一种用于治疗前列腺癌组合物及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于治疗前列腺癌组合物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.前列腺癌是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤前列腺癌病理类型上包括腺癌(腺泡腺癌)、导管腺癌、尿路上皮癌、鳞状细胞癌、腺鳞癌。其中前列腺腺癌占95％以上。前列腺癌的发生与遗传因素有关，如果家族中无患前列腺癌者的相对危险度为1，绝对危险度为8；则遗传型前列腺癌家族成员患前列腺癌的相对危险度为5，绝对危险度为35～45。此外，前列腺癌的发病与性活动、饮食习惯有关。性活动较多者患前列腺癌的风险增加。高脂肪饮食与发病也有一定关系。
3.现有的前列腺癌治疗方法包括手术切除和化疗。其中，手术治疗创伤较大，术后恢复时间较长，甚至会损伤到局部的神经、血管以及肠道器官。此外，手术后可能导致尿失禁、膀胱颈挛缩、勃起功能障碍等严重并发症，对患者的生活质量影响较大。其中，在化疗的全身反应中，患者可能会出现恶心、呕吐、食欲不振、腹泻，以及口腔黏膜溃疡等症状。此外，有些化疗药物对心血管系统有毒性作用，严重的可发生心力衰竭。一些化疗药物可引起急性化学性肺炎和慢性肺纤维化，甚至出现呼吸衰竭。此外，放化疗的单一药物一般只能从单方面抑制肿瘤生长。
4.因此，急需找到一种更加安全有效的用于治疗前列腺癌组合物来替代手术切除和化疗。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的第一个技术问题是：
6.提供一种用于治疗前列腺癌组合物。所述用于治疗前列腺癌组合物通过恢复前列腺癌关键转录因子的表达，可以抑制肿瘤细胞生长。
7.本发明所要解决的第二个技术问题是：
8.提供一种所述用于治疗前列腺癌组合物的制备方法。
9.本发明还提出一种静脉注射剂，包括用于治疗前列腺癌组合物和药学上可接受的辅料。
10.本发明还提出一种用于治疗前列腺癌组合物在前列腺癌药物中的应用。
11.本发明还提出一种用于治疗前列腺癌组合物在免疫调节剂中的应用。
12.为了解决所述第一个技术问题，本发明采用的技术方案为：
13.一种用于治疗前列腺癌组合物，包括载体与klf5的mrna；所述载体与所述klf5的mrna的质量比为1-128：1；
14.所述载体包括摩尔比依次为1：0.5-2：0.5-2：0.1-0.5的(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇
2000。优选的，所述载体包括摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
15.klf5是一种锌指转录因子，klf5是一个参与调控多种生命活动的基础转录因子。一方面，klf5基因是一个在人类前列腺癌中高频缺失的抑癌基因，另一方面，klf5蛋白在癌变中发挥双重作用，其受tgf-β信号诱导而发生乙酰化修饰，乙酰化的klf5能逆转它在正常上皮细胞中的促增殖功能，并抑制前列腺癌细胞系pc-3和du145的裸鼠成瘤，而去乙酰化则阻断此抑制作用。
16.信使rna(mrna)是一大类rna分子，它将遗传信息从dna传递到核糖体，在那里作为蛋白质合成模板并决定基因表达蛋白产物肽链的氨基酸序列。rna聚合酶将初级转录物mrna(称为前mrna)转录成加工过的成熟mrna，这种成熟的mrna被翻译成蛋白质。如在dna中一样，mrna遗传信息也保存在核苷酸序列中，其被排列成由每个三个碱基对组成的密码子。每个密码子编码特定氨基酸，但终止密码子例外，因为其终止蛋白质合成。rrna是核糖体蛋白质制造机械的核心组成部分。
17.高水平的klf5的mrna存在于人类和小鼠的消化道包括小肠，大肠，胃，胰腺以及胎盘，睾丸和前列腺，骨骼肌肉和肺脏。klf5的mrna还被发现于人类和兔子的膀胱和子宫中。虽然klf5的表达主要在上皮细胞，但其同样也表达在心血管平滑肌和角膜上及淋巴样细胞，神经元细胞。虽然大多数组织表达了3.3kb的转录，在表达中睾丸组织约1.5kb。此外，klf5的表达在细胞增殖中更高于在分化细胞中。
18.若载体的摩尔比不在此范围内，则无法实现本发明方案。
19.若载体的选择不包括(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，则本发明的用于治疗前列腺癌组合物的效果将大打折扣。
20.根据本发明的一种实施方式，所述载体为纳米载体。
21.纳米载体为天然或合成的高分子以及无机纳米材料，以不同形式形成的纳米分散系统。包括纳米颗粒、纳米囊、纳米胶束、纳米乳剂等。纳米载体是一种属于纳米级微观范畴的亚微粒药物载体输送系统。将药物包封于亚微粒中，可以调节释药的速度，增加生物膜的透过性、改变在体内的分布、提高生物利用度等。
22.其中，固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticles，sln)是20世纪90年代初发展起来的新一代亚微粒给药系统，是指粒径在10-1000nm，以固态天然或合成的类脂如卵磷脂、三酰甘油等为载体，将药物包裹或夹嵌于类脂核中制成的固体胶粒给药系统，该系统中以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固态天然或合成的类脂为载体。
23.根据本发明的一种实施方式，所述载体溶于有机溶剂中，所述有机溶剂包括乙醇、乙醚、四氢呋喃、甲醇和丙酮中的至少一种。
24.根据本发明的一种实施方式，所述klf5的mrna溶于无机溶剂。
25.根据本发明的一种实施方式，所述载体中的有机溶剂与所述klf5的mrna中的无机溶剂的体积比为1：1-10，优选为1：3。
26.根据本发明的一种实施方式，所述载体与所述klf5的mrna的质量比为32-64：1。
27.根据本发明的一种实施方式，所述用于治疗前列腺癌组合物中，所述klf5的mrna溶于无机溶剂中，所述klf5的mrna浓度为0.5-10μg/ml。
28.根据本发明的一种实施方式，所述用于治疗前列腺癌组合物中，所述klf5的mrna溶于无机溶剂中，所述klf5的mrna浓度优选为2μg/ml。
29.为了解决所述第二个技术问题，本发明采用的技术方案为：
30.一种制备所述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
31.混合载体与klf5的mrna，得到所述用于治疗前列腺癌组合物。
32.本发明的另一个方面，还涉及所述用于治疗前列腺癌组合物在前列腺癌药物中的应用。
33.本发明的再一个方面，还提供一种用于治疗前列腺癌组合物在免疫调节剂中的应用。
34.所述技术方案中的一个技术方案至少具有如下优点或有益效果之一：
35.1.所述用于治疗前列腺癌组合物通过恢复前列腺癌关键转录因子的表达，可以通过抑制肿瘤细胞生长、抑制肿瘤病灶新生血管生成、促进免疫细胞浸润多个角度抑制前列腺癌发展、恶化及转移。
36.2.所述用于治疗前列腺癌组合物中所用材料生物相容性高，副作用低，载体和klf5 mrna都是生物可降解材料，相比放化疗药物毒副作用低。
37.3.所述用于治疗前列腺癌组合物中所述载体可用于体内静脉注射治疗前列腺癌，抑制其发展、恶化及转移。
附图说明
38.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
39.图1为不同比例的载体与egfp mrna递送到lncap细胞系的转染效率和平均荧光强度测试图。
40.图2为实施例1-3以及实施例8-12制备的用于治疗前列腺癌组合物递送到lncap细胞系后的蛋白表达经过western blotting分析的结果。
41.图3为注射实施例13制备的用于治疗前列腺癌组合物后的小鼠实验测试结果图。
42.图4为实施例4-7制备的用于治疗前列腺癌组合物递送到lncap细胞系后的蛋白表达经过western blotting分析的结果。
具体实施方式
43.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的范围。
44.实施例中，klf5的mrna购自云舟生物科技(广州)有限公司。
45.klf5的mrna序列详见seq id no.1。
46.实施例1
47.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
48.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
49.以质量比为32：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
50.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
51.实施例2
52.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
53.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
54.以质量比为64：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
55.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
56.实施例3
57.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
58.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
59.以质量比为128：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
60.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
61.实施例4
62.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
63.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
64.以质量比为32：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
65.上述载体为摩尔比依次为1：0.5：0.5：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
66.上述klf5的mrna与载体质量比为32：1。
67.实施例5
68.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
69.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
70.以质量比为32：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
71.上述载体为摩尔比依次为1：2：2：0.5的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
72.上述klf5的mrna与载体质量比为32：1。
73.实施例6
74.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
75.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：1；
76.以质量比为32：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
77.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
78.实施例7
79.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
80.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：10；
81.以质量比为32：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
82.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
83.实施例8
84.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
85.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
86.以质量比为1：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
87.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
88.实施例9
89.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
90.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
91.以质量比为2：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
92.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
93.实施例10
94.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
95.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
96.以质量比为4：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
97.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二
醇2000(dspe-peg2000)。
98.实施例11
99.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
100.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
101.以质量比为8：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
102.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
103.实施例12
104.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
105.将载体溶于乙醇中，klf5的mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；
106.以质量比为16：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与klf5的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到上述用于治疗前列腺癌组合物。
107.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
108.实施例13
109.一种制备上述用于治疗前列腺癌组合物的方法，包括以下步骤：
110.混合20微克klf5的mrna与320微克载体于100微升pbs中，得到用于治疗前列腺癌组合物。
111.上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
112.性能测试：
113.测试例中，培养基选用rpmi1640培养基，并在培养基中加入10％胎牛血清。
114.测试例中，rpmi-1640培养基购自gibco(美国)。
115.测试例中，培养基置于含5％co2的37℃恒温培养箱中培养。
116.rpmi是roswell park memorial institute的缩写，代指洛斯维
·
帕克纪念研究所。rpmi是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
117.测试例中，balb/c裸鼠源自北京维通利华实验动物技术有限公司。
118.测试例中，lncap细胞源自北京协和医院。
119.rpmi-1640细胞培养基成分表
[0120][0121][0122]
性能测试中，选用的实验组、对照组1和对照组2药物为：
[0123]
实验组：选自实施例1-3以及实施例8-12制备的用于治疗前列腺癌组合物。
[0124]
对照组1：选用64μg载体并溶于100μl的pbs中。
[0125]
其中，载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2，3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸、胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000。
[0126]
对照组2：选用100μl的pbs。
[0127]
对照组3：选用2μg klf5的mrna并溶于100μl的pbs中。
[0128]
egfp mrna测试组：egfp mrna测试组与实施例1-3以及实施例8-12制备的用于治疗前列腺癌组合物的区别仅在于将klf5的mrna替换为egfp mrna。具体为：将载体溶于乙醇中，egfp mrna溶于水中，乙醇与水体积比为1：3；以质量比为1：1，2：1，4：1，8：1，16：1，32：1，64：1，128：1(不包括乙醇和水的质量)混合载体与egfp的mrna，用超滤管超滤，除去乙醇，得到egfp mrna测试组的组合物。上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
[0129]
1.由于klf5的mrna没有荧光信号，因此对载体与egfp mrna(增强绿色荧光蛋白的mrna)之间质量比进行测试，以测试不同质量比的载体与egfp mrna对感染效率与平均荧光强度的影响，之后，可以将egfp mrna换算为klf5的mrna。测试方法如下：将egfp mrna测试组的组合物与lncap细胞共孵育，组合物中egfp mrna浓度为2μg/ml，24小时后用胰蛋白酶悬浮细胞并用流式细胞仪(bd facscanto)的gfp通道分析其荧光分布。
[0130]
测试结果如图1所示。
[0131]
从图1可以知道：载体与egfp mrna质量比在32-128时，转染效率最佳，即载体与klf5的mrna质量比在32-128时，转染效率最佳。
[0132]
2.将实验组、对照组1、对照组2和对照组3的组合物递送到lncap细胞系后进行蛋白表达并以western blotting分析，分析测试方法如下：将实验组、对照组1、对照组2和对照组3的组合物分别添加到1ml的lncap细胞培养基中，24小时后，用ripa细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)收集细胞总蛋白。用bca试剂盒(invitrogen)测定总蛋白量后，将相同总蛋白量的样品用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。将聚丙烯酰胺凝胶(上海碧云天生物技术有限公司)上的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜(上海碧云天生物技术有限公司)上，用5％牛奶(上海源叶生物科技有限公司)封闭。actin蛋白和klf5蛋白的一抗分别是ab5694和ab137676(abcam)，二抗是ab205718(abcam)，二抗显色液是tmb显色液(上海碧云天生物技术有限公司)。电泳系统包括电源，垂直电泳槽，转膜仪购自伯乐公司。凝胶成像系统购自thermofisher公司。
[0133]
测试结果如图2。
[0134]
从图2可以知道，对照组1-2处理的lncap细胞中klf5蛋白表达几乎看不见，对照组3处理的lncap细胞出现少量的klf5蛋白表达，实验组中所用的实施例1-3以及实施例8-12的用于治疗前列腺癌组合物处理的lncap细胞相比前者的klf5蛋白表达量显著增加，而实验组和对照组1-3对应的内参肌动蛋白actin的表达量相近，说明实验组的用于治疗前列腺癌组合物可以显著增强lncap细胞系的klf5蛋白表达(实施例1-3以及实施例8-12的用于治疗前列腺癌组合物处理的lncap细胞的klf5蛋白表达量相同，因此图2中仅进行有限的列举)。
[0135]
3.测试改性lncap细胞抑制肿瘤细胞生长的效果：
[0136]
在12只balb/c裸鼠皮下注射1
×
106个lncap细胞，小鼠平均重量为20g，建立前列腺癌异种移植皮下瘤模型。小鼠皮下肿瘤长至100mm3后，随机均分为三组，分别注射三组药物，第一组药物为：实施例13制备的用于治疗前列腺癌组合物；第二组药物为：载体320微克，100微升pbs；第三组药物为：100微升pbs，每3天重复给药一次。3周后进行测试比较，测试结果如图3所示，图3中仅示出其中一只小鼠，同组其他小鼠表现出来的肿瘤大小基本一致。
[0137]
上述载体为摩尔比依次为1：1：1：0.1的(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(dotap)，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸(dope)，胆固醇和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)。
[0138]
从图3可以知道，3周后，第一组相比第二组和第三组，小鼠皮下肿瘤明显减小，其中，第二组平均肿瘤大小1043mm3，第三组平均肿瘤大小1156mm3，第一组平均肿瘤大小368mm3，可见，不仅第一组的药物能够减小小鼠肿瘤大小，第二组的药物也能够减小小鼠肿
瘤大小。
[0139]
将实施例4-7制备的用于治疗前列腺癌组合物和对照组2的组合物分别添加到1ml的lncap细胞培养基中，24小时后，用ripa细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)收集细胞总蛋白。用bca试剂盒(invitrogen)测定总蛋白量后，将相同总蛋白量的样品用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。将聚丙烯酰胺凝胶(上海碧云天生物技术有限公司)上的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜(上海碧云天生物技术有限公司)上，用5％牛奶(上海源叶生物科技有限公司)封闭。actin蛋白和klf5蛋白的一抗分别是ab5694和ab137676(abcam)，二抗是ab205718(abcam)，二抗显色液是tmb显色液(上海碧云天生物技术有限公司)。电泳系统包括电源，垂直电泳槽，转膜仪购自伯乐公司。凝胶成像系统购自thermofisher公司。测试结果如图4所示。
[0140]
从图4可知，实施例4-7制备的用于治疗前列腺癌组合物处理的lncap细胞中klf5蛋白表达依次增强。
[0141]
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。