本发明所属为材料化学、纳米科学、化学生物学及生物医学领域。具体涉及一种纳米疫苗载体、可同时递送药物到不同细胞器中的纳米疫苗、及其制备方法和应用。
背景技术：
1、纳米疫苗是以纳米颗粒为载体负载抗原和/或佐剂分子激活机体免疫反应的一种新型免疫治疗方法，在肿瘤等重大疾病的治疗上有广阔的应用潜力。利用纳米颗粒共递送抗原和佐剂分子到抗原呈递细胞，不仅可以提高抗原和佐剂在体内的稳定性，还能显著提高抗原和佐剂的免疫协同效果(m.s.goldberg,cell 2015,161,201)。纳米疫苗在生物医学领域已有广泛的应用，例如，同时负载抗原和佐剂的脂质体基纳米疫苗作为治疗型肿瘤疫苗已进入临床试验阶段(s.t.reddy,m.a.swartz,j.a.hubbell,trends inimmunology 2006,27,573)。此外，一些无机纳米颗粒也已被开发为递送抗原和佐剂的载体，如氧化铁纳米颗粒(l.luo,m.z.iqbal,c.liu,j.xing,o.u.akakuru,q.fang,z. li,y.dai,a.li,y.guan,a.wu,biomaterials 2019,223,unsp 119464)。尽管纳米疫苗在抗肿瘤和抗病原微生物等领域取得了一些进展，但大多数报道的纳米疫苗是通过内涵体介导的内吞作用进入细胞(q.zhou,y.zhang,j.du,y.li,y. zhou,q.fu,j.zhang,x.wang,l.zhan,acs nano 2016,10,2678；c.lai,s.duan, f.ye,x.hou,x.li,j.zhao,x.yu,z.hu,z.tang,f.mo,x.yang,x.lu, theranostics 2018,8,1723)，随着内涵体与溶酶体发生融合，纳米疫苗负载的佐剂如cpg(含有非甲基化胞嘧啶磷酸鸟嘌呤基序的短单链寡核苷酸，简称cpg)寡核苷酸能与溶酶体内膜上的toll-样受体(tlr)9分子结合激活下游的免疫通路(s.akira,k.takeda,nature reviews immunology 2004,4,499)，但纳米疫苗负载的抗原将被溶酶体的酸性环境和水解酶破坏而无法进入细胞质参与内质网的抗原呈递过程(m.p.stewart,a.sharei,x.y.ding,g.sahay,r.langer,k.f. jensen,nature 2016,538,183)。因此，纳米疫苗在溶酶体环境中的不稳定性及较低的内涵体逃逸效率导致了较低的抗原呈递效率，从而减弱了抗原特异性免疫响应。纳米药物的溶酶体不耐受及内涵体逃逸效率低也导致了其在递送需要进入细胞质或细胞核发挥作用的药物时表现不佳，这类药物包括化疗药物阿霉素，或基因治疗药物如质粒、信使rna，反义dna等(c.shi,m.l.li,z.zhang, q.c.yao,k.shao,f.xu,n.xu,h.d.li,j.l.fan,w.sun,j.j.du,s.long,j.y.wang,x.j.peng,biomaterials 2020,233,119755；j.zhou,z.shao,j.liu,q. duan,x.wang,j.li,h.yang,acs applied bio materials 2020,3,2686)。
2、因此，提高纳米颗粒进入细胞质的效率将有效提高包载抗原或药物的疗效。以共负载抗原和佐剂的纳米疫苗为例，通过纳米疫苗与抗原呈递细胞发生膜融合直接将抗原递送到细胞质是递送抗原的理想选择，但不适合递送需要进入溶酶体的佐剂，如上文所述的cpg。因此，为了最大限度地发挥抗原和佐剂的功效，迫切需要一种能够同时将抗原和佐剂分别递送到抗原呈递细胞的细胞质和溶酶体的纳米疫苗载体以及可高效递送药物或疫苗到细胞质中的方式。
技术实现思路
1、本发明提供一种纳米颗粒，所述纳米颗粒为共负载抗原和佐剂的氧化铁纳米颗粒。
2、根据本发明的实施方案，所述抗原的来源包括但不限于肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原或真菌抗原；
3、根据本发明的实施方案，所述抗原的种类包括但不限于多肽、核苷酸、多糖或蛋白质，优选为多肽；示例性地，所述抗原为ova257-264多肽或多肽e749-57。
4、根据本发明的实施方案，所述佐剂选自包括但不限于tlr3，tlr4，tlr7/8，tlr9的配体分子，例如选自cpg。
5、根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒的平均粒径为5-20nm，例如7-15nm，示例性为10.6±2.0nm。
6、根据本发明的实施方案，抗原和佐剂的共负载是通过氧化铁纳米颗粒表面马来酰亚胺基团、与巯基修饰的佐剂和巯基修饰的抗原发生点击化学反应实现的。
7、根据本发明的实施方案，所述抗原和佐剂的数量之和以占据氧化铁颗粒表面的所有连接位点为佳。一个氧化铁颗粒表面大概有336个连接位点，抗原和佐剂的摩尔总数为336个，二者的具体比例可调。例如，以摩尔比计，氧化铁纳米颗粒:佐剂:抗原＝1:16:320，即一个氧化铁颗粒表面可以负载16个佐剂加320个抗原。
8、根据本发明示例性的实施方案，所述纳米颗粒为共负载抗原ova257-264多肽和cpg佐剂的氧化铁纳米颗粒，将其记为ionp-c/o；
9、或者为共负载抗原多肽e749-57和cpg佐剂的氧化铁纳米颗粒，将其记为 ionp-c/e。
10、本发明还提供上述纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：
11、水溶性的氧化铁纳米颗粒、巯基修饰的佐剂以及巯基修饰的抗原，发生点击化学反应，制备得到所述纳米颗粒；
12、所述水溶性的氧化铁纳米颗粒表面修饰有马来酰亚胺基团。
13、根据本发明的实施方案，所述水溶性的氧化铁纳米颗粒的制备过程包括：用带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇置换氧化铁纳米颗粒的油酸配体，获得水溶性的氧化铁纳米颗粒；
14、优选地，将油酸配位的氧化铁纳米颗粒用乙醇沉淀，分散于四氢呋喃中；向分散体系中加入带有双磷酸和马来酰亚胺基团的聚乙二醇反应，反应完成后经后处理，得到所述水溶性的氧化铁纳米颗粒；
15、优选地，所述反应的温度为30-50℃，反应的时间为5-15h；
16、优选地，所述后处理包括向反应产物中加入溶剂(例如环己烷)沉淀、抽干溶剂、水分散、超滤。
17、根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：先将水溶性的氧化铁纳米颗粒与巯基修饰的佐剂振荡反应，反应完成后再向其中加入巯基修饰的抗原，进行振荡反应，得到所述纳米颗粒。
18、根据本发明示例性的实施方案，所述巯基修饰的佐剂为巯基修饰的cpg。
19、根据本发明示例性的实施方案，所述巯基修饰的抗原为半胱氨酸修饰的ova257-264多肽或多肽e749-57。
20、根据本发明的实施方案，所述水溶性的氧化铁纳米颗粒、巯基修饰的佐剂、巯基修饰的抗原的摩尔比可以根据需要进行调整，以佐剂和抗原的数量能够完全占据氧化铁纳米颗粒表面的连接点为佳(如上文所述)，例如摩尔比为 1:16:320。
21、根据本发明的实施方案，所述振荡反应的温度为室温。所述室温指15-35℃。
22、根据本发明的实施方案，所述振荡反应的时间不低于1h，例如为1-5h，例如2h。
23、根据本发明的实施方案，所述振荡反应的溶剂体系为水。
24、根据本发明的实施方案，在向体系中加入巯基修饰的抗原之前，需要将多余的cpg从体系中去除。
25、根据本发明的实施方案，待巯基修饰的抗原的振荡反应完成后，需要将多余的巯基修饰的抗原从体系中去除。
26、本发明还提供上述纳米颗粒在纳米制剂中的应用。
27、根据本发明的实施方案，所述纳米制剂包括但不限于纳米疫苗。
28、示例性地，所述纳米颗粒用于制备纳米疫苗载体或者作为纳米疫苗载体。
29、根据本发明的实施方案，所述纳米制剂可以预防和/或治疗下述疾病：肿瘤、病毒感染、细菌感染或真菌感染引发的疾病。
30、本发明还提供一种纳米疫苗载体，含有上述纳米颗粒。
31、本发明还提供一种纳米疫苗，含有上述纳米颗粒或纳米疫苗载体。
32、根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗包括脂质体和上述纳米颗粒，所述纳米颗粒被包裹在所述脂质体的内部，所述脂质体含有靶向性的多肽。
33、根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗中，每个脂质体内能够包裹一个或更多个所述纳米颗粒。其中，“更多个”可以为两个、三个、五个、十个、二十个、三十个等。
34、根据本发明的实施方案，所述脂质体由三种磷脂分子制备得到。
35、根据本发明的实施方案，所述的磷脂分子包括但不限于阴离子磷脂分子、阳离子磷脂分子、中性磷脂分子和/或可离子化磷脂分子。
36、示例性地，所述三种磷脂分子为dspe-peg-p30、大豆卵磷脂(spc)和胆固醇(cho)；
37、优选地，大豆卵磷脂(spc)、胆固醇(cho)和dspe-peg-p30的质量比可以为(8-12):(4-7):1，例如10:6:1。
38、根据本发明的实施方案，所述靶向性的多肽为环状多肽，例如为多肽p30，用于靶向树突状细胞表面的cd11c受体。
39、根据本发明的实施方案，所述脂质体的厚度为2-20nm，例如为8-15nm。
40、根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗的水合粒径为100-300nm，例如为197.3nm。
41、根据本发明的实施方案，所述纳米疫苗的形貌为均匀的球型。
42、根据本发明示例性的实施方案，所述纳米疫苗包括脂质体和ionp-c/o纳米颗粒，所述ionp-c/o纳米颗粒被包裹在所述脂质体的内部，所述脂质体含有靶向性的多肽p30；
43、或者，所述纳米疫苗包括脂质体和ionp-c/e纳米颗粒，所述ionp-c/e纳米颗粒被包裹在所述脂质体的内部，所述脂质体含有靶向性的多肽p30。
44、本发明还提供上述纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：通过薄膜水化法将所述纳米颗粒包裹在所述脂质体中，制备得到所述纳米疫苗。
45、根据本发明的实施方案，所述制备方法包括如下步骤：将所述纳米颗粒分散于磷酸盐缓冲溶液(pbs)中，向其中加入干燥的磷脂薄膜进行水化，磷脂分子发生自组装形成载有纳米粒子的脂质体，所述脂质体再经探针超声处理、挤出成型，得到所述纳米疫苗。
46、根据本发明的实施方案，所述磷脂薄膜由上述三种磷脂分子制备得到；例如，由大豆卵磷脂(spc)、胆固醇(cho)和dspe-peg-环状多肽(例如 dspe-peg-p30)溶解于氯仿中，旋转蒸发得到所述磷脂薄膜。
47、根据本发明的实施方案，所述dspe-peg-环状多肽(例如dspe-peg-p30) 由下述方法制备得到：环状多肽(例如多肽p30)和dspe-peg-mal在水和甲醇的混合溶剂中室温避光反应；
48、例如，所述环状多肽和dspe-peg-mal的摩尔比为1:(0.1-10)，比如为1:1、 2:5、5:2。
49、根据本发明的实施方案，所述dspe-peg-环状多肽(例如dspe-peg-p30) 由下述方法制备得到：环状多肽(例如多肽p30)和dspe-peg-mal在水和乙腈的混合溶剂中室温避光反应；
50、例如，所述环状多肽和dspe-peg-mal的摩尔比为1:(0.1-10)，比如为1:1、 2:5、5:2。
51、根据本发明的实施方案，所述纳米颗粒、干燥的磷脂薄膜和pbs的质量体积配比可调，优选配比为(5-15)mg:(70-90)mg:4ml，例如为12mg:85mg:4ml。
52、根据本发明的实施方案，所述水化的温度为40-50℃，例如45℃。
53、根据本发明的实施方案，所述探针超声处理的条件包括：200w，开启5秒，关闭5秒，总共10分钟。
54、根据本发明的实施方案，所述挤出成型包括：将脂质体悬浮液从孔径分别为450nm、220nm和100nm的聚碳酸酯膜挤出。
55、本发明还提供一种改变纳米制剂进入细胞通路的方法，包括使用环状多肽修饰纳米制剂的脂质体表面，将活性成分(例如抗原)递送至细胞质。
56、根据本发明的实施方案，所述环状多肽和纳米制剂均具有如上文所示的含义。
57、根据本发明的实施方案，所述脂质体包括但不限于上述由三种磷脂分子制备得到的脂质体。
58、根据本发明的实施方案，所述修饰包括：将环状多肽(例如多肽p30)与1,2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[马来酰亚胺(聚乙二醇)2000] (dspe-peg-mal)偶联，并且将偶联后的反应产物dspe-peg-p30插入脂质体中。
59、本发明还提供环状多肽在改变纳米制剂进入细胞通路中的应用。
60、根据本发明的实施方案，所述环状多肽和纳米制剂均具有如上文所示的含义。
61、根据本发明的实施方案，所述改变纳米制剂进入细胞通路意指通过将环状多肽修饰到纳米制剂的脂质体表面，使活性成分(例如抗原)递送至细胞质。
62、本发明还提供氧化铁纳米颗粒作为佐剂的应用，即氧化铁纳米颗粒能够提高对象对抗原的免疫应答，促进免疫细胞成熟；
63、例如，氧化铁纳米颗粒作为上述纳米制剂中的佐剂；还如，氧化铁纳米颗粒作为上述纳米疫苗中的第二佐剂。
64、本发明的有益效果：
65、本发明所提供的氧化铁纳米颗粒为单分散性纳米颗粒，通过表面修饰带马来酰亚胺基团的聚乙二醇分子，与带巯基的抗原和带巯基的佐剂发生点击化学反应共负载抗原和佐剂，得到的纳米颗粒能够用于制备或作为纳米疫苗的载体。通过薄膜水化法将共负载抗原/佐剂的氧化铁纳米颗粒包裹在含有靶向性多肽的脂质体中，制得石榴样的脂质体纳米疫苗。本发明的纳米疫苗由磁性纳米颗粒和脂质体共同构建，利用脂质体表面的靶向性多肽可通过膜融合将抗原递送到细胞质参与抗原的呈递，也可通过胞吞将佐剂递送到溶酶体激活tlr9免疫信号通路，此外氧化铁纳米颗粒进入细胞后也可通过产生活性氧物质(reactive oxygen species，ros)进一步增强免疫响应，该纳米疫苗载体增强了抗原和佐剂的协同免疫效果，氧化铁纳米颗粒作为第二佐剂发挥三重协同作用。疫苗分散性好，生物相容性好，毒副作用低，可同时递送抗原/佐剂到细胞质和溶酶体，激活树突状细胞并发生抗原呈递。
66、具体优点如下：
67、(1)本发明提供了一种以氧化铁纳米颗粒和靶向性脂质体为基础的纳米疫苗，其制备方法所涉及的原料简单易得，化学反应条件温和，实验步骤简单。
68、(2)本发明提供一种可以改变纳米颗粒进入细胞路径的方法，通过环状多肽修饰到脂质体表面实现。制备得到的脂质体纳米疫苗可同时将抗原递送到细胞质，佐剂递送到溶酶体，极大提高了抗原和佐剂之间的协同免疫效率。
69、(3)本发明首次发现氧化铁纳米颗粒作为佐剂的应用，能够提高对象对抗原的免疫应答，促进免疫细胞成熟。具体地，纳米疫苗中的氧化铁纳米颗粒既可作为抗原和佐剂的载体，又可发挥佐剂作用增强免疫效果。
70、(4)本发明制备得到的脂质体纳米疫苗中的抗原和佐剂容易替代，可用于治疗更多的疾病。