吩嗪衍生物在制备通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌干细胞干性药物中的应用

1.本发明涉及化合物的医药用途，特别涉及吩嗪衍生物在制备通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌细胞干性药物中的应用。


背景技术：

2.癌症干细胞被认为是癌症进展的根源。乳腺癌因其异质性表现为复发、转移和化疗耐药等特点，而这种异质性可能与乳腺癌干细胞有关。靶向乳腺癌干细胞被认为是一种潜在的乳腺癌治疗方法。
3.许多信号通路，如wnt，hedgehog和hippo，已被证实在乳腺癌干细胞进展中起重要作用。靶向癌症干细胞的小分子化合物和生物制剂得到了较好的开发，如靶向白血病干细胞的glasdegib和靶向白血病干细胞中高表达cd123的elzonris，它们已经获得了美国食品药品监督管理局的批准。然而，目前仍没有针对乳腺癌干细胞的药物被批准用于乳腺癌治疗的临床应用。因此，寻找新的化合物或通过“老药新用”来寻找靶向乳腺癌干细胞的药物变得越来越重要。
4.近年来，有研究发现乳腺癌干细胞中铁代谢异常。乳腺癌干细胞中的铁含量增加，导致乳腺癌干细胞对铁螯合更加敏感。铁的存在可直接改变细胞的分化，铁向溶酶体转移的缺失可增加癌细胞的干细胞性。铁也能通过诱导活性氧(ros)中最强的氧自由基fenton反应产生oh-，而oh-能攻击脂质增加脂质过氧化，这是铁中毒的关键因素之一。此外，不同的铁调节蛋白如铁反应元件结合蛋白2(ironresponsive element binding protein 2，irp2)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1，tfr1)和铁蛋白对铁稳态有调节作用。乳腺癌干细胞溶酶体中tfr1和转铁蛋白降解增加，而运铁素(fpn)降解减少。转铁蛋白的降低导致ros和铁细胞凋亡的抑制。铁蛋白是储存铁的容器，超氧化物自由基可触发铁蛋白释放fe
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。使用溶酶体破坏剂siramesine可增加乳腺癌细胞内的铁含量，导致ros增加和铁卟啉症的发生。铁蛋白的降解伴随着铁死亡的诱导。


技术实现要素：

5.发明目的：本发明目的是提供吩嗪衍生物在制备通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌细胞干性药物中的应用。
6.本发明要解决的技术问题是探明吩嗪衍生物通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌细胞干性的应用，为乳腺癌治疗的新药研发和创新疗法提供药学基础。
7.技术方案：本发明所述吩嗪衍生物在制备通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌干细胞干性药物中的应用，
8.所述吩嗪衍生物包括cpul119、cpul129和cpul149，
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进一步地，所述的乳腺癌干细胞包括人乳腺癌细胞系mcf-7细胞、mda-mb-231细胞或mcf-7-adr细胞。
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进一步地，所述mcf-7细胞、mda-mb-231细胞或mcf-7-adr细胞以3000-5000细胞/孔的密度接种。
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进一步地，将柠檬酸铁铵(fac)添加到乳腺癌细胞中提高细胞铁浓度，促进干细胞标记物和铁蛋白的表达。
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进一步地，所述药物通过尾静脉注射。
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溶酶体铁离子浓度的降低可维持癌细胞的干细胞性。乳腺癌中铁输出相关基因的减少和铁输入相关基因的增加代表了较好的预后。乳腺癌干细胞中铁的增加促进铁依赖蛋白的活性，并通过降低溶酶体中的铁储备来避免铁过载造成的损害，从而达到符合癌症干细胞代谢水平的“铁稳态调节”。盐霉素及其衍生物可以通过隔离溶酶体中的铁来靶向乳腺癌干细胞。靶向溶酶体中的铁可以杀死其他肿瘤中的癌症干细胞，如鼻咽癌和结肠直肠癌。溶酶体隔离铁是一种靶向乳腺癌干细胞的有效方法。
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本发明的吩嗪衍生物能在不影响细胞活力的情况下特异性减弱乳腺癌细胞的干性，可以显著降低干细胞性标志物cd44+/cd24-亚群的表达，减弱乳腺成球能力和肿瘤启动能力等。该类吩嗪衍生物可以通过与铁相互作用在溶酶体中积累和隔离铁，并通过调节参与铁运输和储存的蛋白(irp2、tfr1、铁蛋白)表达来触发铁中毒。此外，抑制铁离子中毒可以减弱这三种化合物对乳腺癌细胞干性的抑制。本发明公开了cpul119、cpul129和cpul149可通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌细胞的干性，是一类极具潜力的治疗乳腺癌先导化合物。
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这类吩嗪衍生物(cpul119，cpul129，cpul149)可以显著减弱乳腺癌细胞的干性而不影响细胞活力。cpul119、cpul129和cpul149可以通过与铁相互作用在溶酶体中积累和隔离铁，并通过调节参与铁运输和储存的蛋白(irp2、tfr1、铁蛋白)的表达来触发铁中毒。此外，抑制铁离子中毒可以减弱这类化合物对乳腺癌干细胞的抑制。本发明揭示cpul119、cpul129和cpul149可通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌细胞的干性，是一类极具潜力的治疗乳腺癌先导化合物。
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有益效果：本发明揭示cpul119、cpul129和cpul149可通过触发铁死亡特异性减弱乳腺癌细胞的干性，是一类极具潜力的治疗乳腺癌先导化合物。
附图说明
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图1为吩嗪衍生物cpul119、cpul129和cpul149处理48小时的mcf-7细胞中干细胞标记物(sox2、oct4、nanog和aldh1a1)表达的qpcr分析；
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图2为western blot分析中所述mcf-7细胞中干细胞标记物的蛋白表达；
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图3为通过伤口愈合分析，分别在使用或不使用cpul119、cpul129和cpul149治疗24小时和48小时的细胞中测量并量化迁移能力；
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图4为通过对mcf-7细胞进行转移侵袭分析，分析并量化其侵袭能力；
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图5为连续稀释mda-mb-231细胞并分别加入或不加入cpul119、cpul129或cpul149预处理时，获取的肿瘤图像及肿瘤形成率；
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图6为建立裸鼠肺转移模型。
具体实施方式
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实施例1：cpul119、cpul129和cpul149是抑制乳腺癌干细胞的化合物。
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通过mtt从实验室之前建立的吩嗪化合物库中筛选出能够特异性减弱乳腺癌细胞的干性而不影响细胞活力的潜在化合物。将mcf-7、mda-mb-231和mcf-7-adr细胞以3000-5000细胞/孔的密度接种到96孔板中。24小时后，加入不同浓度的cpul119、cpul129和cpul 149。48h后，在培养基中加入20μl 5mg/ml mtt，培养4h。然后除去培养基，并向每个孔中加入150μl dmso。震荡10分钟后，在bioradimark上分析490nm处的吸光度。如表1，结果发现9种化合物(w23、w24、w49、w53、cpul116、cpul124、cpul119、cpul129、cpul149)对乳腺癌细胞存活力的影响很小，选择它们进行进一步的研究。经qpcr和westernblot分析，如图1、图2，本发明发现三个吩嗪衍生物cpul119，cpul129，cpul149以浓度依赖的方式降低了干细胞标记物的蛋白表达，但对细胞的活力并无太大影响。在这三种化合物处理的细胞中，干细胞相关基因(如uca1，malat1)的转录分别受到抑制，且与干细胞分化相关的多条信号通路得到富集。此外，这三个化合物降低了具有干细胞性的cd44+/cd24-细胞亚群，显著抑制了乳腺癌细胞的乳腺成球能力。结果表明，化合物cpul119、cpul129和cpul149在体外具有抑制乳腺癌干细胞的作用。
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表1
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实施例2：吩嗪衍生物抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭
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mcf-7和mda-mb-231细胞接种到6孔板中，在培养基中培养直到生长到90％。然后在细胞表面形成一个伤口，用pbs洗涤两次，去除细胞碎片。细胞培养于低血清浓度(≤2％)含化合物或溶剂的培养基中。24h和48h后，在显微镜下观察创面。迁移率＝(d
t-d0)/d0，d
t
表示不同时间伤口之间的距离。如图3所示，这三个化合物分别处理24h和48h后，细胞的迁移能力受到抑制。48h后，乳腺癌细胞的侵袭能力也受到抑制(图4)。
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实施例3：吩嗪衍生物抑制乳腺癌细胞的耐药性
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将mcf-7、mda-mb-231和mcf-7-adr细胞以3000-5000细胞/孔的密度接种于96孔板。24h后，加入不同浓度的cpul119、cpul129和cpul 149及紫杉醇、阿霉素。孵育48h后，加入mtt 20μl(5mg/ml)，培养4h。然后移去培养基，每孔加入150μl dmso。震荡10分钟后，在biorad imark上分析490nm处的吸光度。与单独用紫杉醇或阿霉素处理的细胞相比，分别用cpul119、cpul129和cpul149处理的细胞ic
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值明显降低。结果表明，cpul119、cpul129和cpul149可以在体外抑制乳腺癌细胞的耐药性。
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实施例4：吩嗪衍生物在体内抑制乳腺癌细胞转移
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连续稀释mda-mb-231细胞并分别加入或不加入cpul119、cpul129或cpul149预处理时，获取肿瘤图像，并评估肿瘤形成率。如图5所示，cpul119、cpul129或cpul149预处理降低了细胞的致瘤能力，其特点是成瘤率和1/(干细胞频率)置信区间降低。
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实施例5：吩嗪衍生物在体内抑制乳腺癌细胞转移
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根据图6通过尾静脉注射mda-mb-231细胞构建了裸鼠肺转移模型。1周后，分别给予cpul119、cpul129和cpul149每3天尾静脉注射一次，一个月后处死。通过h&e染色分析，这三种化合物处理的小鼠与使用溶剂处理的对照组小鼠相比，肺转移结节更小更少。通过检测小鼠体重发现，使用这三种化合物的小鼠拥有更健康的表型。结果表明，cpul119、cpul129和cpul149在体内具有抑制乳腺癌干细胞及其转移的作用。
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实施例6：吩嗪衍生物在乳腺癌细胞的溶酶体中与铁相互作用并隔离铁
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用溶酶体探针(lysotracker)和线粒体探针(mitotracker)检测cpul119、cpul129和cpul149的定位，并分析共定位系数，评估cpul119、cpul129或cpul149与铁的共定位。结果表明，cpul119、cpul129和cpul149位于溶酶体中，少数也位于在线粒体中，而线粒体在氧化代谢中起关键作用，说明这三个化合物主要在溶酶体腔室中累积。此外，还发现cpul119、
cpul129和cpul149与铁相互作用，导致铁在溶酶体中聚集，而铁在未经处理的细胞胞浆中弥散。这些结果表明，cpul119、cpul129和cpul149能够与铁相互作用并诱导铁在溶酶体内聚集。
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实施例7：cpul119、cpul129和cpul149通过触发铁死亡抑制乳腺癌干细胞
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为了确定其他细胞死亡途径，包括通常参与溶酶体细胞死亡的坏死和凋亡，是否参与了这三个化合物介导的对乳腺癌细胞干细胞的抑制，分别在cpul119、cpul129和cpul149处理的细胞中添加ros清除剂nac、凋亡抑制剂z-vad-fmk、坏死抑制剂nec1、铁死亡抑制剂fer-1。结果表明，铁死亡抑制剂或ros清除剂nac可以减弱cpul119、cpul129或cpul149对干细胞标记物表达的抑制。为确定cpul119、cpul129或cpul149对乳腺癌干细胞的影响是否确实依赖于溶酶体功能或铁，将ca-074(溶酶体蛋白酶组织蛋白酶b的抑制剂)或铁螯合剂去铁胺(dfo)分别添加到这三个吩嗪衍生物处理的细胞中。结果显示，ca-074能减弱这三个化合物导致的脂质过氧化物的增加，而dfo能增强脂质过氧化物的增加。上述结果通过释放额外的可溶性氧化还原活性铁，将溶酶体降解铁蛋白与细胞器中活性氧的产生联系起来，从而抑制乳腺癌干细胞。将柠檬酸铁铵(fac)添加到乳腺癌细胞中以提高细胞铁浓度，结果表明fac确实促进了干细胞标记物和铁蛋白的表达，甚至逆转了cpul119、cpul129和cpul149对铁蛋白和干细胞标记物表达的影响。综上可得，cpul119、cpul129和cpul149通过隔离溶酶体中的铁来抑制乳腺癌干细胞，并触发铁死亡。