一种具有抗过敏作用的相思子提取物及其制备方法和用途

1.本发明属于中药民族药领域，具体涉及一种具有抗过敏作用的相思子提取物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.过敏反应是机体在接触抗原刺激后引发的免疫应答导致的组织损伤或功能紊乱反应，又称为变态反应性反应，根据发病原理可以分为ⅰ型
‑ⅳ
型，其中ⅰ型：如支气管哮喘、过敏性鼻炎、胃肠道与皮肤过敏反应；ⅱ型：如溶血性贫血、粒细胞减少和血小板减少性紫癜；ⅲ型：如血清病、系统性红斑狼疮；ⅳ型：如接触性皮炎、湿疹性反应等。最常见的为由ige介导的i型过敏反应，又称为及时性过敏反应。过敏源数量多，来源广，在变态反应中，长时间或反复接触过敏源可导致慢性过敏疾病，如花粉过敏，过敏性鼻炎，荨麻疹，过敏性哮喘等。如今，过敏反应已经成为一个全球性的公共卫生问题，由于环境及气候恶化影响，过敏反应发病率逐年增加，世界卫生组织(who)估计全球约有1.5亿哮喘患者，其中50％成年人及80％儿童患者均由过敏因素诱发。
3.目前用于治疗过敏反应的药物主要有:h1受体拮抗剂，如氮卓斯汀、地氯雷他定、羟嗪等；色酮类药物，如色甘酸钠、洛多沙胺等；激素类，如皮质类固醇等；酶类，如胰糜蛋白酶等。这些药物作用效果快，但作用位点单一，常见不良反应有头晕、嗜睡、口干恶心等，且长期使用容易产生耐药性。面对过敏性疾病的高发性，现有的药物已不够满足治疗需求，因此需要开发新型高效安全的抗过敏药物。天然产物具有药效缓和，毒副作用小，作用靶点多等特点，为开发新的抗过敏药物提供了一条新的思路。
4.相思子来源于豆科相思子属植物相思子abrus precatorius l.，主要产于我国西藏(墨脱、杂日)、广东、广西、云南、台湾等地。相思子的根、茎、叶均可入药，为民间常用草药，也是蒙古族、维吾尔族、藏族等少数民族的常用药。其味甘甜，性凉，具有去湿消炎、清热解毒、润肺护肝等功效，民间常用于治疗治疗咽喉肿痛、支气管炎、肺热咳嗽、肝炎、疮疖等。《千金方》记载“相思子十四枚。水研服，取吐”用于治疗瘴寒热。《本草拾遗》记载相思子“通九窍，治心腹气。止热闷头痛，风痰。杀腹藏及皮肤内一切虫。又主蛊毒。藏医药著作《晶珠本草》《蓝琉璃》《甘露本草明镜》《中华本草藏药卷》《中国藏药(第一卷)》等中收录。相思子富含生物碱、皂苷类、黄酮类、蒽醌类、萜类及多酚类物质等有效成分。此前的研究表明，相思子具有抗炎、抗肿瘤、抗溃疡、抗氧化等方面的药理作用。
5.本发明首次发现了具有抗过敏作用的相思子提取物有效部位，为临床上治疗过敏相关疾病提供了更多治疗选择。


技术实现要素：

6.本发明的目的是为了解决现有技术的不足，实现采用现代药物研究方法对天然产物进行开发利用，结合大量药效学实验筛选，提供了一种具有抗过敏作用的相思子提取物及其制备方法和用途。
7.具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：
8.在第一个方面中，本发明提供了一种具有抗过敏作用的相思子提取物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
9.(1)将原料相思子abrus precatorius l.去荚果全草干燥，药材粉碎后过40目筛，用3-5倍量70-80％乙醇加热回流提取2次，每次1-3小时，合并提取液，减压回收得到相思子总提取物；
10.(2)按照步骤(1)中制备得到的相思子总提取物与树脂量的重量比1∶3经大孔树脂柱洗脱，先以3-5倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，再以7-10倍体积70-80％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，即得具有抗过敏作用的相思子提取物有效部位。
11.作为可选的方式，在所述制备方法中，在步骤(2)中，所述大孔树脂柱的型号选自ab-8、hpd-100、hpd300、hpd-450或hpd500。
12.作为可选的方式，在所述制备方法中，所述制备方法包括以下步骤：
13.(1)将原料相思子abrus precatorius l.去荚果全草干燥，药材粉碎后过40目筛，用4倍量75％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压回收得到相思子总提取物；
14.(2)按照步骤(1)中制备得到的相思子总提取物与树脂量的重量比1∶3经ab-8大孔树脂柱洗脱，先以4倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，再以8倍体积75％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，即得具有抗过敏作用的相思子提取物有效部位。
15.作为可选的方式，在所述制备方法中，所述具有抗过敏作用的相思子提取物有效部位的主要活性成分为相思子总生物碱。
16.在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的制备方法制备得到的具有抗过敏作用的相思子提取物。
17.在第三个方面中，本发明提供了一种具有抗过敏作用的药物制剂，所述药物制剂包含上述第二个方面所述的相思子提取物和药学上可接受的赋形剂，所述药物制剂为口服剂型或外用剂型。
18.本发明的“药学上可接受的赋形剂”是指药物制剂领域常规的药物载体，选自填充剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、润湿剂、色素、矫味剂、溶剂、表面活性剂中的一种或几种。
19.本发明所述填充剂包括但不限于淀粉、微晶纤维素、蔗糖、糊精、乳糖、糖粉、葡萄糖等；所述润滑剂包括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、氯化钠、油酸钠、月桂醇硫酸钠、泊洛沙姆等；所述粘合剂包括但不限于水、乙醇、淀粉浆、糖浆、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮等；所述崩解剂包括但不限于淀粉泡腾混合物即碳酸氢钠和枸橼酸、酒石酸、低取代羟丙基纤维素等；所述助悬剂包括但不限于多糖如金合欢胶、琼脂、藻酸、纤维素醚和羧甲基甲壳酯等；所述溶剂包括但不限于水、平衡的盐溶液等。
20.优选地，可以将本发明的药物制成各种固体口服制剂、液体口服制剂等。药剂学可接受的口服剂固体制剂有：粉剂、普通片剂、分散片、肠溶片、颗粒剂、胶囊剂、滴丸、散剂等，口服液体制剂有口服液、乳剂等。
21.作为可选的方式，在上述药物制剂中，优选地，所述口服剂型为粉剂、片剂、胶囊
剂、颗粒剂或口服液。
22.或者，作为可选的方式，所述药物制剂也可以是外用剂型，所述外用剂型为乳膏剂、软膏剂、气雾剂、吸入剂或喷雾剂。
23.上述各种剂型可以根据药物制剂领域的常规工艺制备而成。
24.在第四个方面中，本发明提供了上述第二个方面所述的相思子提取物或者上述第三个方面所述的药物制剂在制备治疗各种类型过敏性疾病的药物中的用途。
25.作为可选的方式，在上述用途中，所述过敏性疾病选自花粉症、过敏性鼻炎或过敏性皮炎。
26.在上文所述的医药用途中，对于活性成分的给药时间、给药次数和给药频率等等，需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。例如，将对小鼠或大鼠的治疗方案应用于人体上，所有药物对人的有效剂量可以通过该药物对小鼠或大鼠的有效剂量进行换算，这对于本领域的普通技术人员而言也是容易实现的。
27.本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
28.(1)可以将本发明所述相思子提取物或其药物制剂用于制备治疗包括花粉症、过敏性鼻炎、过敏性皮炎在内的各种类型过敏性疾病的药物。
29.(2)与现有技术相比，本发明为多个天然产物相思子的提取物，相较目前已上市的药物，其具有多靶点发挥药效的特点，增强药理作用和临床疗效，降低毒副作用。
30.(3)本发明使用的相思子提取物来源广泛，能够通过成熟方法生产，使得本发明药物便于工业化大规模生产。此外，通过加入可药用载体将本发明药物制成常规口服制剂或外用制剂，使药物治疗稳定，完善药效的发挥，且使用方便。
附图说明
31.图1：上样量与洗脱液体积的响应曲面。
32.图2：上样量与洗脱剂浓度的响应曲面。
33.图3：洗脱液体积与洗脱剂浓度的响应曲线。
34.图4：体外抑制透明质酸酶法评价抗过敏活性流程图。
35.图5：相思子提取物的体外透明质酸酶抑制率。
36.图6：相思子提取物对rbl-2h3细胞活力的影响。
37.图7：相思子提取物对rbl-2h3细胞活力的影响。
38.图8：相思子提取物对rbl-2h3细胞组胺释放的影响。
具体实施方式
39.下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。
40.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
41.下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。
42.实施例1：相思子提取物的制备
43.1.1相思子提取物的制备
44.将原料相思子abrus precatorius l.去荚果全草干燥，药材粉碎后过40目筛，用4倍量75％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压回收得到相思子总提取物(apt)。
45.按照相思子总提取物(apt)与树脂量1∶3经ab-8大孔树脂柱洗脱，先以4倍体积的水洗脱，弃去水洗脱液，再分别以4倍体积30％乙醇溶液、8倍体积75％乙醇溶液分别洗脱，收集乙醇洗脱液，60℃减压浓缩，烘干至恒重，分别得到有效部位相思子30％醇提取物(apft)和相思子75％醇提取物(apat)。
46.其中，采用上述方法制备得到的相思子75％醇提取物(apat)即为本发明具有抗过敏作用的相思子提取物有效部位。将在上述制备方法中制备得到的apt、apft和apat用于后续的抗过敏药效学研究。
47.1.2相思子提取物中总黄酮与总生物碱的含量测定
48.1.2.1apft中总黄酮的含量测定
49.以芦丁标准品为对照，加95％乙醇配制成不同梯度浓度(mg/l)的的芦丁对照品溶液，分光光度法在260nm波长的测定吸收度，以芦丁浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，得芦丁标准曲线及其回归方程。精密称取apft，加95％乙醇100ml配置成apft总黄酮样品溶液，按照芦丁对照品吸光度测定方法测定apft总黄酮样品液的吸光度，代入芦丁标准品回归方程中，按下述公式计算apft样品中总黄酮含量：
50.样品中黄酮含量＝(样品中黄酮质量/样品总质量)
×
100％
51.本富集方法得到的提取物apft中总黄酮含量≥20％。
52.1.2.2apat中总生物碱的含量测定
53.取在105℃干燥至恒重的相思子碱对照品适量，精密称定，加ph5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液制成不同梯度浓度(mg/ml)的相思子碱的溶液，精密吸取各溶液2ml，分别置分液漏斗中，精密加ph5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液10ml，再加入用ph5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制的0.04％溴甲酚绿溶液2ml,摇匀，氯仿(5ml)依次萃取4次，用氯仿浸润的滤纸依次将氯仿萃取液滤入25ml容量瓶中，洗涤滤纸，滤入量瓶中，加氯仿至刻度。照分光光度法分别在417nm处测定吸收度，以相思子碱浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图，得相思子碱标准曲线及其回归方程。
54.取apat样品0.1g，精密称定，置具塞三角瓶中，加ph5.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液25ml，振摇5min后放置12h，用干燥滤纸滤过，弃去初滤液，另取续滤液作为供试品溶液,按相思子碱对照品吸光度测定方法测apat的吸光度，代入相思子碱标准品回归方程中，按下述公式计算apat总生物碱含量：
55.样品中生物碱含量＝(样品中生物碱质量/样品总质量)
×
100％
56.本富集方法得到的提取物apat中总生物碱含量≥20％。
57.实施例2：相思子提取物富集纯化工艺研究
58.建立了单因素试验结合响应面法优化大孔吸附树脂对相思子提取物的富集纯化工艺。相思子总生物碱提取物可应用ab-8型大孔吸附树脂进行富集纯化，经design-expert8.0.5软件分析，富集过程中对总黄酮回收率的影响顺序为上样量》洗脱剂体积》洗
脱剂浓度，经响应面方法优化后得到最优富集工艺为：上样量为1：3，洗脱液体积为8倍量，洗脱剂浓度为75％乙醇。在此条件下进行3组平行实验验证，所得平均总黄酮回收率为73.27％，与理论值的相对误差在
±
0.96％内。本技术建立的富集优化工艺可保障获得相思子中有效部位。
59.2.1树脂的筛选
60.精密吸取apt样品液(10ml)，分别通过以下5种不同型号的预处理完全的树脂柱(树脂用量为30ml，以下均为30ml)，静置30min后，依次用100ml蒸馏水、30％乙醇溶液、75％乙醇溶液洗脱，分别收集30％和75％乙醇洗脱液，减压浓缩蒸干，用蒸馏水定容于25ml容量瓶中，采用酸性染料比色法测定75％乙醇洗脱液中总生物碱含量，并计算回收率，结果见下表1。
61.表1不同型号树脂对总生物碱回收率的影响
[0062][0063]
由上表可见，ab-8型树脂对纯化相思子提取物具有相对较高回收率和含量，故选择ab-8型大孔吸附树脂为富集纯化的最优树脂。
[0064]
2.2单因素实验
[0065]
对样品上样量、乙醇体积分数、洗脱剂用量、样品吸附时间4个对分离效果影响较大的因素进行单因素试验，以确定影响较显著的因素并初步筛选和估计响应面试验中的中心试验点和各因素的取值区间。
[0066]
乙醇体积分数的考察：精密吸取0.08g/ml样品液10ml上柱并静置30min，用100ml蒸馏水水洗后，分别用60％、70％、80％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，称量，测定吸光度，计算总生物碱回收率考察乙醇体积分数对总生物碱回收率的影响。
[0067]
样品上样量的考察：分别吸取0.08g/ml样品液5ml、10ml、15ml、20ml上柱并静置30min，依次用100ml蒸馏水，6倍体积75％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，称量，测定吸光度，计算总生物碱回收率，考察上样量对总生物碱回收率的影响。
[0068]
洗脱剂用量的考察：精密吸取0.08g/ml样品液10ml上柱并静置30min,用100ml蒸馏水水洗后，再分别用4倍、6倍、8倍体积的75％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，称量，测定吸光度，计算总生物碱回收率，考察洗脱剂用量对总生物碱回收率的影响。
[0069]
样品吸附时间的考察：精密吸取0.02g/ml样品液5ml上柱，分别静置15、30、45、60min，用100ml，蒸馏水水洗后，再用75％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，蒸干，称量，测定吸光度，计算总生物碱回收率。
[0070]
2.3box-behnken试验
[0071]
为优化apt中总生物碱回收率的最优条件，采用design-expert8.0.5作为分析软件，以总生物碱回收率为响应值，进行box-behnken试验，在单因素的基础上选择对总生物碱回收率影响较大的因素进行实验和数据分析。依据单因素试验结果，吸附时间不同对总
生物碱回收率的影响不大，结合图表并考虑实际操作的实验时间，故确定吸附时间为30min，选择上样量(a)、洗脱液体积(b)、洗脱剂浓度(c)作为影响因素对总生物碱回收率进行响应面设计，以总生物碱回收率为响应值(r)进行三因素三水平实验设计，优化富集工艺，获得最优实验参数。具体因素水平见下表。
[0072]
表2响应面分析各因素水平表
[0073][0074]
2.4响应面实验设计及结果
[0075]
表3响应面设计实验及结果
[0076][0077]
采用design-expert.8.0.5版对实验数据进行分析，经多项回归得到二次回归方程，如下：r1＝73.46+4.07a+0.67b+0.63c-0.70ab+1.17ac+0.010bc-14.16a
2-1.67b
2-0.77c2，对试验结果进行统计分析，方差结果如下表所示：
[0078]
表4响应面试验结果方差分析表
[0079]
[0080][0081]
注：**，p《0.0001，差异极显著；*，0.0001《p《0.05,差异显著。
[0082]
由表4方差分析可知，各因素f值越大表明对结果影响越大，因此对总生物碱回收率影响程度大小依次为：上样量》洗脱剂体积》洗脱剂浓度，其中各因素与响应值之间的关系高度显著；考察交互项之间的相互作用，由方差分析表可知，在建立的模型中，ab与ac(即上样量与洗脱剂浓度)存在明显的交互作用，上样量与洗脱剂浓度之间的交互作用对r有显著的影响，洗脱剂浓度与洗脱剂体积的交互作用较小，对总生物碱回收率没有显著影响。
[0083]
2.5响应面分析及优化
[0084]
通过响应面模型方程的建立，得出响应面曲线图1、图2和图3。由图可分析各因素对响应值的影响程度及因素间对响应值的交互影响程度。通过三维图，可观察响应曲面的倾斜度确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越陡，说明单因素对响应值的影响越显著。
[0085]
图1表示上样量与洗脱液体积对总生物碱回收率的交互作用的影响效应。由图可知，该响应面曲线的水平等高线为椭圆形，表明上样量与洗脱剂体积的交互作用对总生物碱回收率的影响是显著的。在固定洗脱剂浓度为c＝0时，总生物碱回收率出现极值。总生物碱回收率随着上样量的增加而增加随后降低，在a＝0.1后开始下降；同样，总生物碱回收率随着洗脱剂体积的增加而增加，随后降低，在b＝0.1后开始下降，所以该响应曲面有极值。上样量的曲线陡峭度明显大于洗脱液体积曲线的陡峭度，说明上样量对总生物碱回收率的影响大于洗脱剂浓度对总生物碱回收率的影响。
[0086]
图2表示上样量与洗脱剂浓度对总生物碱回收率的交互作用的影响效应。由图可知，该响应面曲线的平面等高线图呈椭圆形，上样量与洗脱液浓度的交互作用对总生物碱回收率的影响是显著的。把洗脱剂浓度固定在b＝0时，总生物碱回收率随着上样量的增加而增加随后降低，在a＝0.1左右出现极值随后降低；而总生物碱回收率同样随着洗脱液体积的增加而增加，随后降低，在c＝0.5左右出现极值随后降低。上样量的曲线陡峭程度大于洗脱液浓度的曲线陡峭程度，说明上样量的影响程度大于洗脱剂浓度的影响。
[0087]
图3表示洗脱液体积和洗脱剂浓度对总生物碱回收率的交互作用的影响效应。由图可知，平面等高线图未呈明显的椭圆形，表明洗脱液体积与洗脱剂浓度对总生物碱回收率的交互影响不显著。当把上样量固定在a＝0时，总生物碱回收率随着洗脱液体积和洗脱剂浓度的增加而增加，而后下降。在b＝0.1，a＝0.5左右出现极值，而后呈下降趋势。图中两者的陡峭程度都不高，说明两者的单因素影响和交互作用对总生物碱回收率的影响都不是
特别显著。
[0088]
结合模型方程及响应面图象分析，design-expert法给出最优富集工艺为，a＝0.162，b＝0.168，c＝0.526即a＝10.81ml，b＝190.07ml，c＝75.26％，即药材提取物与树脂用量为1：3，洗脱体积为8倍，洗脱溶剂浓度为75％乙醇溶液为最佳富集纯化工艺。
[0089]
2.6富集工艺条件验证
[0090]
按照上述分析结果，选择上样量a＝10ml，b＝180ml，c＝75％进行3组平行实验，得到的总生物碱回收率平均值为73.27％，相对误差在
±
0.96％内，说明该工艺有效。
[0091]
实施例3：相思子提取物的抗过敏作用评价
[0092]
3.1体外抑制透明质酸酶法评价抗过敏活性
[0093]
本实验采用elson-morgan改良法，测定不同浓度相思子提取物apat对透明质酸酶的抑制率。透明质酸酶参与i型变态反应，与炎症、过敏高度相关，各类肥大细胞释放组胺的药物能调节透明质酸酶活性，一些抗过敏药物具有强抑制透明质酸酶活性，因此体外抑制透明质酸酶活性可作为评价抗过敏作用的指标。
[0094]
3.1.1评价试验方法
[0095]
取0.5ml透明质酸酶(600-1000u/ml)置于具塞试管中，加入0.1ml的2.5mmol/lcacl2，于37℃保温20min；加入浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625g/ml的相思子提取物apat样品液0.5ml，37℃保温20min；加入2.0ml的0.4mg/ml透明质酸钠，37℃保温40min；加入1ml乙酰丙酮-碳酸钠溶液，置于沸水浴中加热15min，立即用冰水冷却5min，然后加入1.0ml的ehrlich试剂，放置30min显色，于530nm处测定吸光度。流程见图4。
[0096]
计算公式：透明质酸酶抑制率(％)＝[(a-b)-(c-d)]/(a-b)
×
100％
[0097]
公式中：a为对照溶液(透明质酸钠+透明质酸酶+去离子水)的od值；b为对照空白溶液(乙酸缓冲溶液+去离子水)的od值；c为样品溶液(透明质酸钠+透明质酸酶+相思子提取物溶液)的od值；d为样品空白溶液(乙酸缓冲溶液+相思子提取物溶液)的od值。
[0098]
3.1.2评价实验的主要试剂配制
[0099]
透明质酸酶(600-1000u/ml)：精密称取透明质酸酶25.0mg，用乙酸缓冲溶液定容至25ml，即得。2.5mmol/lcacl2：精密称取0.2775g无水cacl2，用超纯水定容至1000ml，即得。0.4mg/ml透明质酸钠：精密称取100mg透明质酸钠，用乙酸缓冲溶液定容至250ml，即得。1.0mlehrlich试剂：精密称取1.6gp-dab溶于30ml浓盐酸和30ml无水乙醇中，摇匀即得。
[0100]
3.1.3透明质酸酶抑制率评价结果
[0101]
采用体外抑制透明质酸酶法分别测定了相思子总提取物apt、相思子30％醇提取物apft和相思子75％醇提取物apat在四个不同浓度水平的抗过敏活性，结果见表5和图5。
[0102]
表5.相思子提取物的体外透明质酸酶抑制率(n＝6)
[0103][0104][0105]
表5和图5中结果表明，相思子提取物各组在同等浓度下比较，相思子总提取物apt和75％醇提物apat对体外透明质酸酶的抑制率较高，提示其具有明显的体外抗过敏活性；
随着样品浓度降低，其对透明质酸酶的抑制率也呈现降低趋势；相思子30％醇提物apft的体外透明质酸酶抑制率较低，提示其体外抗过敏活性不显著。
[0106]
3.2体外细胞模型法评价抗过敏活性
[0107]
本研究应用体外大鼠嗜碱性粒细胞(rbl-2h3)模型，评价不同浓度相思子提取物apat对模型细胞脱颗粒与组胺释放的影响。ige与靶细胞表面高亲和力受体fcεri结合是i型变态反应的关键步骤，根据ige与受体fcεri的结合而触发过敏的机理，目前评价i型过敏的细胞模型中应用较多的大鼠嗜碱性粒细胞(rbl-2h3)模型和bmmc模型，其中rbl-2h3细胞表面有fcεri受体，也可释放脱颗粒标志物(β-氨基己糖苷酶)，且具有活力高、均一性好等特点。rbl-2h3细胞具有与肥大细胞一样原理，具有ige高亲和受体并释放炎症因子，肥大细胞受到刺激释放组胺是过敏应答过程中的一个重要环节，因而组胺的释放量也经常被作为抗过敏实验中的一个重要检测指标。
[0108]
3.2.1实验方法
[0109]
细胞培养：将rbl-2h3细胞培养于配制好的10％pbs/emem培养液中，置于6孔培养板中，每孔5
×
105个，于37℃和5％co2条件下培养，约2-3天长满并传代一次。
[0110]
细胞活力检测：将96孔细胞培养板的每孔中加入95μl细胞悬液(含5
×
10
4-6
×
104个细胞)。相思子提取物样品设置4个浓度梯度，每孔分别加入5μl样品，每个样品重复3孔。阴性对照孔每孔加入5μl的pbs，重复3孔。另设置3个空白复孔(100μl未加细胞的培养液/孔)以控制实验的准确性。于37℃和5％co2条件下培养48h后弃掉培养液，pbs清洗两次后，加入0.2mg/ml的mtt溶液，100μl/孔，继续培养4h，弃去mtt溶液，每孔加入200μl的dmso终止反应，37℃条件下孵育30min后测定样品孔、阴性孔以及空白孔的od
570
。
[0111]
脱颗粒实验：(1)敏化细胞。回收胰酶消化下来的细胞，用培养液重悬，按设置好的浓度添加anti-dnp-ige。分入48孔板中，200μl/孔，于37℃和5％co2条件下培养过夜(12-16h)。anti-dnp-ige的终浓度为0.1μg/ml。(2)刺激细胞。12-16h后，弃掉培养液，用pbs洗涤敏化好的细胞，200μl/孔，取溶好样品的tyrode’s缓冲液，195μl/孔。阴性孔中加190μl的tyrode’s缓冲液+5μl的d-pbs缓冲液。于37℃和5％co2条件下继续培养1h。(3)检测β-氨基己糖苷酶活性。细胞经样品孵育1h后，每孔中加入适量的dnp-bsa，使其终浓度为0.5μg/ml，于37℃和5％co2条件下刺激培养rbl-2h3细胞1小时后。收集细胞培养上清，向细胞孔中加入200μl的细胞裂解液(含0.1％tritonx-100的tyrode’s缓冲液)裂解细胞约5min；分别取细胞上清以及混匀的细胞裂解液25μl，加入相应的酶标板(96孔)中，添加4-methylumbellife-ryl-n-acetyl-b-d-glucosaminide试剂(1.2mm)，100μl/孔，震荡混匀，37℃条件下孵育30min，检测每孔溶液，获得的荧光值(360nm激发/450nm发射)计算脱颗粒效率，从而获得样品脱颗粒抑制率。
[0112]
3.2.2相思子提取物对rbl-2h3活力的影响
[0113]
应用mtt法检测相思子总提取物apt和相思子75％醇提取物apat对rbl-2h3细胞活力的影响，分别向rbl-2h3细胞中加入200μg/ml的apt和apat，于37℃和5％co2条件下培养培养48h，检测550nm波长处的吸光值，与pbs组的吸光值相比获得百分比，见表6和图6，200μg/ml的浓度的apt和apat样品对rbl-2h3细胞的活力均无影响，该浓度的样品可进行后续的细胞实验。
[0114]
表6.相思子提取物对rbl-2h3细胞活力的影响(n＝3)
[0115][0116][0117]
3.2.3相思子提取物对rbl-2h3细胞脱颗粒的影响
[0118]
通过检测β-氨基己糖苷酶酶活计算从rbl-2h3细胞中脱出的β-氨基己糖苷酶，从而评估样品对细胞脱颗粒抑制率。根据酶标仪检测所得的荧光值计算脱颗粒效率进而折算脱颗粒抑制率。
[0119]
脱颗粒效率：上清的荧光值/(上清的荧光值+细胞裂解液的荧光值)
×
100％
[0120]
脱颗粒抑制率：(阳性孔脱颗粒效率
–
样品孔脱颗粒效率)/(阳性孔脱颗粒效率
–
阴性孔脱颗粒效率)
×
100％
[0121]
pbs组的脱颗粒效率为10.14％，经0.5μg/ml dnp-bsa刺激1h后(即dnp-bsa组)的细胞脱颗粒效率达到39.51％，表明rbl-2h3细胞经anti-dnp-ige敏化后被dnp-bsa成功激活。apt和apat作用于激活之后的rbl-2h3细胞后，利用多功能酶标仪测定收集的细胞上清和细胞裂解液的荧光值(激发光360nm，发射光450nm)，经计算可得细胞脱颗粒抑制率分别为14.73％和27.98％(p《0.01)。实验结果见表7和图7，表明apt和apat均对rbl-2h3细胞脱颗粒有抑制效果，且apat的抑制效果较为明显，相比于apt有显著性差异，比表明经富集纯化工艺得到的相思子总生物碱部位比相思子总提取物对rbl-2h3细胞的脱颗粒抑制活性有明显的提升。
[0122]
表7.相思子提取物对rbl-2h3细胞活力的影响(n＝3)
[0123][0124]
3.2.4相思子提取物对rbl-2h3细胞组胺释放的影响
[0125]
rbl-2h3细胞经ige(0.1μg/ml)敏化和15min的dnp-bsa(0.5μg/ml)刺激后，收集细胞培养上清，检测其中的组胺含量。
[0126]
组胺检测实验：参照以上脱颗粒的方法敏化并刺激细胞，dnp-bsa刺激细胞15min后，即收集细胞培养上清，按照ibl公司(德国，innovation beyond limits)的组胺检测试剂盒检测细胞上清中组胺的含量。
[0127]
pbs组细胞培养上清中组胺含量为56.78ng/ml，dnp-bsa组细胞培养上清中组胺含量为211.63ng/ml(p《0.01)，相思子总提取物apt和相思子总生物碱apat作用之后对rbl-2h3细胞的组胺释放有一定的抑制作用，如表8和图8示，抑制率分别为18.16％和25.32％。结果表明，apt和apat均对rbl-2h3细胞的组胺释放有一定的抑制效果，且apat的抑制效果较为明显，相比于apt有显著性差异，表明经富集纯化工艺得到的相思子总生物碱部位比相
思子总提取物对rbl-2h3细胞组胺释放抑制活性有明显的提升。
[0128]
表8.相思子提取物对rbl-2h3细胞组胺释放的影响(n＝3)
[0129][0130]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。