一种烟草凝集素在制备治疗肝病、急性肝损伤的药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药领域，涉及烟草凝集素的新用途，更具体地，涉及一种烟草凝集素在制备治疗肝病、急性肝损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.烟草凝集素(nictaba，nicotiana tabacum agglutinin)于2002年第一次从烟草叶子中被分离出来，属于烟草中产生的一种天然产物。其蛋白结构特征决定了其对于病毒病害、细菌病害和真菌病害的生理功能。其具有血红蛋白凝集作用，且其蛋白氨基酸序列具有结合多糖的结构域，因此对一些多糖类的内毒素具有抑制作用。
3.多种疾病及毒素均可引起急性肝损伤。病理上，急性肝损伤实际上是肝细胞实质严重急性损害的结果。具体表现为体重下降、肝指数异常、肝组织结构异常、血清中的ast和alt含量异常等等。
4.目前，急性肝损伤的最常见的治疗药物为中药,其次为解热镇痛药(nsaids)和抗生素。而中医药治疗主要分为单味中药研究和中药复方研究，单成分的应用效果研究较少，而烟草凝激素(nictaba)对急性肝损伤的治疗作用更是未见报道。
5.本发明的研究为肝病、急性肝损伤的治疗提供了理论依据和新的途径，有望成为肝病、急性肝损伤的新疗法，具有重要的科学意义与社会意义。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术中的缺陷和技术不足，提供一种烟草凝集素在制备治疗肝病、急性肝损伤的药物中的应用，属于烟草凝集素的新用途。
7.本发明的技术方案如下：
8.本发明首先提供一种烟草凝集素在制备治疗肝病的药物中的应用。
9.本发明还提供一种烟草凝集素在制备治疗急性肝损伤的药物中的应用。
10.进一步的，上述烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，所述烟草凝集素为烟草凝集素纯蛋白。该烟草凝集素纯蛋白表述为基因大小为510bp；重组蛋白中：表达产物约18kda，标签26kda，共44kda；所用烟草凝集素蛋白为生物工程生产，具体是以pgex-6p-1载体构建重组蛋白，插入位点bamhi xhoi，按照以下序列的所得重组蛋白。
11.基因序列：
12.ggatccatgcaaggtcagtggattgcagcacgtgatctgagcattacctgggttgataatccgcagtattggacctggaaaaccgttgatccgaatattgaagttgcagaactgcgtcgtgttgcatggctggatatttatggtaaaatcgaaaccaaaaacctgatccgcaaaaccagctatgcagtttatctggtttttaaactgaccgacaatccgcgtgaactggaacgtgcaaccgcaagcctgcgttttgttaatgaagttgccgaaggtgcaggtattgaaggcaccaccgtgtttattagcaaaaagaaagaactgcctggtgaactgggtcgttttccgcatctgcgtagcgatagctggctg
gaaattaaactgggtgaatttttcaataacctgggcgaagatggtgaagttgaaatgcgtctgatggaaatcaatgataaaacccgcaaaagcggcattatcgtgaaaggttttgatatccgtccgaattaactcgag。
13.进一步的，上述烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，所述烟草凝集素纯蛋白制备方法包括：步骤1感受态转化及阳性克隆筛选；步骤2阳性克隆小量表达与鉴定；步骤3蛋白大量表达及破菌检测。目的蛋白44kda，与诱导纯化后蛋白大小相符，认为蛋白表达纯化成功。
14.进一步的，上述烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，所述药物为恢复体重的药物。
15.进一步的，上述烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，所述药物为调节肝指数正常值的药物。
16.进一步的，上述烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，所述药物为调节血清ast和/或alt含量正常值的药物。
17.进一步的，上述烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，所述药物为恢复肝组织结构的药物。
18.进一步的，上述烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，所述药物制剂形式为丸剂、胶囊、口服液、乳剂、注射剂或缓释剂。
19.本发明相对现有技术具有以下有益效果：
20.本发明公开一种烟草凝集素在制备治疗肝病或者急性肝损伤的药物中的应用中，其采用单一成分烟草凝集素，特别是采用烟草凝集素纯蛋白应用于药物中，单成分的治疗应用规避了复合成分由于其他成分存在带来的治疗风险，因此具有极大的生产效益和创新。
21.本发明通过在动物试验中证实了烟草凝集素对急性肝损伤的各项指标的效果显著，为肝病、急性肝损伤的治疗提供了理论依据和新的途径，有望成为肝病、急性肝损伤的新疗法，具有重要的科学意义与社会意义，对节约社会资源有重大意义。
附图说明
22.图1烟草凝集素蛋白检测电泳图。
23.图2各组间小鼠平均体重的变化趋势图。
24.图3各组间小鼠肝指数差异比较。
25.图4各组间小鼠血清ast含量检测结果。
26.图5各组间小鼠血清alt含量检测结果。
27.图6各组间小鼠肝切片及he染色结果(肝组织结构)。
28.其中，图1为制备完烟草凝集素蛋白后的检测；图2至图6为通过动物试验证实烟草凝集素对急性肝损伤的各项功能指标的实验效果。
具体实施方式
29.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
30.除非特别说明，下述实施例中采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方
法和设备。
31.除非特别说明，下述实施例中所用试剂和材料均可从商业途径得到。
32.本文中使用的术语“治疗”，是指缓解、减轻、改善、或抑制(例如，阻止发展)受试者已经表现出的或曾经出现过的疾病，就某一具体疾病而言，“治疗”可以包括“治愈”该疾病，但大多数情况下并不需要完全消除其所有症状，例如，采用相关药物给药导致受试者至少一种症状减弱或消除，则可认为是对受试者进行了“治疗”。
33.实施例1烟草凝集素蛋白制备
34.1构建pgex-6p-1载体；插入位点bamhi xhoi；按照以下序列，烟草凝集素基因大小510bp；重组蛋白中基因表达产物约18kda，标签26kda，共44kda。
35.基因序列：
36.ggatccatgcaaggtcagtggattgcagcacgtgatctgagcattacctgggttgataatccgcagtattggacctggaaaaccgttgatccgaatattgaagttgcagaactgcgtcgtgttgcatggctggatatttatggtaaaatcgaaaccaaaaacctgatccgcaaaaccagctatgcagtttatctggtttttaaactgaccgacaatccgcgtgaactggaacgtgcaaccgcaagcctgcgttttgttaatgaagttgccgaaggtgcaggtattgaaggcaccaccgtgtttattagcaaaaagaaagaactgcctggtgaactgggtcgttttccgcatctgcgtagcgatagctggctggaaattaaactgggtgaatttttcaataacctgggcgaagatggtgaagttgaaatgcgtctgatggaaatcaatgataaaacccgcaaaagcggcattatcgtgaaaggttttgatatccgtccgaattaactcgag
37.2蛋白表达与分离纯化
38.2.1感受态转化及阳性克隆筛选
39.2.1.1从超低温冰箱中取出bl21感受态细胞，置于冰上融化；
40.2.1.2向30μl感受态细胞中加入质粒(2μl)，轻轻吹吸充分混匀，冰上放置30min；
41.2.1.3水浴锅42℃热击90s，冰上放置2min；
42.2.1.4加入200μllb液体培养基，37℃200rpm培养45min；
43.2.1.5轻柔混匀并吸取100μl菌液，均匀的滴在平皿(amp抗性)上，水平甩匀；
44.2.1.6倒置平板，37℃培养12～16h可见出现菌落(阳性克隆)。
45.2.2阳性克隆小量表达与鉴定
46.2.2.1挑选含重组质粒的单菌落至3ml lb液体培养基(amp抗性)中，37℃培养过夜后-20℃保种；
47.2.2.2分别挑选含重组质粒的单菌落至3ml lb液体培养基(amp抗性)中，37℃震荡培养至od600约0.6；
48.2.2.3取部分菌液作为对照组，余下菌液加入iptg诱导剂(终浓度1mm)，37℃震荡培养3h；
49.2.2.4分别取两组菌液0.15ml，12000
×
g离心2min，菌体沉淀以40μl 1
×
loading buffer重悬裂解，sds-page检测。
50.2.3蛋白大量表达及破菌检测
51.2.3.1挑选含重组质粒的单菌落至8ml lb液体培养基(amp抗性)中，37℃培养中震荡培养过夜；
52.2.3.2将8ml菌液接种于400ml lb液体培养基(amp抗性)中，37℃扩大培养至od600约0.6；
53.2.3.3加入iptg诱导剂至终浓度0.1mm，16℃继续震荡培养16h；
54.2.3.4 5000rpm离心5min收集菌体，重悬于40ml预冷gst平衡液中；
55.2.3.5超声破碎菌体，参数设置为功率200w、超声2.5s、暂停5s、80个循环；
56.2.3.6 10000rpm 4℃离心5min，收集上清以及沉淀；
57.2.3.7取少量上清及沉淀进行sds-page检测，剩余上清及沉淀至于4℃备用。
58.转化bl21感受态，挑选amp抗性平板上长出的阳性斑进行扩大培养与表达纯化。目的蛋白44kda，与诱导纯化后蛋白大小相符，认为蛋白表达纯化成功。
59.如1烟草凝集素蛋白检测电泳图所示，泳道后：诱导后；泳道p：破菌沉淀；泳道pre：上柱上清；泳道after：上柱流出液；泳道5：洗脱蛋白(预期融合蛋白为44kda，纯化蛋白为44kda,与预期相符)；泳道6：marker:m:200；140；110；75；55；42；30；23；18；10kda。
60.实施例2小鼠体重变化
61.1、材料：
62.1)动物：c57bl/6j，购自广东省医学实验动物中心，spf级，雄性，5周龄，许可证号：scxk(粤)2016-0041。实验开始前正常饲养一周。饲料购于江苏省协同医药生物工程有限责任公司spf级鼠料，许可证号：苏饲证(2019)01008。
63.2)蛋白：为上述实施例1表达的蛋白。
64.3)试剂：四氯化碳(macklin；56-23-5)；玉米油(试剂级macklin；8001-30-7)；多聚甲醛固定液(servicebio；g1101)；谷草转氨酶(ast)测试盒(南京建成；c010-2-1)；谷丙转氨酶(alt)测试盒(南京建成；c009-2-1)。
65.4)智能型独立通气笼ivc系统：型号：h6，苏州市苏杭科技器材有限公司生产
66.2、试验方法：
67.1)检疫与驯化
68.动物购入后，检疫5～7天。检疫合格的动物方可进入试验。
69.2)饲养条件
70.动物饲养于ivc盒内，每盒最多饲养同性别动物5只，温度控制在20～26℃，湿度控制在40～70％，动物照明12小时黑暗更替。
71.3)动物标记
72.动物接收时，采用耳标法对动物进行标记。
73.4)动物分组
74.动物检疫合格后，将动物随机分组为腹腔注射，分正常组、模型组和处理组(l-n蛋白＝1.5mg/kg和h-n蛋白＝3mg/kg，腹腔注射)，3重复。
75.5)动物造模
76.禁食12h后，除正常组外小鼠腹腔注射射30％的ccl4(溶于玉米油)，每只按8ul/g的量腹腔注射(第一次注射4ul/g，给药三天后采血检测ast和alt，结果显示模型组和实验组均已经恢复)造模。
77.6)动物取材(全程冰上解剖)：
78.给药三天后，禁食12h，眼球取血，取肝脏组织(解剖前最后一次称重)；血液自然静置30min后于4℃，2500rpm离心20min取上清液-80℃保存；肝脏组织取出用冷生理盐水清洗后，拍照并称重，便于评估肝脏指数及损伤情况，组织一半保存于福尔马林，一半分两部分
保存于-80℃冰箱，the liver index＝liver weight(g)/body weight(g)
×
100％；血清严格按照南京检测检测试剂盒说明书检测ast,alt水平评估损伤情况(kit)、肝脏指数、损伤肝脏he染色评估情况。
79.3、试验结果如下：
80.小鼠体重
81.如图2各组间小鼠平均体重的变化趋势图可以看出：实验初始阶段，各组小鼠间平均体重差异不大(对照组＝20.87g，模型组＝19.43g，l-n蛋白＝21.07g，h-n蛋白＝79.93g)。造模后，对照组的平均体重与其余各组平均体重差异增大明显(对照组＝22.8g，模型组＝18.93g，l-n蛋白＝20.3g，h-n蛋白＝19.7g)。与模型组相比较(体重＝17.07g)，第七天处理组给药后第八天体重有所恢复(l-n蛋白＝19.53g，h-n蛋白＝19.83g)，目测小鼠活力也有提升，说明烟草凝集素对急性肝损伤小鼠有积极作用。
82.实施例3小鼠肝指数
83.肝指数，一般的肝指数正常只是在0到40之间。一般都是检查谷丙转氨酶,它是检测肝功能的重要标准,如果这个是正常的话,那么说明肝脏没有炎症损伤。肝指数等于肝脏重量/体重。
84.该实施例其他步骤与实施例2相同，不同在于如图3小鼠肝指数测试结果显示：处理组(l-n蛋白肝指数5.21，h-n蛋白肝指数5.02)介于对照组(肝指数7.13)和模型组(肝指数4.60)之间，说明其对于肝功能恢复具有一定的作用。
85.实施例4：小鼠血清ast和alt含量检测
86.谷丙转氨酶(alt)和谷草转氨酶(ast)是检测肝功能的两个常用指标。alt与ast主要分布在肝脏的肝细胞内。正常值均为0～40国际单位。
87.该实施例与实施例2步骤相同，不同在于试验效果，如图4各组间小鼠血清ast含量检测结果看小鼠血清ast含量以及图5各组间小鼠血清alt含量检测结果看小鼠血清alt含量检测结果进一步证明了烟草凝集素对急性肝损伤具有良好的治疗作用。图4中，虽然烟草凝集素蛋白处理后，低浓度蛋白(l-n组，ast含量107.98u/l)和高浓度蛋白组(h-n组ast含量107.09u/l)均高于对照组(ast含量22.95u/l)，但却远远低于模型组(ast含量293.18u/l)。而图5中实验结果的趋势与图4相同，蛋白处理组(l-n和h-n)的alt含量(l-n为83.71u/l，h-n为75.44u/l)比对照组(alt含量9.38u/l)高，但远远低于模型组(alt含量219.57u/l)。
88.实验结果显示，虽然处理组的ast和alt含量值并不能完全恢复到正常值，但是相较于模型组，两项指标均得到缓解，其值均显著低于模型组。
89.实施例5：小鼠肝切片he染色
90.该实施例其他步骤与实施例2相同，不同在于如图6各组间小鼠肝切片及he染色结果中显示，与对照组正常肝组织相比，模型组肝组织结构重度异常，部分肝细胞毛玻璃样变，胞浆内充满嗜酸性细颗粒状物质，如白色箭头1所示；个别肝细胞坏死，未见明显细胞结构，如灰色箭头2所示；肝实质内还可见大量炎症细胞浸润，如黑色箭头3所示。处理组仅见少量残留炎症细胞，其他病变症状少见或没有。
91.本发明通过在动物试验中证实了烟草凝集素对急性肝损伤的各项指标的效果显著，为肝病、急性肝损伤的治疗提供了理论依据和新的途径，有望成为肝病、急性肝损伤的
新疗法，具有重要的科学意义与社会意义，对节约社会资源有重大意义。
92.本发明在制备治疗肝病、急性肝损伤的药物中，药物制剂形式可以为片剂、丸剂、胶囊、口服液、乳剂、注射剂或缓释剂等等任何一种。
93.本发明首次发现单一烟草凝集素对急性肝损伤就有显著的治疗效果，单成分的治疗应用规避了复合成分由于其他成分存在带来的治疗风险，决定了烟草凝集素及烟草凝集素蛋白在将来临床应用上的潜在治疗作用，具有极大的生产效益和创新。
94.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型本发明的范围由权利要求及其等同物限定、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。