丁酸和/或丁酸梭菌在促进肝脏LrNK细胞功能成熟中的应用

丁酸和/或丁酸梭菌在促进肝脏lrnk细胞功能成熟中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学及免疫学技术领域，具体涉及丁酸和/或丁酸梭菌在促进肝脏lrnk细胞功能成熟中的应用。


背景技术：

2.本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.肝脏是机体最大的实质器官，在食物消化、吸收、物质代谢和解毒等方面发挥重要作用，同时富含大量免疫细胞，形成以枯否细胞、自然杀伤(nk)细胞和自然杀伤t(nkt)细胞等组成的固有免疫优势特征，维持肝脏免疫耐受状态和功能稳态。其中nk细胞在肝脏淋巴细胞中的比例远高于外周血和其他脏器(小鼠：5-10％；人：30-50％)，包含经典nk细胞(conventional nk,cnk)和肝脏驻留nk细胞(liver resident nk,lrnk)两个亚群，其中lrnk细胞占肝脏nk细胞的50％左右，由肝脏中的前体细胞发育而来，在获得nk细胞的谱系特征后分化为成熟的nk细胞，伴随klrg1等表面受体的表达。肝脏lrnk细胞不仅能够直接杀伤病毒感染细胞、癌变细胞和衰老细胞，同时分泌ifn-γ、tnf-α、cd107a等细胞因子、发挥免疫调节功能，而其功能和成熟的异常与肝纤维化、肝癌等疾病的发生发展密切相关。肝癌发生的早期即可检测到成熟期nk细胞数量的减少和杀伤功能、细胞因子分泌能力的明显降低，而恢复nk细胞的功能成熟能够有效控制肝癌的进程。然而，目前有关肝脏nk细胞发育和成熟的调控机制尚不明确。肠道细菌及其产生的各种代谢产物通过门静脉第一时间进入肝脏，维持肝脏功能，调控免疫微环境，而肠道菌群紊乱则导致免疫稳态失衡，参与肝脏疾病的发生发展进程。目前，关于肠道菌群及其代谢产物在肝脏nk细胞稳态调控中的作用尚未见报道。
4.肠道菌群可利用外源的食物底物或内源的宿主化合物产生一系列代谢产物,介导其与宿主进行互作。其中丁酸作为一种短链脂肪酸(scfas)在调控机体免疫稳态中发挥关键作用。然而，关于丁酸在肝脏免疫稳态形成中的作用尚未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供丁酸和/或丁酸梭菌在促进肝脏lrnk细胞功能成熟中的应用。本发明通过研究发现，肠道菌群代谢产物丁酸及丁酸梭菌对肝脏lrnk细胞功能成熟具有明显的调控作用，为肠道菌群代谢产物调控肝脏免疫稳态提供理论基础。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.本发明的第一个方面，提供丁酸和/或丁酸梭菌在调控lrnk细胞功能成熟中的应用。
7.更具体的，所述调控lrnk细胞功能成熟具体表现为丁酸和/或丁酸梭菌促进lrnk细胞功能成熟。
8.本发明通过研究发现，肠道菌群紊乱可导致肝脏lrnk细胞功能成熟障碍，而施用丁酸和/或丁酸梭菌后可以有效恢复因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍。所述促进lrnk细胞功能成熟具体表现包括：提高lrnk细胞成熟标志物cd11b、klrg1的表达，以及促进lrnk细胞ifn-γ、cd107a的分泌。
9.因此，本发明的第二个方面，提供丁酸和/或丁酸梭菌在制备调控lrnk细胞功能成熟产品中的应用。
10.更具体的，所述调控lrnk细胞功能成熟具体表现为丁酸和/或丁酸梭菌促进lrnk细胞功能成熟。
11.所述促进lrnk细胞功能成熟具体表现包括：提高lrnk细胞成熟标志物cd11b、klrg1的表达，以及促进lrnk细胞ifn-γ、cd107a的分泌。
12.本发明的第三个方面，提供一种组合物，所述组合物包括上述丁酸和/或丁酸梭菌。
13.本发明的第四个方面，提供组合物在调控lrnk细胞功能成熟或制备调控lrnk细胞功能成熟产品中的应用。
14.所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供实验室进行基础研究使用。
15.本发明的第五个方面，提供一种促进lrnk细胞功能成熟的方法，所述方法包括：向受试者施用丁酸和/或丁酸梭菌。
16.本发明的第六个方面，提供一种恢复因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍的方法，所述方法包括向受试者施用丁酸和/或丁酸梭菌。
17.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
18.上述技术方案首次报道了促进肝脏lrnk细胞功能成熟的肠道菌群代谢产物丁酸以及产丁酸菌丁酸梭菌。通过灌胃丁酸或丁酸梭菌，拯救了因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍。有助于进一步揭示nk细胞功能成熟的调控机制，将为阐明肝脏免疫稳态形成理论和探索新型nk靶向的肝病干预策略提供重要的实验依据，因此具有良好的实际应用之前景。
附图说明
19.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
20.图1为本发明口服灌胃丁酸实验流程图。
21.图2为本发明流式检测口服灌胃丁酸对lrnk细胞成熟的markercd11b、klrg1的表达的影响。
22.图3为本发明流式检测口服灌胃丁酸对lrnk细胞分泌ifn-γ、cd107a的影响
23.图4为本发明口服灌胃丁酸梭菌的实验流程图。
24.图5为本发明流式检测口服灌胃丁酸梭菌对lrnk细胞成熟的marker cd11b、klrg1的表达的影响。
25.图6为本发明流式检测口服灌胃丁酸梭菌对lrnk细胞分泌ifn-γ、cd107a的影响。
具体实施方式
26.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
27.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
28.现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.本发明的一个典型具体实施方式中，提供丁酸和/或丁酸梭菌在调控lrnk细胞功能成熟中的应用。
30.本发明的又一具体实施方式中，所述调控lrnk细胞功能成熟具体表现为丁酸和/或丁酸梭菌促进lrnk细胞功能成熟。
31.本发明通过研究发现，肠道菌群紊乱可导致肝脏lrnk细胞功能成熟障碍，而施用丁酸和/或丁酸梭菌后可以有效恢复因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍。所述促进lrnk细胞功能成熟具体表现包括：提高lrnk细胞成熟标志物cd11b、klrg1的表达，以及促进lrnk细胞ifn-γ、cd107a的分泌。其中，肠道菌群紊乱可是由抗生素处理所导致。
32.因此，本发明的又一具体实施方式中，提供丁酸和/或丁酸梭菌在制备调控lrnk细胞功能成熟产品中的应用。
33.更具体的，所述调控lrnk细胞功能成熟具体表现为丁酸和/或丁酸梭菌促进lrnk细胞功能成熟。
34.所述促进lrnk细胞功能成熟具体表现包括：提高lrnk细胞成熟标志物cd11b、klrg1的表达，以及促进lrnk细胞ifn-γ、cd107a的分泌。
35.所述产品可以是药物或实验试剂，所述实验试剂可供实验室进行基础研究使用。
36.本发明的又一具体实施方式中，提供一种组合物，所述组合物包括上述丁酸和/或丁酸梭菌。
37.本发明的又一具体实施方式中，提供组合物在调控lrnk细胞功能成熟或制备调控lrnk细胞功能成熟产品中的应用。
38.所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供实验室进行基础研究使用。
39.根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
40.本发明的又一具体实施方式中，所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
41.所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
42.本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
43.本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
44.本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
45.本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进lrnk细胞功能成熟的方法，所述方法包括：向受试者施用丁酸和/或丁酸梭菌。
46.本发明的又一具体实施方式中，提供一种恢复因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍的方法，所述方法包括向受试者施用丁酸和/或丁酸梭菌。
47.上述方法中，受试者可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等。
48.以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
49.实施例
50.相关实验检测方法
51.流式细胞术检测lrnk细胞的表面分子cd27、cd11b、klrg1的表达以及细胞因子ifn-γ、cd107a的分泌
52.(1)小鼠肝脏组织单个核细胞分离；
53.收集小鼠肝脏组织，在1x pbs缓冲液中研磨小鼠肝脏组织，600rpm离心1分钟去除下部肝细胞沉淀，收集上清细胞悬液，1200rpm离心收集细胞，使用10ml红细胞裂解液重悬细胞，于冰上裂解红细胞5分钟后，离心收集肝脏单个核细胞。使用40％percoll溶液重悬细胞，密度梯度离心，获得小鼠肝脏组织单个核细胞。
54.(2)细胞表面分子的检测；
55.计数1x106细胞，于1200rpm离心6分钟收集细胞，使用100μl pbs重悬细胞。在细胞悬液中加入cd3、nk1.1、cd27、cd11b、klrg1细胞表面的荧光抗体配色组合，涡旋细胞悬液充分混匀，于4℃避光孵育30分钟。加入2ml pbs缓冲液终止染色反应，1200rpm离心6分钟收集细胞样品，弃上清，使用200μl pbs重悬细胞，通过流式细胞仪检测各分子的表达。
56.(3)细胞内分子的检测
57.计数1x106细胞，于1200rpm离心6分钟收集细胞，使用100μl pbs重悬细胞。pma(50ng/ml pma)、ionomycin(1μg/ml)刺激2小时后加bfa阻断，同时加入cd107a流式抗体刺激4小时。收细胞首先进行细胞表面分子cd3、nk1.1的染色，结束细胞表面分子染色后，于1200rpm离心6分钟后收集细胞，使用200微升ebioscience公司的细胞固定液重悬细胞，于4
℃避光固定20分钟，每管加入1xebioscience公司的细胞穿膜液2ml，于1200rpm离心6分钟弃上清，加入200μl pbs收集细胞悬液，加入ifn-γ流式抗体，涡旋细胞悬液充分混匀，于4℃避光孵育30分钟。加入2ml pbs缓冲液终止染色反应，1200rpm离心6分钟收集细胞样品，弃上清，使用200μl pbs重悬细胞，通过流式细胞仪检测nk细胞分泌的ifn-γ、cd107a的表达。
58.1、丁酸对肝脏lrnk细胞功能成熟的调控
59.为证明丁酸对肝脏lrnk细胞的功能成熟的影响，采用三组小鼠，a对照组，采用无任何处理的断奶期c57bl/6j小鼠。b肠道菌群紊乱组，采用抗生素处理的方式构建肠道菌群紊乱的小鼠模型，具体方法如下：c57bl/6j雌鼠生产前一周使用联合抗生素包括氨苄青霉素、硫酸新霉素、甲硝唑、万古霉素来清除肠道菌群，一直使用抗生素至断奶，之后进行5周的正常饮水，在小鼠8周时进行实验。利用抗生素早期干预小鼠肠道菌群的发育，可以更加真实地模拟人类生命早期肠道菌群失调的情况，也进一步证实了早期肠道菌群稳态的破坏对免疫细胞发育成熟可以造成长远影响。c丁酸灌胃组，在b组小鼠的基础上进行口服灌胃丁酸。对照组和肠道菌群紊乱组在断奶期开始灌胃生理盐水200μl，每天一次，连续灌胃5周。丁酸灌胃组在断奶期开始口服灌胃丁酸(100mg/kg)，每天灌胃一次，连续灌胃5周。三组小鼠在第8周实验终点时，取三组小鼠肝脏单个核细胞，通过流式细胞术检测肝脏lrnk细胞的功能和成熟。具体实验流程图见(图1)。
60.结果显示：与对照组相比，肠道菌群紊乱组小鼠肝脏lrnk细胞成熟的marker cd11b、klrg1表达降低，而灌胃丁酸组小鼠lrnk细胞成熟的marker cd11b、klrg1表达恢复到正常水平。肠道菌群紊乱组小鼠肝脏lrnk细胞分泌ifn-γ、cd107a的水平比对照组明显降低，而灌胃丁酸组小鼠lrnk细胞分泌ifn-γ、cd107a的水平恢复到正常水平。(图2、3)
61.由上述实验及其结果，可以得出如下结论：
62.小鼠口服灌胃丁酸可以恢复因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍。
63.2、口服丁酸梭菌对肝脏lrnk细胞功能成熟的调控
64.为证明丁酸对肝脏lrnk细胞的功能成熟的影响，采用三组小鼠，a对照组，采用无任何处理的断奶期c57bl/6j小鼠。b肠道菌群紊乱组，采用抗生素处理的方式构建肠道菌群紊乱的小鼠模型，具体方法如下：c57bl/6j雌鼠生产前一周使用联合抗生素包括氨苄青霉素、硫酸新霉素、甲硝唑、万古霉素来清除肠道菌群，一直使用抗生素至断奶，之后进行5周的正常饮水，在小鼠8周时进行实验。c丁酸梭菌灌胃组，在b组基础上进行口服灌胃丁酸梭菌。对照组和肠道菌群紊乱组在断奶期开始灌胃生理盐水200μl，每隔一天一次，连续灌胃5周。丁酸灌胃组口服灌胃丁酸梭菌(2
×
109cfu/0.2ml)，每隔一天灌胃一次，连续灌胃5周。三组小鼠在第8周实验终点时，取三组小鼠肝脏单个核细胞，通过流式细胞术检测肝脏lrnk细胞的功能和成熟。具体实验流程图见(图4)。
65.结果显示：与对照组相比，肠道菌群紊乱组小鼠肝脏lrnk细胞成熟的marker cd11b、klrg1表达降低，而灌胃丁酸梭菌组小鼠lrnk细胞成熟的marker cd11b、klrg1表达恢复到正常水平。肠道菌群紊乱组小鼠肝脏lrnk细胞分泌ifn-γ、cd107a的水平比对照组明显降低，而灌胃丁酸梭菌组小鼠lrnk细胞分泌ifn-γ、cd107a的水平恢复到正常水平。(图5、6)
66.由上述实验及其结果，可以得出如下结论：
67.小鼠口服灌胃丁酸梭菌可以恢复因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍。
68.综上，本发明提供一种促进肝脏lrnk细胞功能成熟的肠道菌群代谢产物丁酸以及产丁酸菌丁酸梭菌。通过灌胃丁酸或丁酸梭菌，拯救了因肠道菌群紊乱导致的肝脏lrnk细胞功能成熟障碍。有助于进一步揭示nk细胞功能成熟的调控机制，将为阐明肝脏免疫稳态形成理论和探索新型nk靶向的肝病干预策略提供重要的实验依据。
69.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。