用于防治焦虑抑郁症的直肠真杆菌（Eubacteriumrectale）

用于防治焦虑抑郁症的直肠真杆菌(eubacterium rectale)
技术领域
1.本发明属于微生物学领域，涉及一种直肠真杆菌(eubacterium rectale)菌株jcm1746，该菌株用于防治焦虑抑郁症及制备相关疾病药物。


背景技术：

2.抑郁症位居全球疾病负担的第三名，严重影响生活质量，发病率为3.1％左右，平均发病年龄在25岁左右。抑郁症作为一种障碍，是建立在功能障碍的基础上的，比如体验快感的能力下降，症状经常表现为多种形式和不同的症状组合，但由于这些症状也常出现在其他精神疾病中，使得它的识别和诊断标准并不统一。焦虑在抑郁症中很常见，几乎三分之二的重度抑郁症患者有临床焦虑，随着年龄的增长，焦虑症状成为重度抑郁症发作更明显的特征。目前还没有明确的模型可以全方位的解释抑郁症这个疾病，社会应激源和生物应激源都可能导致不同的发病机制。
3.压力生活事件在诱发和可能导致抑郁症中被发现有潜在作用。例如，在抑郁症发作前一年，压力生活事件的影响与抑郁症的发作有密切关系。成年人的压力生活事件包括威胁生命的事件、慢性疾病、经济上的不稳定、失业、丧亲和遭受暴力等。儿童时期的一些事件，如失去和忽视，这些也可能与成年时期面对压力生活事件时的抑郁倾向有关。例如，通过研究下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic
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pituitary
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adrenal axis,hpa)的变化，特别是糖皮质激素受体(gr，glucocorticoid receptor)功能，发现儿童早期创伤与晚年生活抑郁有关，童年早期的逆境会导致gr基因关键部位的dna甲基化。
4.治疗抑郁症的目标是完全缓解抑郁症状，目前的方法主要有心理治疗、药物治疗或两者兼用。在心理治疗中，认知行为疗法是使用最广泛的心理疗法，它教导抑郁症患者如何识别导致他们抑郁情绪的消极思维模式，尽可能地用更健康更积极的想法来取代它们。然而，在实践中，心理疗法的局限性是缺乏可用性，因为训练有素的治疗师很少，而且治疗费用昂贵。在药物治疗中，相关药物主要有：安非他酮(bupropion)、西酞普兰(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)等。抗抑郁药改善情绪的确切机制尚不清楚，但大多数作用于单胺能神经传递的抗抑郁药在突触内产生初始效应，然后影响细胞内的信号传递和第二信使途径，导致基因表达、神经发生和突触可塑性的改变，最终达到治疗的效果。尽管可用的治疗方法多种多样，但是相当大比例的患者对治疗没有充分反应，要么是部分反应，要么根本没有反应。例如，一项随机试验研究发现，四个治疗步骤后的累积缓解仍然只有67％。药物治疗还会有消化道症状、头痛头晕、肝毒性、高血压、失眠、性功能障碍等不良反应。另外，药物治疗对一些特殊人群并不适用，例如孕妇与儿童。因为儿童和青少年在生理和心理生理方面的发育差异以及有限的语言和经验，意味着他们可能会以不同的方式表达他们的痛苦，儿童和青少年应慎用抗抑郁药。
5.近年来，肠道菌群被发现与人体健康密切相关，例如肠易激综合征、肥胖症、心脏病等，特别是肠道菌群影响脑部的活动，例如压力、恐惧、认知等。越来越多的证据表明肠道微生物群不仅在调节宿主生理，特别是代谢和免疫方面的作用，而且还在中枢神经系统和
大脑功能方面发挥作用，例如鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)能够显著改善动物焦虑样行为、抑郁样行为、社会交互认知记忆等。鉴于肠道微生物组对中枢神经系统，特别是压力、情绪、焦虑和认知的潜在影响，将肠道微生物作为改善或治疗精神疾病的潜在手段具有重要的临床意义，应用前景具有广泛吸引力。然而，关于新精神益生菌的研究工作近年来鲜有报道。另外，目前与改善情绪相关的益生菌研究中还未见探究益生菌的预防作用，而预防作用对于长期经历生活压力的人们具有重要的意义。


技术实现要素：

6.为了解决以上技术问题，经过发明人的深入研究，发现直肠真杆菌(eubacterium rectale)具有防治焦虑抑郁样行为的作用，将直肠真杆菌(eubacterium rectale)灌胃实验对象，发现该菌能够抑制焦虑抑郁样行为，有效减轻精神疾病病症，因此适合开发缓解焦虑抑郁样药物。在此基础上完成本发明。
7.本发明的目的在于提供一株用于防治焦虑抑郁症的直肠真杆菌及用于制备相关疾病的药物，其特征在于，所述直肠真杆菌为eubacterium rectale，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，来源于jcm(japan collection of microorganisms)，保藏号为jcm 17463，用于制备防治焦虑抑郁症相关疾病药物中包含直肠真杆菌jcm 17463和/或其代谢产物，该药物中直肠真杆菌(eubacterium rectale)和/或其代谢产物的有效量为1
×
10
4-1
×
10
20
cfu/ml。
8.本发明所述直肠真杆菌是活细胞形式。
9.本发明所述的药物中直肠真杆菌jcm 17463和/或其代谢产物通过如下机制的至少一项来缓解焦虑抑郁症：
10.1)降低血清或脑组织中炎症因子含量；
11.2)降低血清中皮质酮含量；
12.3)升高短链脂肪酸含量；
13.4)降低肠道屏障通透性；
14.5)降低血脑屏障通透性。
15.本发明所述的直肠真杆菌(eubacterium rectale)用于制造缓解焦虑抑郁症的药物的用途所制得的药物，其特征在于，所述药物中含有有效量的直肠真杆菌(eubacterium rectale)和/或其代谢产物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
16.本发明所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括：颗粒剂、胶囊、片剂、粉末剂、口服液、混悬液、或乳剂等本领域常见的剂型。
17.本发明提供了直肠真杆菌在防治焦虑抑郁症方面的用途。实验对象接受慢性不可预刺激进行抑郁造模的同时摄入直肠真杆菌jcm17463，直肠真杆菌jcm17463具有抑制受验者焦虑抑郁样的行为。同时，经直肠真杆菌jcm17463治疗的抑郁大鼠与未接受治疗的抑郁大鼠相比，大鼠的焦虑抑郁样行为有明显改善。因此，所述菌株能够用以防治焦虑抑郁症。
18.本发明提供的直肠真杆菌jcm17463具有优秀的抗焦虑抑郁症的功能，可用于制备防治焦虑抑郁症的药物，为临床干预和控制焦虑抑郁症等精神疾病提供新的思路，具有良好的产业前景。
附图说明
19.图1显示了实验分组信息和处理步骤。
20.图2显示了大鼠行为学测试(高架十字迷宫实验)的比较结果。
21.图3显示了大鼠行为学测试(旷场实验)的比较结果。
22.图4显示了大鼠行为学测试(强迫游泳实验)的比较结果。
具体实施方式
23.本发明人经过广泛而深入的研究和实验发现，直肠真杆菌(eubacterium rectale)具有防治焦虑抑郁样行为的作用，将直肠真杆菌(eubacterium rectale)灌胃实验对象，发现该菌能够抑制焦虑抑郁样行为，有效减轻精神疾病病症。在此基础上完成本发明。
24.如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术语“直肠真杆菌”，“eubacterium rectale”可互换使用。
25.所述的直肠真杆菌的菌株为eubacterium rectale jcm17463,来源于jcm(japan collection of microorganisms)，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为jcm17463。
26.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
27.(一)实验材料
28.大鼠:spf级雄性sprague dawley(sd)大鼠购自北京斯贝福生物技术有限公司，6周龄，一共70只。全部大鼠生长过程处于同一环境，且喂养同样的无菌食物。
29.菌株：eubacterium rectale jcm17463，来源于jcm(japan collection of microorganisms)，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏号为jcm17463。
30.常规大鼠饲料:无菌大鼠饲料购自斯贝福生物技术有限公司。
31.(二)实验方案
32.1.实验设计
33.1)将大鼠置于同一环境正常适应性饲养1周后开始正式实验。
34.2)选取正常喂养的大鼠进行实验，通过行为学测试检测大鼠焦虑样和抑郁样行为，通过灌胃法为大鼠肠道引入eubacterium rectale jcm17463。
35.3)本实施例分2个阶段：第1阶段为预防实验阶段，第2阶段为治疗实验阶段。
36.4)第1阶段大鼠被随机分成3组,实验周期为4周，第1阶段结束后每组随机选取10只大鼠进行行为学测试检验大鼠焦虑样和抑郁样行为，剩余的大鼠进入第2阶段的治疗实验。第一阶段大鼠每组具体分组如下：
37.对照组(free-1，n＝20)：大鼠正常饲养4周，不接受任何处理，而且不受其它组的影响。
38.慢性不可预刺激组(cums，n＝40)：大鼠接受4周的慢性不可预轻度刺激。
39.慢性不可预刺激+eubacterium rectale jcm17463菌株组(cums+e.r，n＝10)：大
鼠接受4周的慢性不可预轻度刺激的同时灌胃4周eubacterium rectale jcm17463菌液。
40.5)第二阶段大鼠被随机分成4组，实验周期为4周，第2阶段结束后大鼠进行行为学测试检验大鼠焦虑样和抑郁样行为，每组具体分组如下：
41.对照组(free-2，n＝10)：大鼠正常饲养4周，不做任何处理，而且不受其他组的影响。
42.灌胃生理盐水组(control，n＝10)：大鼠接受4周的慢性不可预刺激后灌胃4周生理盐水。
43.灌胃氟西汀组(flx，n＝10)：大鼠接受4周的慢性不可预轻度刺激后灌胃4周抗抑郁药氟西汀。
44.灌胃eubacterium rectale jcm17463菌株组(e.r，n＝10)：大鼠接受4周的慢性不可预刺激后灌胃4周eubacterium rectale jcm17463菌。
45.2.eubacterium rectale jcm17463菌株厌氧培养
46.eubacterium rectale菌株于厌氧工作站(bactron，shellab bac ii)中37℃培养2-3天，所使用的培养基为m2gsc培养基：casitone,10g/l,solarbio,china；yeast extract,2.5g/l,thermo fisher,usa；nahco3,4.0g/l,sigma,usa；glucose,2.0g/l,beijing chemical works,beijing,china；soluble starch,2.0g/l,xilong scientific,beijing,china；cellobiose,2.0g/l,thermo fisher,usa；rumen fluid(clarified),10g/l,wiz biotech,china；resazurin(0.1％w/w),1.0ml/l,thermo fisher,usa；cysteine hcl,1.0g/l,innochem,beijing,china；k2hpo4,0.45g/l,innochem,beijing,china；kh2po4,0.45g/l,beijing chemical works,beijing,china；(nh4)2so4,0.9g/l,guanghua sci-tech,guangdong,china；nacl,0.9g/l,beijing chemical works,beijing,china；mgso4,0.09g/l,beijing chemical works,beijing,china；cacl2,0.09g/l,beijing chemical works,beijing,china。每只大鼠灌胃菌液浓度为1
×
109cfu/ml，灌胃体积为1ml/只，频率为每天一次。菌液提前培养，每周活化保证新鲜，并分别测定浓度。
47.3.慢性不可预刺激
48.大鼠接受4周的慢性不可预刺激：(1)禁食24小时；(2)禁水24小时；(3)摇晃1小时(160r.p.m)；(4)夹尾1分钟；(5)冷水游泳(4℃，5分钟)；(6)昼夜颠倒；(7)50℃热应激。7种不可预刺激随机安排在1周，每天随机安排其中2种。未接受慢性不可预轻度刺激的大鼠按照常规饲养，保证不受其它组的影响。
49.4.行为学测试
50.为观察研究实验动物神经精神变化，进行了一系列的行为学测试，方法与过程如下：
51.1)旷场测试
52.旷场实验测试用于评估动物的焦虑样行为，通过测试动物在新奇开放环境下的自发性活动和探索行为，可用于评价其焦虑程度。将大鼠置于开放式设备(50
×
50
×
45cm)中心，让大鼠适应一分钟，然后使用ethovision软件(noldus,tracksys,nottingham,uk)记录5分钟自发活动。较低的中央区域(距边缘50％)停留时间和进入中央区域次数作为焦虑样行为的指标。每只大鼠测试结束后放回饲养笼具内，同时清理设备，并用75％的乙醇擦拭内壁及底面以消除大鼠大小便及气味等对后继实验动物的影响。
53.2)高架十字迷宫测试
54.高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。将大鼠引入四壁迷宫的中央区域，头朝开臂，此后每只大鼠均放在同一位置，两个开放臂(50
×
10cm)没有墙壁，两个闭合臂(50
×
10
×
30cm)有墙壁，迷宫高出地面一米。在迷宫正上方的摄像机被用来跟踪每只大鼠的运动，并用ethovision软件(noldus,tracksys,nottingham,uk)记录5分钟内大鼠在开放臂的停留时间，以及进入开放臂的次数。较低的进入开放臂的频率和停留时间作为焦虑表现指标。每次实验后用70％乙醇清洗迷宫以消除大鼠大小便及气味等对后继实验大鼠的影响。
55.3)强迫游泳测试
56.强迫游泳实验用于评估动物抑郁样行为，其原理是当动物被放进一个有限的空间使之游泳，开始时拼命游泳力图逃脱，很快就变成漂浮不动状态，仅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶尔划动以保持身体不至于沉下去，实际是动物放弃逃脱的希望，属于行为绝望。将大鼠置于装有30cm高度水(25℃左右)的透明塑料桶(40
×
70cm)中，让大鼠适应一分钟，然后记录大鼠5分钟内的静止时间。静止是指动物保持头部在水面上没有额外的运动。静止时间作为大鼠抑郁样行为的表现指标。每次测试均更换一次实验用水以消除大鼠大小便及气味等对后继实验大鼠的影响。
57.实验结果
58.1.大鼠行为学测试(高架十字迷宫)比较结果见图2
59.预防实验中，相比对照组(free-1)，cums组大鼠进入开放臂的次数有下降的趋势(图2b，p＝0.062,f
(2，27)
＝5.86)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生焦虑样行为。而相比cums组，给予直肠真杆菌组(cums+e.r)大鼠在开放臂的停留时间(图2a，p《0.001,f
(2，27)
＝54.23)与进入开放臂的次数(图2b，p＝0.00204,f
(2，27)
＝5.86)都显著增加，表明直肠真杆菌可以预防大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样行为。
60.治疗实验中，相比对照组(free-2)，control组大鼠在开放臂的停留时间有下降的趋势(图2c，p＝0.095,f
(3，35)
＝1.61)，进入开放臂的次数显著下降(图2d，p《0.001,f
(3，35)
＝5.37)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生焦虑样行为。相比control组大鼠，给予直肠真杆菌组(e.r)大鼠在开放臂的停留时间显著增加(图2c，p＝0.049,f
(3，35)
＝1.61)，表明直肠真杆菌可以治疗缓解大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样行为。
61.2.大鼠行为学测试(旷场实验)比较结果见图3
62.预防实验中，相比对照组(free-1)，cums组大鼠在中央区域的停留时间(图3a，p《0.001,f
(2，26)
＝24.61)和进入中央区域的次数(图3b，p《0.001,f
(2，26)
＝9.74)都显著下降。治疗实验中，相比对照组(free-2)，control组大鼠在中央区域的停留时间(图3c，p＝0.011,f
(3，33)
＝3.87)和进入中央区域的次数(图3d，p＝0.0059,f
(3，34)
＝3.71)都显著下降，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生焦虑样行为。而相比control组，给予直肠真杆菌的大鼠(cums+e.r)在中央区域的停留时间显著增加(图3a，p《0.001,f
(2，26)
＝24.61)，进入中央区域的次数有增加的趋势(图3b，p＝0.078,f
(2，26)
＝9.74)，表明直肠真杆菌可以预防大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样行为。
63.3.大鼠行为学测试(强迫游泳实验)比较结果见图4
64.预防实验中，相比对照组(free-1)，cums组大鼠的不动时间显著增加(图4a，p＝
0.022,f
(2，27)
＝3.54)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生抑郁样行为。而相比cums组，给予直肠真杆菌(cums+e.r)显著降低了大鼠的不动时间(图4a，p＝0.0401,f
(2，27)
＝3.54)，表明直肠真杆菌可以预防大鼠因慢性不可预刺激诱导的抑郁样行为。
65.治疗实验中，相比对照组(free-2)，control组大鼠的不动时间显著增加(图4b，p《0.001,f
(3，35)
＝38.86)，表明慢性不可预刺激使得大鼠产生抑郁样行为。而相比control组，给予直肠真杆菌(e.r)显著降低了大鼠的不动时间(图4b，p《0.001,f
(3，35)
＝38.86)，表明直肠真杆菌可以治疗缓解大鼠因慢性不可预刺激诱导的抑郁样行为。
66.结论
67.总之，上述研究结果首次证明了，直肠真杆菌jcm1746可预防和治疗大鼠因慢性不可预刺激诱导的焦虑样和抑郁样行为。本结果为直肠真杆菌jcm1746在作为制备防治抑郁症和焦虑症药物中的应用提供了强有力的实验支撑。
68.本技术提供一株具有改善焦虑抑郁症的eubacterium rectale jcm17463。本技术以sd大鼠为实验对象，证明直肠真杆菌jcm17463具有改善焦虑抑郁症的作用。
69.应当理解的是，本技术并不局限于上面已经描述的菌液浓度和/菌株。本技术的范围仅由所附的权利要求来限制。