术有限公司；新鲜猪皮，使用时裁剪为1.0cm
×
7.0cm的长方形；猪肠衣，使用时裁剪为1.0
×
3.0cm和1.0
×
1.0cm的形状，并黏附于塑料胶带或玻璃片上。
[0176]
5.2组织黏附测试
[0177]
新鲜粘液组：取大约200mg新鲜粘液，置于新鲜离体的大鼠内脏组织上，以镊子拉取，观察粘液黏附性能。
[0178]
粘液冻干粉组：取5mg粘液冻干品，置于新鲜离体的大鼠内脏组织上，以镊子拉取，观察粘液黏附性能。
[0179]
实验结果见图4a，新鲜粘液具有一定的黏附能力，粘液冻干品具有较强的黏附能力，用镊子夹取粘液一角可以将离体组织提起。此结果表明，新鲜蜗牛粘液经冻干后，其冻干品的粘附各类组织的能力显著提升。
[0180]
5.3剪切黏附强度测试
[0181]
粘液冻干粉组：称取5mg蜗牛粘液冻干粉，将冻干粉均匀铺在肠衣1.0cm
×
1.0cm方形区域内，滴加10μl去离子水或新鲜全血，将两片肠衣如附图所示方法重叠，固定1min。
[0182]
纤维蛋白胶组：在肠衣1.0cm
×
1.0cm方形区域内滴加20μl纤维蛋白胶并涂匀，固定1min。
[0183]
将各组的肠衣两端固定于万能拉力机的夹具上，以0.5mm/s的速度进行剪切测试，记录最大拉力值与时间-应力曲线。
[0184]
实验结果见图4b，新鲜的白玉蜗牛粘液与光亮蜗牛粘液的组织粘附强度分别为4.62
±
0.56kpa和10.30
±
0.78kpa；两种冻干品的组织粘附强度分别为23.64
±
2.00kpa和35.67
±
2.09kpa，接近或优于纤维蛋白胶(20.79
±
0.51kpa)；而两种粘液组有血液覆盖的组织表面所产生的黏附强度分别为33.85
±
3.09kpa和40.5
±
3.86kpa，均显著优于纤维蛋白胶的黏附强度(p《0.01)。
[0185]
5.4抗拉伸黏附强度测试
[0186]
粘液冻干粉组：称取5mg蜗牛粘液冻干粉，均匀铺在肠衣1.0cm
×
1.0cm方形区域内，滴加10μl去离子水或全血，将两片肠衣如附图所示重叠，固定1min。
[0187]
纤维蛋白胶组：在肠衣1.0cm
×
1.0cm方形区域内，滴加20μl纤维蛋白胶，涂匀，固定1min。
[0188]
固定完成后，将各组的肠衣两端固定于万能拉力机的夹具上，以0.1mm/s的速度进行拉伸测试，记录最大拉力值与时间-应力曲线。
[0189]
实验结果见附图4c，新鲜的白玉蜗牛粘液与光亮蜗牛粘液的组织粘附强度分别为2.86
±
0.13kpa和2.20
±
0.39kpa；两种冻干品的组织粘附强度分别为51.38
±
3.18kpa和82.59
±
7.39kpa，均显著优于纤维蛋白胶(0.57
±
0.10kpa)(p《0.001)；而两种粘液组有血液覆盖的组织表面所产生的粘附强度分别为60.51
±
2.18kpa和52.31
±
4.62kpa，均显著优
于纤维蛋白胶组(p《0.001)。
[0190]
5.5剥离测试
[0191]
粘液冻干粉组：称取20mg蜗牛粘液冻干粉，均匀铺在猪皮1.0cm
×
3.0cm长方形区域内，滴加40μl去离子水或全血，将两片猪皮如附图所示重叠，固定1min。
[0192]
纤维蛋白胶组：在猪皮1.0cm
×
3.0cm滴加80μl纤维蛋白胶，涂匀，固定1min。
[0193]
固定完成后，将各组的猪皮两游离端固定于万能拉力机的夹具上，以0.5mm/s的速度进行180
°
剥离测试，记录时间-应力曲线。
[0194]
实验结果见图4d，新鲜的白玉蜗牛与光亮大蜗牛粘液的界面粘附能分别为7.37
±
0.58j/m2和7.07
±
0.62j/m2；两种冻干品的界面粘附能分别为24.27
±
1.37j/m2和33.70
±
4.46j/m2，均显著优于纤维蛋白胶(6.77
±
0.67j/m2)(p《0.001，p《0.01)；两种冻干品组有血液覆盖的组织表面所产生的界面粘附能分别为30.13
±
7.74j/m2和16.87
±
4.52j/m2，优于纤维蛋白胶(p《0.05)。
[0195]
综上，本技术实施例的生物材料以冻干品形式对猪肠衣或猪皮的黏附为例，在有无水或血浆或血液存在下，分别测试搭接剪切、拉伸粘附及180
°
剥离等力学参数。结果表明，该材料与包括皮肤、肌肉、内脏等在内的生物组织可强效黏附，且在水和血液等存在下不影响此黏附力。上述粘附力学测试的各项指标，本技术实施例的生物材料均显著优于临床上使用的猪源纤维蛋白胶。
[0196]
实施例6
[0197]
蜗牛粘液冻干品的止血功效评价
[0198]
6.1材料与仪器
[0199]
sd大鼠，雄性，180-220g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：2019-0004；新鲜全血(含柠檬酸钠抗凝剂)，采自健康的sd大鼠。
[0200]
0.2mol/l cacl2溶液、磷酸缓冲液(pbs)、3％戊二醛溶液、无菌纱布、圆形滤纸和手术器械等均为市售分析纯或医用级。
[0201]
酶标仪(flex station 3)，美国thermo scientific公司；扫描电镜(sigma 300)德国蔡司公司；小动物麻醉机(vor76x-6)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
[0202]
6.2体外止血实验
[0203]
(1)凝血指数测定
[0204]
实验分组：
[0205]
阳性对照：医用纱布；
[0206]
阴性对照：空白处理；
[0207]
实验组：白玉蜗牛粘液冻干品组和光亮蜗牛粘液冻干品组。
[0208]
实验方法：称量44.4mg cacl2固体，溶于2.0ml水中，得0.2m cacl2溶液；0.2m cacl2溶液50μl加入1.0ml大鼠全血中，混匀，制得复钙全血溶液。
[0209]
取复钙全血溶液10μl，加到供试品或对照品中，37℃分别孵育60、90、120和150s，对应时间点下，缓慢加入1.0ml去离子水，洗出游离红细胞，将该溶液离心(116g
×
10min)，得上清液，于540nm处测量吸光度值as。
[0210]
取复钙全血溶液10μl，加到1.0ml去离子水中，离心(116g
×
10min)得上清液，测其吸光度值作为参考值ar。
[0211]
血凝指数(blood clotting index，bci)按下式计算：bci(％)＝as/ar
×
100％
[0212]
(2)血细胞粘附状态观测
[0213]
实验分组：
[0214]
阳性对照：医用纱布；
[0215]
阴性对照：空白处理；
[0216]
实验组：白玉蜗牛粘液冻干品组和光亮大蜗牛粘液冻干品组。
[0217]
实验方法：取大鼠全血2.5ml，离心(116g
×
10min)，得上清，即为富血小板血浆。取直径为8mm和厚为2mm的蜗牛粘液冻干品各2块，置于培养皿中备用。取8mm长宽的方形纱布4层厚度，置于培养皿中备用。
[0218]
取全血10μl，滴加于各组材料上，37℃下孵育5min。取富血小板血浆10μl，滴加于各组材料上，37℃下孵育1.0h。孵育结束后，加入5mlpbs洗去游离的血细胞，洗涤三次；加入5.0ml 3％的戊二醛溶液固定4.0h，50％、70％、90％和100％梯度乙醇各浸泡10min逐步脱水后，冷冻干燥。冻干样品进行喷金后，在电镜下拍照记录，观察各组血细胞粘附的状态。
[0219]
(3)实验结果
[0220]
体外凝血实验结果如附图5a、5b和5c所示，两种蜗牛粘液冻干品均能显著加快血液凝固的速度，优于纱布组和空白组。扫描电镜观察显示，红细胞大量粘附聚集在蜗牛粘液冻干品表面，纱布纤维中仅有少量红细胞聚集，但未观察到牢固的粘附状态。
[0221]
6.3大鼠肝脏止血实验
[0222]
(1)实验动物
[0223]
动物实验的全部过程严格遵守国务院颁布的《实验动物管理条例(2017修订)》的规定。spf级成年雄性sd大鼠20只，180～220g。大鼠饲养于恒温条件下，每12h光暗循环，自由饮水、采食，每天更换垫料。大鼠在实验室条件下为期7天的适应性喂养后，称重标记。
[0224]
(2)实验分组及方法
[0225]
适应性喂养后的大鼠，按照体重大小均衡随机分为4组，每组5只。
[0226]
阴性对照：空白处理；
[0227]
阳性对照：纱布处理；
[0228]
实验组：白玉蜗牛粘液冻干品组和光亮蜗牛粘液冻干品组。
[0229]
实验方法：大鼠异氟烷吸入麻醉，去除腹部毛发，开上腹腔暴露肝脏左叶，用棉签小心擦干肝脏周围的组织液，将圆形滤纸置于肝脏下方，剪去肝脏下缘2cm长的组织造成出血，各组给予相应处理，2min后取下各组滤纸进行称重，并拍照记录滤纸上血液面积。
[0230]
(3)实验结果
[0231]
大鼠肝脏止血实验结果如附图5d、5e、5f所示，阴性对照组出血量为238.2
±
24.90mg，白玉蜗牛与光亮大蜗牛粘液冻干品组的出血量分别为113.0
±
17.16mg和114.2
±
9.60mg，显著低于阴性对照组；而纱布处理的出血量为213.0
±
46.06mg，略优于阴性组。
[0232]
综合分析：大鼠肝脏出血模型实验结果表明，与医用止血纱布比，本技术的冻干粉能显著降低大鼠的肝脏出血量和缩短出血时间，亦能封闭肝脏创面而强效止血。因此，本技术的生物材料具有良好的粘合伤口及止血功能。
[0233]
实施例7
[0234]
蜗牛粘液冻干品作为粘合剂用于皮肤切口的粘合及修复
[0235]
7.1仪器
[0236]
快速组织病理形态切片染色系统(包括石蜡包埋机、切片机和烤片机等)，美国thermo scientific公司；小动物麻醉机(vor76x-6)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
[0237]
7.2试剂与对照
[0238]
主要试剂：苏木素-伊红染色液、masson三色染色液、中性树胶和防脱载玻片等，美国auragene公司；异氟烷、碘伏、水合氯醛、二甲苯、无水乙醇等试剂为市售，生物级或医用级试剂。
[0239]
阳性对照：可吸收缝合线，上海浦东金环医疗用品股份有限公司；医用504胶(主要成分：α-氰基丙烯酸正丁酯)，北京康派特医疗器械有限公司；猪源纤维蛋白粘合剂(简称纤维蛋白胶)，医用级，广东倍绣生物技术有限公司。
[0240]
实验组：白玉蜗牛粘液冻干品。
[0241]
7.3动物实验
[0242]
(1)动物状况
[0243]
动物实验的全部过程严格遵守国务院颁布的《实验动物管理条例(2017修订)》的规定。spf级成年雄性sd大鼠45只，200～220g。大鼠饲养于恒温条件下，每12h光暗循环，自由饮水、采食，并每天更换垫料。大鼠进入实验室经为期7天的适应性喂养后，称重标记。
[0244]
(2)实验分组
[0245]
适应性喂养后的大鼠，按照体重大小均衡随机分为5组，每组9只。
[0246]
阴性对照组：生理盐水组，每个伤口50μl；
[0247]
阳性对照组：可吸收缝合线，每个伤口缝合3～4针，单次给药；医用504组：每个伤口给药30μl，给药后伤口固定10s；
[0248]
纤维蛋白胶组：每个伤口给药200μl，给药后伤口固定1min；
[0249]
实验组：白玉蜗牛粘液冻干品(d-smg)，每个伤口15mg，给药后伤口固定1min。
[0250]
(3)动物皮肤切口造模
[0251]
大鼠异氟烷吸入麻醉，背部毛发剔除，在距大鼠耳朵后缘3.5cm处剪开2cm长的直线性切口，碘伏消毒，进粘合剂闭合处理后，拍照记录。大鼠术后单笼饲养，自由饮水和取食。
[0252]
(4)数据记录
[0253]
①
自皮肤切口模型建立之日起，每天观察1次，记录动物行为和生理状况；
[0254]
②
术后第0、1、3、5、7天，观察并记录大鼠伤口愈合及周围炎症情况，利用image j软件计算测定未愈合的切口长度，计算切口愈合率：
[0255]
愈合率(％)＝(初始切口长度-治疗n天切口长度)/初始切口面积
×
100％
[0256]
③
术后第5、7天，各组随机挑选3只大鼠麻醉，取伤口肉芽组织标本经4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，并经h&e染色，在光镜下观察表皮和真皮的再生、肉芽组织厚度、新生血管形成和炎症浸润情况。
[0257]
(5)统计分析
[0258]
用spss17.0软件对统计数据进行单因素方差分析，数据以平均值
±
标准误(x
±
s)表示，以p《0.05为差异有统计学意义。
[0259]
7.4实验结果
[0260]
动物行为变化：正常健康大鼠皮肤切口模型建立之日起，每日观察，未发现皮肤切口模型大鼠有明显的行为学(活动频次和行为状态等)和生理学(体重以及饮水饮食、排泄物等指标)指标异常。
[0261]
切口周围炎症及切口愈合情况：图6a展示了各组皮肤切口愈合情况。术后第3天，各组皮肤切口都未见明显的化脓感染。术后第7天，蜗牛粘液冻干品组皮肤切口几乎完全愈合，未见结疤及粘液残留；生理盐水组可见明显的结疤，皮肤尚未完全闭合；可吸收缝合线组皮肤切口几乎愈合，但缝合线未完全降解；医用纤维蛋白胶组未完全愈合，有结疤；医用504胶组，切口粘合效果较好，但粘合剂未降解，阻碍皮肤切口正常愈合生长。
[0262]
愈合率统计结果如附图6d所示，术后第5天，蜗牛粘液冻干品组切口愈合率较生理盐水组、纤维蛋白胶组、医用504胶组具有显著性差异；术后第7天，蜗牛粘液冻干品组切口愈合率较生理盐水组、纤维蛋白胶组、医用504胶组、医用纤维蛋白胶组均具有显著性差异。
[0263]
h&e染色分析结果：如图6b所示，术后第7天，蜗牛粘液冻干品组皮肤切口处表皮真皮已再生，清晰可见如皮脂腺、毛囊、毛孔等皮肤器官组织已新生完整；生理盐水组仍未见显著肉芽组织，表皮尚未再生完全；纤维蛋白胶组表皮再生完全，肉芽组织可见；缝合线组表皮再生良好，未见明显炎症；医用504胶组的皮肤切口处可见明显的粘合剂残留，组织再生受阻。
[0264]
综合分析：蜗牛粘液冻干品应用于粘合皮肤切口时，具有促进皮肤切口处组织再生的作用，整体效果显著优于临床常用的纤维蛋白胶以及504胶等医用粘合剂。
[0265]
实施例8
[0266]
蜗牛粘液冻干品促进急性皮肤创面愈合及修复的效果评价
[0267]
8.1仪器
[0268]
快速组织病理形态切片染色系统(包括石蜡包埋机、切片机和烤片机等)，美国thermo scientific公司；小动物麻醉机(vor76x-6)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
[0269]
8.2试剂
[0270]
苏木素-伊红染色液(h&e)、masson三色染色液、中性树胶和防脱载玻片等，美国auragene公司；异氟烷、碘伏、水合氯醛、二甲苯、无水乙醇等试剂为市售生物级或医用级试剂。
[0271]
8.3动物实验
[0272]
(1)动物状况
[0273]
动物实验的全部过程严格遵守国务院颁布的《实验动物管理条例(2017修订)》的规定。spf级成年雄性sd大鼠12只，重约200～220g。大鼠饲养于恒温条件下，每12h光暗循环，自由饮水、采食，并每天更换垫料。大鼠进入实验室经为期7天的适应性喂养后，称重标记。
[0274]
(2)实验分组
[0275]
正常健康大鼠，按照体重大小均衡随机分为2组，每组6只。
[0276]
空白对照：生理盐水组，每孔50μl，单次给药。
[0277]
实验组：蜗牛粘液冻干品，每孔5mg，单次给药。
[0278]
(3)皮肤损伤造模
[0279]
大鼠异氟烷吸入麻醉，背部毛发剔除，距大鼠耳朵后缘3.5cm处，打造两个对称的
直径为10mm的圆形创口，碘伏消毒，用手术缝合线将硅胶垫圈(直径1.5mm)缝合在伤口处固定伤口，创面部位给药处理后，拍照记录。大鼠术后单笼饲养，自由饮水和取食。
[0280]
(4)数据记录
[0281]
①
自急性皮肤损伤动物模型建立之日起，每天观察动物的行为和常规生理指标；
[0282]
②
术后第0、2、5、8、11天，观察并记录大鼠伤口愈合及周围炎症情况，利用image j软件计算测定溃疡创面面积以分析创面愈合率：
[0283]
愈合率(％)＝(初始伤口面积-治疗n天伤口面积)/初始伤口面积
×
100％
[0284]
③
术后第5和15天，各组随机挑选3只大鼠麻醉，取伤口肉芽组织标本经4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，经h&e染色后，在光镜下观察表皮和真皮的再生、肉芽组织厚度、新生血管形成以及炎症细胞浸润。
[0285]
(5)统计分析
[0286]
用spss 17.0软件对统计数据进行单因素方差分析，数据以平均值
±
标准误(x
±
s)表示，以p《0.05为差异有统计学意义。
[0287]
8.4实验结果
[0288]
动物行为变化：自正常健康大鼠全皮层损伤模型建立之日起，每日观察，未见大鼠有明显的行为学(活动频次和行为状态等)和生理学(体重以及饮水饮食、排泄物等指标)指标异常。
[0289]
创面周围炎症情况及创面愈合率：如附图7a所示，给药处理第5天后，蜗牛粘液冻干品组的创面明显减小；创面愈合率统计结果如附图7b所示，蜗牛粘液冻干品处理组在第2、5、8天时创面愈合率，均显著优于生理盐水处理组(相应的p《0.001、0.01、0.05)；
[0290]
组织染色分析：如附图7c、7d、7e和7f所示，表皮组织学结果与创面愈合的照片中观察到的伤口收缩一致。术后第5天，蜗牛粘液冻干品组表皮再生明显，肉芽组织中可见丰富的新生血管，无明显水肿，生理盐水组表皮再生缓慢，皮下有明显的水肿；肉芽组织厚度与胶原沉积率均高于生理盐水组；术后第15天两组创口皮肤组织均愈合完全，皮肤器官再生明显；肉芽组织厚度与胶原沉积率均显著大于生理盐水组(相应的p《0.01、0.001)；
[0291]
综合分析：正常大鼠急性全皮层创面模型实验结果显示，蜗牛粘液冻干品能显著闭合创面，在第2、5、8天时创面愈合率均显著优于生理盐水处理组。术后第5天的组织病理染色分析显示，表皮组织学结果与创面愈合的照片中观察到的伤口收缩一致，蜗牛粘液冻干品组表皮再生明显，肉芽组织中可见丰富的新生血管，无明显水肿；生理盐水组表皮再生缓慢，皮下有明显的水肿。因此，蜗牛粘液冻干品应用于正常大鼠急性全皮层创伤时，具有明显的促进创面愈合的作用，可以缓解水肿，减轻炎症，促进表皮再生和血管新生等作用。
[0292]
实施例9
[0293]
蜗牛粘液冻干品在促进糖尿病慢性伤口愈合的效果评价
[0294]
9.1仪器
[0295]
快速组织病理形态切片染色系统(包括石蜡包埋机、切片机和烤片机等)，美国thermo scientific公司；小动物麻醉机(vor76x-6)，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
[0296]
9.2试剂与对照
[0297]
主要试剂：链脲佐菌素(stz)，sigma公司；苏木素-伊红染色液(h&e)、masson三色染色液、中性树胶和防脱载玻片等，auragene公司；异氟烷、碘伏、水合氯醛、二甲苯、无水乙
醇等试剂为市售生物级或医用级试剂。
[0298]
阴性对照：生理盐水
[0299]
阳性对照：藻酸盐敷料(3m
tm tegaderm
tm alginate dressing，minnesota mining and manufacturing company，简称3m公司，美国)。
[0300]
实验组：本技术实施例1.2所述蜗牛粘液冻干品；本技术实施例1.4.1所述蜗牛粘液酸性多糖(gag)。
[0301]
9.3动物实验
[0302]
(1)动物状况
[0303]
动物实验的全部过程严格遵守国务院颁布的《实验动物管理条例(2017修订)》的规定。选用spf级成年雄性sd大鼠60只，重约300～330g。大鼠饲养于恒温条件下，每12h光暗循环，自由饮水、采食，并每天更换垫料。在实验开始之前，所有大鼠进入研究室条件下经过为期7天的适应性喂养后，称重标记。
[0304]
(2)糖尿病大鼠造模
[0305]
所有实验动物空腹采血测试血糖并记录体重，按50mg/kg的剂量计算每只实验大鼠所需stz(浓度为10mg/ml)剂量并进行腹腔注射。注射完成5～7天后，所有造模大鼠经尾静脉采血并用血糖仪检测血糖。若随机血糖≥16.7mmol/l，则视为糖尿病模型造模成功。
[0306]
(3)实验分组及方法
[0307]
造模成功的糖尿病大鼠，按照体重大小均衡随机分为4组，每组15只。
[0308]
空白对照：生理盐水组，每孔50μl；阳性对照：藻酸盐敷料，每孔8mm直径大小；受试药物组：蜗牛粘液多糖，每孔0.9mg，连续5天给药；蜗牛粘液冻干品，每孔5mg，单次给药。
[0309]
(4)糖尿病溃疡造模
[0310]
糖尿病大鼠异氟烷吸入麻醉，背部毛发剔除，距大鼠耳朵后缘3.5cm处，打造两个对称的直径为10mm的圆形创口，碘伏消毒，用手术缝合线将硅胶垫圈(直径1.5mm)缝合固定伤口，创口给药后，拍照记录。大鼠术后单笼饲养，自由饮水和取食。
[0311]
(5)数据记录
[0312]
①
自糖尿病溃疡模型建立之日起，每天观察1次，观察动物的行为相比正常动物是否有异常；
[0313]
②
给药后第0、3、7、10、14、21天观察并记录大鼠伤口愈合及周围炎症情况，利用image j软件计算测定溃疡创面面积以分析创面愈合率：
[0314]
愈合率(％)＝(初始伤口面积-治疗n天伤口面积)/初始伤口面积
×
100％
[0315]
③
治疗后第3、7、10和14天，各组随机挑选3只大鼠麻醉，取伤口肉芽组织标本经4％多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，h&e染色，然后在光镜下观察表皮和真皮的再生、肉芽组织厚度、新生血管形成、成纤维细胞浸润情况。
[0316]
(6)统计分析
[0317]
创面愈合率、表皮再生率、肉芽组织厚度、胶原沉积区域占比等：数据以均数
±
标准误(x
±
s)表示，用spss17.0软件对统计数据进行单因素方差分析，以p《0.05为差异有统计学意义。
[0318]
9.4实验结果
[0319]
动物行为变化：自糖尿病溃疡模型建立之日起，每日观察，未见糖尿病大鼠有明显
行为学(活动频次和行为状态等)和生理学(体重以及饮水饮食、排泄物等指标)指标异常。
[0320]
创面周围炎症情况及创面愈合率：如附图8a、8b和8c所示，术后第7天，蜗牛粘液冻干品组创面上水化的水凝胶已肉眼不可见，藻酸盐敷料组有明显的水凝胶残留。蜗牛粘液冻干品组在第7、10天时创面愈合率均显著优于生理盐水组；藻酸盐组术后第7天时愈合率优于生理盐水组，但无统计学差异。术后第14天，蜗牛粘液冻干品组创面可见明显的新生毛发，瘢痕组织几乎不可见；藻酸盐组与生理盐水组愈合较慢，很少观察到毛发再生。上述结果说明，蜗牛粘液冻干品具有显著的促进糖尿病创面愈合的药效，且效果优于市售的糖尿病足溃疡的藻酸盐敷料。
[0321]
组织染色分析：如附图8d、8e、8f和8g所示，表皮组织学结果与在糖尿病伤口的光学图像中观察到的伤口收缩一致。蜗牛粘液冻干品组持续促进再上皮化，肉芽组织增厚，血管生成并导致伤口早期愈合，整体上显著优于生理盐水组和藻酸盐敷料组。术后第3、7和14天的肉芽组织厚度统计结果显示，术后第3天，蜗牛粘液冻干胶组与蜗牛粘液酸性多糖组的肉芽组织厚度显著大于生理盐水组与藻酸盐敷料组；术后第7天，蜗牛粘液酸性多糖组显著大于藻酸盐组；术后第14天，蜗牛粘液冻干品组与蜗牛粘液酸性多糖组的肉芽组织厚度均显著大于生理盐水组。
[0322]
综合分析：蜗牛粘液冻干品应用于糖尿病大鼠皮肤创面时，其在组织上水化成凝胶，封闭伤口创面，术后第7天，已肉眼不可见，而藻酸盐敷料组因其不可降解而有大块水凝胶残留。创面愈合率统计结果显示，蜗牛粘液冻干品组在第7和10天均极显著优于对照生理盐水组和藻酸盐组。术后第14天，蜗牛粘液冻干品组创面部位未见任何瘢痕，可见明显的新生毛发，而藻酸盐组与生理盐水组仍未完全愈合，未观察到明显毛发再生。苏木素-伊红染色(h&e染色)和马松染色结果显示，与生理盐水组和藻酸盐敷料组相比，蜗牛粘液冻干品组可以持续促进伤口部位再上皮化，肉芽组织增厚，胶原蛋白沉积，血管生成，而加速伤口早期愈合。上述结果表明，蜗牛粘液冻干品能显著加快表皮和真皮的再生以及胶原蛋白沉积，从而促进糖尿病创面的愈合以及毛囊和皮脂腺等皮肤器官的重建和再生，且效果显著优于市售的糖尿病足溃疡的藻酸盐敷料。本技术所述的蜗牛粘液冻干品可显著促进糖尿病大鼠创面伤口的愈合，其再上皮化、肉芽组织增厚和血管新生等愈合生理指标均显著优于藻酸盐敷料组。
[0323]
实施例10
[0324]
蜗牛粘液冻干品的生物相容性测试
[0325]
10.1细胞活力实验
[0326]
(1)实验方法
[0327]
称取1.6mg蜗牛粘液冻干品，溶于4.0ml完全培养基中并用0.22μm滤膜过滤即得400μg/ml浓度的蜗牛粘液培养基；l929细胞以每孔2000个的密度接种于96孔板中，常规条件孵育24h后将原培养基更换为蜗牛粘液冻干品培养基，分别在培养24h、48h、72h后弃掉原培养基，加入含mtt的培养基，37℃孵育4h，吸掉培养基后加入100μl dmso，低速摇床震荡10min后，在570nm处测试各孔吸光度值。
[0328]
(2)实验结果
[0329]
培养24h后，实验组细胞存活情况与空白组无明显差别；培养48h时，实验组细胞密度明显高于空白组；72h时由于细胞生长进入平台期，两组无明显差异。细胞统计显示，蜗牛
粘液冻干品存在下，活细胞数均大于80％，说明蜗牛粘液冻干品无细胞毒性。
[0330]
综合分析：以蜗牛粘液冻干粉混于细胞培养基后进行细胞培养实验观察，在不同浓度和不同时间点下的细胞存活率均不低于80％，说明蜗牛粘液冻干粉无细胞毒性。
[0331]
10.2体内降解实验
[0332]
(1)实验方法
[0333]
将蜗牛粘液冻干品进行活体皮下包埋实验，评价其生物降解性。
[0334]
200～220g的雄性sd大鼠随机分为两组，各组动物不少于5只。
[0335]
大鼠经异氟烷麻醉，在耳后3.5cm处剪一2.0cm长的皮肤切口，将100mg蜗牛粘液冻干品置入皮下后，用缝合线缝合伤口。生理盐水作为手术对照组，同法处理。术后第3、7、14和21天，分别对各组动物包埋位置拍照记录，并随机选取动物，取皮下包埋组织块进行病理学组织切片h&e染色实验，观察粘液冻干品降解情况和周围组织炎症情况。
[0336]
(2)实验结果
[0337]
实验结果见附图9。蜗牛粘液冻干品组皮下包埋第7天后，尚未完全降解，第14天时包埋处无隆起，21天后包埋处已愈合完全，皮肤表面已完全修复且无疤痕。h&e染色分析结果显示，第3天时，可见明显的包埋物；第7天时，包埋物仅少量剩余；第14天时，包埋物不可见；21天后包埋处组织已完全再生，说明蜗牛粘液冻干品已完全降解；而且，在此过程中，周围组织未见明显的炎症浸润和任何组织增生纤维化情况。
[0338]
综合分析：将本技术所述蜗牛粘液冻干粉包埋于动物皮下，拍照观察所述降解过程，并经组织h&e染色分析。结果表明，本技术所述蜗牛粘液冻干粉未见引起皮下组织炎症反应和出血或血栓形成等副作用，且在7～21天能完全降解，这个降解过程与伤口愈合时间过程基本吻合。然而，氰基丙烯酸酯类医用粘合剂在长达21天后，仍然未见显著降解，且周围组织中有显著的水肿炎症浸润等不良反应。因此，本技术所述的天然生物材料具有良好的生物相容性和降解性，与临床使用的氰基丙烯酸酯类(如医用504)比较具有显著的技术优势。
[0339]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0340]
以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。