COX-2抑制剂与化疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用

cox-2抑制剂与化疗药物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，更具体地说是涉及cox-2抑制剂与化疗药物联用在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。


背景技术：

2.乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁女性生命健康，因易侵袭，易耐药，致死率高，是临床治疗的难点，目前，临床治疗普遍以化疗和放疗为主。研究发现乳腺癌细胞与肿瘤微环境(tme)中的免疫或基质细胞之间的动态相互作用在化疗抵抗中扮演重要角色，促进了肿瘤的发展，侵袭和转移。这种复杂的免疫抑制肿瘤微环境是乳腺癌治疗成功的主要障碍。
3.近年来，基于重塑免疫抑制肿瘤微环境(itm)的抗肿瘤免疫疗法受到广泛关注。其中高表达的骨髓来源性抑制细胞(mdscs)在itm中发挥极其重要的作用。它通过依赖活性氧(ros)的产生，导致细胞毒性t淋巴细胞耐受；并通过过表达精氨酸酶1、tgf、il-10以及促进免疫抑制调节性t细胞(regulatorytcells,tregs)发育和积累间接抑制t淋巴细胞功能，同时分化为免疫抑制肿瘤相关巨噬细胞(tams)，阻碍抗肿瘤免疫应答。因此mdscs被认为是肿瘤免疫治疗的重要靶点，抑制它的增殖和瘤内积累，能有效调控itm提高抗肿瘤功效。有趣的是，研究发现化疗药物吉西他滨(gem)，除了通过化疗直接杀伤肿瘤细胞外，已被证明它还能选择性的消耗荷瘤小鼠体内的mdscs，解除mdscs的免疫抑制功能，提高cd8
+
t细胞抗肿瘤活性。
4.另外值得关注的是，mdsc产生大量ros诱导免疫耐受的过程高度依赖环氧合酶-2(cox-2)的活性。cox-2是催化花生四烯酸合成前列腺素2(pge2)的限速酶，pge2通过调节下游靶点控制细胞增殖、血管生成和免疫抑制从而支持肿瘤进展。此外，高表达的cox-2会阻断树突细胞(dcs)迁移，招募免疫抑制细胞，并通过上调c-x-c趋化因子配体12(cxcl12)增加t细胞和肿瘤细胞之间的屏障。这提示cox-2也是调节itm的有利靶点，抑制cox-2/pge2通路可能会显著改善itm，为进一步有效杀死肿瘤细胞扫除障碍。
5.基于以上研究背景以及单一药物治疗存在理化性质差、生物利用度低、疗效不佳等缺陷，若化疗药物可以联合cox-2的特异性抑制，则可以提高肿瘤效果，基于两药在抗肿瘤作用机制之间的互补协同，通过双靶向肿瘤细胞和mdscs细胞有效逆转itm，实现化疗-免疫协同增强抗肿瘤功效。然而，如何实现理化性质截然不同的两个小分子药物能在体内高效的精准共递送至肿瘤细胞和mdscs细胞是化疗联合免疫成功治疗乳腺癌的前提和关键。
6.近年来，无载体小分子双前药自组装纳米递药系统在实现联用药物高效共递送、精准协同治疗领域作出了重大贡献。与载体辅助纳米粒相比，无载体纳米粒具有制备工艺简单、载药能力强、药物生物利用度高，避免不可估量的载体潜在毒性等显著的优势。
7.基于以上优势，联用药物能被精准共递送至肿瘤细胞。然而，期望实现理想的联合抗肿瘤功效，如何确保药物的有效释放和肿瘤蓄积是需要解决的另一关键问题。
8.因此，如何将化疗药物与cox-2抑制剂联用应用在抗肿瘤药物中，并确保药物的有
效释放和肿瘤蓄积是本领域技术人员亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

9.有鉴于此，本发明选择cox-2的特异性抑制剂联用化疗药物，通过两亲性小分子双前药纳米粒实现双靶向肿瘤细胞和mdscs细胞协同调控免疫抑制肿瘤微环境。
10.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
11.cox-2抑制剂与化疗药物联用在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括：乳腺癌、肺癌和卵巢癌。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护cox-2抑制剂与化疗药物组成的小分子双前药在制备药物传递系统中的应用，其中，所述药物为抗肿瘤药物，所述肿瘤包括：乳腺癌、肺癌和卵巢癌。
13.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护cox-2抑制剂与化疗药物组成的小分子双前药纳米粒在制备药物传递系统中的应用，其中，所述药物为抗肿瘤药物，所述肿瘤包括：乳腺癌、肺癌和卵巢癌。.
14.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种确保抗肿瘤药物有效释放和肿瘤蓄积的小分子双前药，原料组成包括：cox-2抑制剂、酸酐和化疗药物。
15.作为上述技术方案优选的技术方案，所述cox-2抑制剂包括塞来昔布(cxb)或罗非昔布(rxb)；所述化疗药包括盐酸伊立替康(ir)吉西他滨(gem)、紫杉醇(ptx)或者其他含有活性氨基或羟基的抗肿瘤药物所述酸酐为草酸酐、己二酸酐和丁二酸酐中的任意一种；
16.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种确保抗肿瘤药物有效释放和肿瘤蓄积的小分子双前药的制备方法，包括下述过程：先将cox-2抑制剂与酸酐化学催化得到中间体，然后将化疗药物与中间体进一步反应得到两亲性小分子双前药。
17.作为上述技术方案优选的技术方案，cox-2抑制剂与酸酐化学催化得到中间体的过程为：将cox-2抑制剂、酸酐、dmap按照1:1～4:0.02～0.1的摩尔比溶解于有机溶剂1中，在n2保护的条件下置于40℃～90℃油浴中磁力搅拌反应12～30h，得反应液，将反应液沉淀到盐酸水溶液中继续搅拌，并用有机溶剂1萃取反应液，合并有机层并用氯化钠溶液洗涤，干燥、浓缩、分离、纯化获得中间体；
18.将化疗药物与中间体进一步反应得到两亲性小分子双前药的过程为：将中间体、dmap、化疗药物溶于有机溶剂1中，冰浴条件下缓慢加入edci，在n2保护下4℃～30℃磁力搅拌反应12～36h；反应结束后采用有机溶剂1萃取，经氯化钠溶液洗涤，收集有机层并浓缩、分离纯化、真空干燥后制备得到产物cxb-gem两亲性小分子双前药；其中，中间体、dmap、化疗药物和edci的摩尔比1:0.05～0.2:1～2.5:0.8～1.5；
19.所述有机溶剂1为无水吡啶、无水四氢呋喃、无水n,n二甲基甲酰胺、无水二氧六环、无水二氯甲烷、乙酸乙酯中的任意一种。
20.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种确保抗肿瘤药物有效释放和肿瘤蓄积的小分子双前药纳米粒，由所述的小分子双前药在低速磁力搅拌下自组装而成。
21.作为上述技术方案优选的技术方案，过程包括：
22.将两亲性小分子双前药溶解于有机溶剂2中，得溶液，并将该溶液逐滴滴加到溶液
a中，在低速磁力搅拌下挥发有机溶剂2，两亲性小分子双前药自组装形成大小均一的纳米粒。
23.作为上述技术方案优选的技术方案，，所述有机溶剂2为甲醇、乙醇、丙酮、四氢呋喃、二氧六环、吡啶中的任意一种；所述溶液a为ph7.4的磷酸盐缓冲液、hepes溶液、水中的任意一种。
24.经由上述的技术方案可知，本发明发现了化疗药物和cox-2抑制剂在治疗肿瘤方面具有协同作用，两种溶液混合可有效抑制乳腺癌4t1细胞增殖的活力，且两药的物理混合物的作用均强于任意单一游离溶液；而且，本发明首次发现化疗药物和cox-2抑制剂组成的两亲性小分子双前药可以自组装形成均匀的纳米粒。
25.本发明的具体效果如下：
26.1)设计合成了cxb-gem两亲性小分子双前药，合成方法简单易操作；
27.2)制备了粒径均一的cxb-gem纳米粒，其制备工艺简单易行；
28.3)以cxb溶液和gem溶液作为对照，制备的cxb-gem纳米粒具有显著的抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡的能力；
29.4)所制备的cxb-gem纳米粒呈现良好的抗肿瘤效果和抑制肿瘤肺转移的优势。
30.综上所述，本发明的小分子双前药纳米粒克服了载体结构复杂，载体毒性大，生物相容性差等缺陷，通过考察其制剂学特性及体内外抗肿瘤功效，研究cxb-gem纳米粒在高效、同步、精准、共递送理化性质截然不同的两个小分子药物至肿瘤细胞和mdscs细胞，并在细胞内水解酶和低ph环境响应下裂解胶束释放药物，实现化疗-免疫联合治疗乳腺癌的优势。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
32.图1为本发明所述的cxb-gem纳米粒的粒径和透射电镜图；
33.图2为本发明所述的cxb-gem纳米粒的体外释放图；
34.图3为本发明所述的cxb-gem纳米粒的制剂毒结果图；
35.图4为本发明所述的cxb-gem纳米粒诱导4t1细胞凋亡图；
36.图5为本发明所述的cxb-gem纳米粒的体内抗肿瘤药效学结果图。
37.图6为本发明所述的cxb-gem纳米粒抑制肿瘤肺转移结果图。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.实施例1：cxb与sa反应成酰胺得到cxb中间体的合成
40.将cxb(0.025mmol)、sa(0.075mmol)、dmap(0.002mmol)溶解于乙酸乙酯中，在n2保护的条件下置于40℃～90℃油浴中磁力搅拌反应12～30h，停止反应，将反应液沉淀到盐酸水溶液中继续搅拌，并用乙酸乙酯萃取该反应液，合并有机层用氯化钠溶液洗涤后在硫酸镁上进行干燥，浓缩之后采用硅胶柱层析法分离并纯化获得cxb中间体，如式i所示；
[0041][0042]
实施例2cxb-gem两亲性小分子双前药的合成
[0043]
将cxb中间体(4.157mmol)、dmap(0.425mmol)、gem(5.56mmol)溶于乙酸乙酯中，冰浴条件下缓慢加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(edci，5.37mmol)，在n2保护的气氛下4℃～30℃磁力搅拌反应12～36h。反应结束后采用乙酸乙酯萃取，经氯化钠溶液洗涤，收集有机层并浓缩，进一步采用硅胶柱层析法分离纯化，真空干燥后最终制备得到产物cxb-gem两亲性小分子双前药，如式ii所示；
[0044][0045]
实施例3rxb与sa反应成酰胺得到rxb-sa中间体的合成
[0046]
将rxb(0.035mmol)、sa(0.055mmol)、dmap(0.008mmol)溶解于乙酸乙酯中，在n2保护的条件下置于40℃～90℃油浴中磁力搅拌反应12～36h，停止反应，将反应液沉淀到盐酸水溶液中继续搅拌，并用乙酸乙酯萃取该反应液，合并有机层用氯化钠溶液洗涤后在硫酸镁上进行干燥，浓缩之后采用硅胶柱层析法分离并纯化获得rxb-sa中间体。
[0047]
实施例4rxb-gem两亲性小分子双前药的合成
[0048]
将rxb中间体(4.162mmol)、dmap(0.434mmol)、gem(5.54mmol)溶于乙酸乙酯中，冰浴条件下缓慢加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(5.51mmol)，在n2保护的气氛下4℃～30℃磁力搅拌反应12～36h。反应结束后采用乙酸乙酯萃取，经氯化钠溶液洗涤，收集有机层并浓缩，进一步采用硅胶柱层析法分离纯化，真空干燥后最终制备得到产物rxb-gem两亲性小分子双前药。
[0049]
实施例5cxb-ir两亲性小分子双前药的合成
[0050]
将cxb中间体(4.145mmol)、dmap(0.436mmol)、ir(5.52mmol)溶于乙酸乙酯中，冰
浴条件下缓慢加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(5.38mmol)，在n2保护的气氛下4℃～30℃磁力搅拌反应12～36h。反应结束后采用乙酸乙酯萃取，经氯化钠溶液洗涤，收集有机层并浓缩，进一步采用硅胶柱层析法分离纯化，真空干燥后最终制备得到产物cxb-ir两亲性小分子双前药。
[0051]
实施例6cxb-gem纳米粒的制备
[0052]
称取5mgcxb-gem两亲性小分子双前药溶解于0.5ml甲醇中，在搅拌的条件下将其逐滴滴加到5ml去离子水中，低速搅拌过夜挥发溶剂，使其自组装形成大小均一的纳米粒。
[0053]
通过动态光散射粒径测定仪和透射电子显微镜测定实施例3中制备的cxb-gem纳米粒的粒径和外观形态，结果如图1，表明制备的cxb-gem纳米粒为粒径较小，大小均一的球形粒子。
[0054]
实施例7rxb-gem纳米粒的制备
[0055]
称取5mgrxb-gem两亲性小分子双前药溶解于0.5ml甲醇中，在搅拌的条件下将其逐滴滴加到5ml去离子水中，低速搅拌过夜挥发溶剂，使其自组装形成大小均一的纳米粒。
[0056]
实施例8cxb-ir纳米粒的制备
[0057]
称取5mgcxb-ir两亲性小分子双前药溶解于0.5ml甲醇中，在搅拌的条件下将其逐滴滴加到5ml去离子水中，低速搅拌过夜挥发溶剂，使其自组装形成大小均一的纳米粒。
[0058]
实施例9cxb-gem纳米粒的体外释放实验。
[0059]
肿瘤细胞溶酶体内ph接近5.0并且富含多种水解酶，能够促进酯键或酰胺键断裂。因此，以ph7.4和ph5.0的磷酸盐缓冲液为释放介质体外模拟生理环境和肿瘤微环境，考察cxb-gem纳米粒中药物的释放情况。将2ml纳米粒溶液置于透析袋中，放入50mlph7.4和ph5.0释放介质中，设置gem溶液和cxb溶液为游离药物对照组，在37℃摇床中震荡，于设定的时间点取样并添加等量的新鲜介质，通过高效液相色谱测定gem和cxb的浓度。
[0060]
结果如图2所示，在两种释放介质中，游离的cxb和gem溶液均能在较短时间快速释放药物，相比较游离溶液组，cxb-gem纳米粒在ph7.4介质中仅仅不到10％的药物被释放。在ph5.0介质中药物的释放提高了4倍，表明cxb-gem纳米粒体外释放药物具有ph相应性。这是由于cxb-gem纳米粒中的酯键和酰胺键在酸性条件下更容易断裂触发药物释放。与快速释放药物的游离溶液相比，纳米粒缓释的效果，能够显著延长药物的作用时间。
[0061]
实施例10cxb-gem纳米粒的细胞制剂毒研究
[0062]
采用mtt法考察了cxb-gem纳米粒对乳腺癌4t1细胞的毒性。将乳腺癌4t1细胞接种到96孔细胞培养板中，放置于细胞培养箱中孵育过夜，弃去旧培养液，然后给予用新鲜培养基稀释的不同浓度的cxb溶液、gem溶液、cxb和gem的物理混合物溶液、cxb-gem纳米粒溶液。孵育72h，每孔加入浓度为2mg/ml的mtt溶液50μl，孵育4h后。移液枪吸去旧的培养液，每孔加入100μldmso。采用酶标仪于490nm下测定od值，计算细胞活力。
[0063]
结果如图3所示，cxb溶液、gem溶液均具有一定程度的抑制乳腺癌4t1细胞增殖的活力，且两药的物理混合物的作用均强于任意单一游离溶液组，这说明两药联合能够协同杀伤肿瘤细胞，为两种药物的联用提供了依据。另外可以明显看出相比较物理混合物，cxb-gem纳米粒的细胞增殖抑制能力最强，呈现明显的抗肿瘤优势。
[0064]
实施例11cxb-gem纳米粒诱导mdscs细胞凋亡研究
[0065]
按照以下方法采用流式细胞分选技术从4t1荷瘤小鼠脾脏中分选出mdscs。首先取
balb/c小鼠皮下接种生长状态良好的4t1细胞，待肿瘤体积长至500mm3，小鼠于超净台中被处死并解剖取出脾脏，研磨过滤，加入红细胞裂解液裂解，离心，清洗，加入apc-cd11b和pe-gr-1抗体染色，并用预冷的pbs洗涤后，再加入pbs重悬后，立即采用流式细胞仪进行细胞分选获得mdscs。将mdscs接种在六孔细胞培养板内，置于细胞培养箱中孵育过夜，弃去旧培养液，然后给予用新鲜培养基稀释的cxb溶液(3.75μg/ml)、gem溶液(2.5μg/ml)、cxb和gem的物理混合物溶液、cxb-gem纳米粒溶液。继续孵育24h后，采用annexinv-fitc/pi凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检测不同药物诱导mdscs细胞凋亡的能力。
[0066]
结果如图4所示，cxb溶液和gem溶液分别诱导6.9％和9.9％的mdscs细胞凋亡，相比之下，两者的物理混合物诱导凋亡的能力较强，但cxb-gem纳米粒可诱导44％的细胞凋亡，呈现出最强的体外诱导mdscs细胞凋亡的能力，有利于cxb-gem纳米粒在体内有效共递送cxb和gem至mdscs细胞，增强两药联合调控肿瘤免疫抑制微环境发挥协同抗肿瘤的功效。
[0067]
实施例12cxb-gem纳米粒的体内抗肿瘤药效学研究。
[0068]
取雌性babl/c小鼠(18-22g)，皮下注射4t1细胞建立肿瘤模型。待肿瘤体积长至50mm3，随机分为五组，即生理盐水组，cxb溶液、gem溶液、cxb和gem的物理混合物溶液、cxb-gem纳米粒溶液。于0、3、6天给药，并记录小鼠肿瘤体积大小和体重。给药后21天每组各处死2只小鼠，取出肿瘤进行拍照，同时，记录剩余小鼠的肿瘤体积大小、体重和存活天数，硏究纳米粒的体内抗肿瘤作用。当肿瘤体积长至1000mm3左右，即认为其死亡，处死小鼠。
[0069]
结果如图5所示，肿瘤拍照直观的看出，相比较生理盐水组，两个游离药物溶液组均能抑制肿瘤体积增长，且物理混合物的抑制作用更好，但是相比于物理混合物组，cxb-gem纳米粒对肿瘤体积的抑制能力最强，治疗后小鼠肿瘤最小，并显著延长了小鼠的存活期。这表明cxb-gem纳米粒能高效共递送两种药物至肿瘤部位，并在肿瘤细胞和mdscs中释放药物，通过化疗-免疫联合调控肿瘤免疫抑制微环境，发挥最佳的抗肿瘤功效。另外药物治疗后监测小鼠的体重没有明显的下降，说明cxb-gem纳米粒具有良好的体内生物安全性，是可以有效治疗乳腺癌的纳米递送系统。
[0070]
实施例13cxb-gem纳米粒的体内抑制肺转移的研究。
[0071]
将效果例4中给药后21天的荷瘤小鼠每组各处死1只，取出肺组织用生理盐水冲洗干净，采用bouin's固定液进行固定，无水乙醇脱色后拍照，观察肺部肿瘤转移结节的数量。
[0072]
结果如图6所示，生理盐水组处理后小鼠肺部出现大量的肿瘤转移结节，这表明了乳腺癌具有肺转移的特性。采用不同药物治疗后，肺部结节逐渐减少，其中cxb-gem纳米粒治疗后小鼠的肺转移结节最少，呈现显著的抑制肿瘤肺转移的能力，这与药效学结果保持一致。
[0073]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0074]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。