具有X射线激发光动力效应的生物活性钛基材料及其制备方法与应用

具有x射线激发光动力效应的生物活性钛基材料及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于生物医学工程技术领域，涉及生物医用钛基材料，具体涉及具有x射线激发 光动力效应的生物活性钛基材料及其制备方法与应用。


背景技术：

2.光动力疗法是一种新的疾病治疗技术，只需要光敏剂，氧和光。光激发光敏剂，光敏 剂将能量传递给周围的氧，从而产生活性很强的活性氧，杀死或者损伤癌细胞以达到治疗 的目的。光动力疗法和传统放疗相比由于其低侵袭性和低毒性，无抗药性等优点近年来得 到了广泛关注和研究。目前的光敏剂需要采用可见光或者近红外光激发，而可见光或者近 红外光的穿透深度极其有限仅有(1～5mm)，且能量低对深层恶性肿瘤无法有效发挥治疗效 果。基于可见光或者近红外光的穿透深度极其有限，在光源的选择上此处选取了能量更大， 穿透效果极好的x射线作为光动力疗法的激发光源。
[0003][0004]
将x射线作为光动力的激发光源下，x射线作为放射线虽然对肿瘤细胞具有较直接的 杀死和抑制效果，但是它依然对人体的正常组织存在较大的毒副作用，并且在放疗过程中， 由于肿瘤的低氧环境，使得单独的放疗无法彻底根除肿瘤细胞，反而使肿瘤对x射线产生 耐受，对放疗逐渐不敏感。
[0005]
因此，设计合成一种新材料作为光敏剂，并将x射线作为光源，在x射线的激发下材 料产生光动力疗法，光动力疗法与射线辐照所产生的放疗达到协同治疗肿瘤的效果，有望 推动临床抗肿瘤新药的发展。


技术实现要素：

[0006]
针对光动力治疗中光敏剂存在的性能不稳定、治疗效果不易控制等问题，本发明的目 的旨在提供一种生物活性钛基材料及其制备方法，所制备的生物活性钛基材料具有x射线 激发光动力效应。
[0007]
本发明的另一目的旨在提供生物活性钛基材料在用作光动力治疗中光敏剂的用途。
[0008]
本发明的第三个目的旨在提供生物活性钛基材料在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0009]
为达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现。
[0010]
本发明提供的具有x射线激发光动力效应的生物活性钛基材料，其包括生物医用钛基 材料及其表面二氧化钛涂层；所述生物医用钛基材料为生物医用钛金属(这里即是指纯钛) 或生物医用钛合金。所述二氧化钛涂层为包含结晶态的金红石和锐钛矿两种晶相的二氧化 钛。
[0011]
本发明提供的具有x射线激发光动力效应的生物活性钛基材料的制备方法，是以生物 医用钛基材料作为基底材料，固定在直流电源阳极上，以酸性溶液为电解液，通过阳
极氧 化的方法在生物医用钛基材料获得一层二氧化钛，具体包括以下步骤：
[0012]
s1将生物医用钛基材料固定在直流电源阳极上，并以纯钛条作为阴极，在0.1-10m的 酸性电解液中，于直流电压30-100v、环境温度0-100℃，对阳极生物医用钛基材料表面进 行氧化，阳极氧化处理时间为0.1-10min；
[0013]
s2阳极氧化处理结束后，对生物医用钛基材料进行清洗、干燥即得具有x射线激发光 动力效应的生物活性钛基材料。
[0014]
上述步骤s1中，是通过阳极氧化的方法在生物医用钛基材料表面获得一层能够在x摄 像激发下具有光动力效应的二氧化钛涂层。生物医用钛基材料为生物医用钛金属(这里即 是指纯钛)或生物医用钛合金。在使用之前，作为阳极的所述生物医用钛基材料及作为阴 极的生物医用钛金属均需要进行打磨和清洗，去除表面杂质及氧化物：首先可以使用180 目、400目、600目、800目、1200目中的至少一种水砂纸在磨片机上对作为阳极的所述生 物医用钛基材料及作为阴极的生物医用钛金属进行打磨，然后依次使用石油醚、丙酮、乙 醇和水进行超声清洗，每种溶剂洗涤2-5次，每次洗涤5-30min；这里的水可以为超纯水、 去离子水或蒸馏水。
[0015]
上述步骤s1中，酸性电解液为硫酸溶液，其是由浓硫酸用水稀释得到，这里的水可以 为超纯水、去离子水或蒸馏水。酸性电解液的使用量按照至少淹没生物医用钛基材料来计 量。
[0016]
上述步骤s1中，阳极氧化的处理时间太长，材料表面会出现严重的烧熔现象；阳极氧 化的直流电压较低时，无法获得具有良好生物活性的均匀多孔表面结构；优选实现方式中， 直流电压为60-80v。
[0017]
上述步骤s1中，当环境温度因电解反应放热过高时，需要对酸性电解液进行降温。
[0018]
上述步骤s2中，可以直接使用水对生物医用钛基材料进行清洗，去除表面残留的酸溶 液。清洗后的生物医用钛基材料于低于100℃烘箱中烘干或晾干即可。
[0019]
本发明进一步提供了上述生物活性钛基材料的用途，用作光动力治疗中光敏剂。上述 生物活性钛基材料在x射线照射下可以产生活性氧，因此可以用作基于x射线的光动力治 疗中光敏剂；也可以进一步与加入其它辅料(例如人工合成的斑蝥素及其衍生物)或其它 光敏剂(例如卟啉类光敏剂)一起制备光动力治疗治疗中的光敏剂。
[0020]
本发明进一步提供了上述生物活性钛基材料作为光动力治疗中光敏剂在制备抗肿瘤药 物中的应用。由于该生物活性钛基材料可以用作光敏剂，因此可以用于制备抗肿瘤药物。 所述肿瘤为实体瘤，包括人骨肉瘤、人软骨肉瘤等。
[0021]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0022]
1、本发明所制备的生物活性钛基材料是在生物医用钛金属或生物医用钛合金表面生长 二氧化钛涂层，由于其具有较好的x射线激发光动力效应，能被x射线诱导产生活性氧， 实现协同的光动力效果，可以用作光动力治疗中的光敏剂，因此其可应用于生物医学领域， 可有效抑制实体瘤(如骨肉瘤)肿瘤组织的生长。
[0023]
2、本发明所制备的生物活性钛基材料表面的二氧化钛涂层，能够有效地抑制基底钛基 材料中有害元素的释放，同时具有较好的结合强度，在植入体内后，不易发生涂层的剥离。
物医用钛金属在磨片机上将钛基材料逐级打磨，去除样品表层杂质及氧化物，再依次使用 石油醚、丙酮、乙醇和超纯水进行超声清洗，每种溶液清洗2次，每次20min，之后将清洗 后的生物医用钛金属置于烘箱中于60℃干燥0.5h。
[0038]
本实施例使用的酸性电解液位1l浓度为1m的硫酸水溶液。
[0039]
上述具有x射线激发光动力效应的生物活性钛基材料的制备步骤如下：
[0040]
s1将生物医用钛金属固定在直流电源阳极上，并以纯钛条(购自日本新星的纯钛，钛 含量99.999％，长15cm宽1cm的长条状)作为阴极，在1l、浓度为1m的酸性电解液中， 于直流电压70v、环境温度36℃，对阳极生物医用钛金属表面进行氧化，阳极氧化处理时 间为1min；
[0041]
s2阳极氧化处理结束后，使用超纯水对处理后的生物医用钛金属进行清洗、去除表面 残留的酸溶液，然后置于烘箱中于60℃干燥0.5h，即得具有x射线激发光动力效应的生物 活性钛基材料。
[0042]
实施例3
[0043]
本实施例以尺寸为直径1.5cm的圆片状的生物医用钛合金tc4(购自佳润金属材料有 限公司，铁含量≤0.30％，碳含量≤0.10％，氮含量≤0.05％，氢含量≤0.015％，氧含量≤0.20％， 铝含量5.5％-6.75％，钒含量3.5～4.5％，余量为钛)作为生物医用钛基材料制备具有x射线 激发光动力效应的生物活性钛基材料。使用前，依次用180目、400目、600目、800目、 1200目的水砂纸对待用生物医用钛合金在磨片机上将钛基材料逐级打磨，去除样品表层杂 质及氧化物，再依次使用石油醚、丙酮、乙醇和超纯水进行超声清洗，每种溶液清洗2次， 每次20min，之后将清洗后的生物医用钛合金置于烘箱中于60℃干燥0.5h。
[0044]
本实施例使用的酸性电解液位1l浓度为1m的硫酸溶液。
[0045]
上述具有x射线激发光动力效应的生物活性钛基材料的制备步骤如下：
[0046]
s1将生物医用钛合金固定在直流电源阳极上，并以纯钛条(购自日本新星的纯钛，钛 含量99.999％，长15cm宽1cm的长条状)作为阴极，在1l、浓度为1m的酸性电解液中， 于直流电压70v、环境温度36℃，对阳极生物医用钛合金表面进行氧化，阳极氧化处理时 间为1min；
[0047]
s2阳极氧化处理结束后，使用超纯水对生物医用钛合金进行清洗、去除表面残留的酸 溶液，然后置于烘箱中于60℃干燥0.5h，即得具有x射线激发光动力效应的生物活性钛基 材料。
[0048]
实施例4
[0049]
本实施例以尺寸为直径1.5cm的圆片状的生物医用钛金属(购自日本新星的生物医用 纯钛，钛含量99.999％)作为生物医用钛基材料制备具有x射线激发光动力效应的生物活 性钛基材料。使用前，依次用180目、400目、600目、800目、1200目的水砂纸对待用生 物医用钛金属在磨片机上将钛基材料逐级打磨，去除样品表层杂质及氧化物，再依次使用 石油醚、丙酮、乙醇和超纯水进行超声清洗，每种溶液清洗5次，每次5min，之后将清洗 后的生物医用钛金属置于烘箱中于60℃干燥0.5h。
[0050]
本实施例使用的酸性电解液位1l浓度为10m的硫酸溶液。
[0051]
上述具有x射线激发光动力效应的生物活性钛基材料的制备步骤如下：
[0052]
s1将生物医用钛金属固定在直流电源阳极上，并以纯钛条(购自日本新星的纯钛，
钛 含量99.999％，长15cm宽1cm的长条状)作为阴极，在1l、浓度为10m的酸性电解液中， 于直流电压30v、环境温度0℃，对阳极生物医用钛金属表面进行氧化，阳极氧化处理时间 为10min；
[0053]
s2阳极氧化处理结束后，使用超纯水对处理后的生物医用钛金属进行清洗、去除表面 残留的酸溶液，然后置于烘箱中于60℃干燥0.5h，即得具有x射线激发光动力效应的生物 活性钛基材料。
[0054]
下面对以上实施例制备的生物活性钛基材料结构进行分析。
[0055]
对实施例2制备的生物活性钛基材料进行sem测试，测试结果如图1所示。从图中可 以看出，所制备的生物活性钛基材料形成了多孔的表面。表面的微孔大小相对一致，分布 相对均匀。
[0056]
对实施例2制备的生物活性钛基材料表面涂层进行xrd测试，测试结果如图2所示， 从图2中可以看出，生物活性钛基材料表面涂层物相成分为金红石型(rutile)二氧化钛和 锐钛矿型(anatase)二氧化钛。
[0057]
应用例1
[0058]
在6孔板中加入15ml浓度为2.5mg/l的亚甲基蓝水溶液(mb，购自中国阿拉丁有 限公司)，并在孔中分别放入实施例2制备的阳极氧化样品生物活性钛基材料和纯钛。然 后用辐照仪进行x射线照射，x射线辐照剂量分别为2gy(1min)，6gy(3min)，10gy (5min)。之后用分光光度计(uv-2550)在664nm处测定mb溶液的吸光度。最后， 通过g＝[(a0-at)/a0]计算光降解率g；其中，a0是亚甲基蓝的初始吸光度，at是亚甲 基蓝在时间t的吸光度，亚甲基蓝的降解率越高，说明材料在辐照后产生的羟基自由基越 多，羟基自由基属于活性氧中的一种，即产生的活性氧含量越多，结果如图3所示。从图3 中可以看出阳极氧化材料实验组的亚甲基蓝降解率显著升高，表明通过阳极氧化表面处理 的材料能够显著提升羟基自由基含量，也即活性氧的含量。
[0059]
应用例2
[0060]
以人骨肉瘤细胞系mg63细胞为测试细胞系(细胞购自中国科学院上海生命科学研究 所细胞资源中心)。细胞培养方法：取出液氮中冻存的mg63细胞，在37℃的温水中解冻， 将细胞悬液移入1.5ml离心管中，置于离心机中，1500rpm离心5min，弃去上清液，加 入1ml dmem完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加9ml dmem 完全培养液，将培养皿置于5％co2、37℃培养箱中培养。
[0061]
细胞内ros生成量测定方法：将mg63细胞以1
×
105个细胞/孔的密度接种到24孔培 养板中，培养24h后，更换培养液为含10％胎牛血清fbs的培养基(胎牛血清产自gemini； dmem培养基产自hyclone)，分别加入纯钛和实施例2制备的阳极氧化材料生物活性钛 基材料，不加材料的孔设为空白对照组。之后用0.9％nacl溶液清洗3次，再向每孔加入1 ml含有ros染料探针(ros染料探针购自上海碧云天，货号s0033)的不含fbs的dmem 培养基(ros染料探针的最终浓度为10μmol/l)。然后将24孔板用x射线照射5min，辐 照剂量为10gy。其后，将24孔板置于5％co2、37℃恒温培养箱中持续培养20min。然后 用0.9％nacl溶液清洗3次，用不含edta的胰蛋白酶消化并收集细胞。用倒置荧光显微 镜检测不同实验组中的平均荧光强度，测试结果如图4所示。从图4中可以看出，实施例2 提供的阳极氧化材料生物活性钛基材料表面上的细胞内ros的生成量显著增高，表明通过 阳极氧化表面处理的材料能够显
著提升光动力治疗效果，增加细胞内ros的产生量。进而 表明，本发明提供的生物活性钛基材料可以用作光动力治疗中的光敏剂。
[0062]
应用例3
[0063]
细胞毒性实验：细胞培养方法如应用例2中所述。将mg63细胞以1
×
105个细胞/孔的 密度接种到24孔培养板中，培养24h后，更换培养液为新鲜血清培养液，分别加入纯钛和 实施例2制备的阳极氧化材料生物活性钛基材料，不加材料的孔设为空白对照。将24孔板 用x射线照射5min，辐照剂量为10gy。辐照后再孵育24h，之后离弃孔中培养基，每孔 加100μl mtt溶液，培养箱中放置4h。而后每孔加入150μl dmso，振摇20min至紫色 甲瓒溶解，使用酶标仪测定每孔490nm处的紫外吸光值(a)，按照以下公式计算：细胞 存活率％＝(试验组平均a值/空白对照组平均a值)
×
100％。实验结果如图5所示。从图 5中可以看出，x射线辐照后的阳极氧化材料生物活性钛基材料对细胞的毒性分别显著高于 单纯x射线辐照后和x射线辐照后的纯钛材料，表明阳极氧化对材料的修饰(即生物医用 钛基材表面形成的二氧化钛)能够显著提升材料光动力治疗效果，增加钛基材料对于肿瘤 细胞的细胞毒性。因此，本发明提供的生物活性钛基材料可作为制备抗肿瘤药物的候选材 料。
[0064]
本领域的普通技术人员将会意识到，这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的 原理，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通 技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体 变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。