CapilliposideA及其同系物在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用

capilliposide a及其同系物在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及capilliposide a(以下简称lc-a)及其同系物在制备治疗类风湿关节炎药物的应用。


背景技术：

2.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是一种慢性自身免疫疾病，是炎性关节炎最常见的临床表现形式。ra作为疾病致残的主要原因之一，是全球人民健康的长期威胁。据统计，全世界有0.5-1％的人口受到ra困扰。在我国，ra的发病几率为0.34％左右，每年有5百万ra新增确诊病例。ra的发病机制十分复杂尚不明确，这部分归因于它的异质性，即不同的生理病理因素最终激活共同的炎症通路，导致患者有相似的关节炎临床表现。类风湿关节炎常有炎症因子水平升高、滑膜异常增生发生，患者会出现四肢关节疼痛、肿胀、手指关节晨僵等症状。当疾病发展到晚期，ra患者的关节软骨和滑膜会遭受不可逆的破坏。除了直接对关节造成损伤之外，也有报道发现ra进一步增加了患者的合并症风险，包括心血管疾病、骨质疏松性骨折和恶性肿瘤等疾病。有研究表明，相比于正常人，男性和女性ra患者的预期寿命分别降低了7年和3年。目前，ra尚无有效的根治手段或者特效药。
3.lc-a及其同系物是具有13,28-环氧结构的齐墩果烷类三萜皂苷，是天然植物细梗香草中具有抗肿瘤作用的一类化合物，但对于其能否对ra起到治疗作用未见有相关研究。


技术实现要素：

4.本发明公开了lc-a及其同系物在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。
5.本发明采用以下技术方案实现：capilliposidea及其同系物在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用，capilliposide a及其同系物的化合物结构如式(1)所示，其中，r表示烷基、烯基、酰氧基或糖基。
[0006][0007]
优选的，capilliposide a同系物优选自capilliposide a(r＝-h)、capilliposide b[r＝-co(ch2)4ch3]、capilliposide c[r＝-coch2ch2(ch3)2]或capilliposide d(r＝-glu)中的一种或几种。
[0008]
本发明所述的lc-a及其同系物能够减轻类风湿关节炎红肿症状，减少关节组织的炎性细胞浸润，改善关节软骨和滑膜病变，提高关节的活动状态，抑制tnf-α和il-6以及一氧化氮等炎症因子的释放，降低erk1/2蛋白和nf-κ b p65蛋白的磷酸化水平。
[0009]
本发明所述的lc-a及其同系物治疗类风湿关节炎药物的有效剂量是0.01毫克/公斤体重到1000毫克/公斤体重，优选的0.1毫克/公斤体重到500毫克/公斤体重，最好是1毫克/公斤体重到200毫克/公斤体重。
[0010]
本发明所述的药物是以capilliposidea及其同系物为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料制备而成。
[0011]
优选的，所述的药物是口服制剂。
[0012]
优选的，所述的药物是外用制剂。
[0013]
本发明的有益效果在于：
[0014]
本发明提供了一种治疗类风湿关节炎的天然药物，能够减轻类风湿关节炎红肿症状，减少关节组织的炎性细胞浸润，改善关节软骨和滑膜病变，提高关节的活动状态，而且毒副作用小。
附图说明
[0015]
图1为对炎症因子水平的抑制作用；
[0016]
图2为对erk1/2蛋白和nf-κb p65蛋白的磷酸化水平的影响；
[0017]
图3为day21大鼠后足照片；
[0018]
图4为不同时间的大鼠后足体积；
[0019]
图5为大鼠踝关节x射线图像；图中
“→”
指示处关节连接不紧密，软骨表面粗糙；
[0020]
图6为大鼠踝关节切片h&e染色图；图中指示处成纤维细胞侵入了软骨内部和关节腔；
[0021]
图7为大鼠体重数据和脏器指数。
具体实施方式
[0022]
下面结合附图和具体实施例进一步阐述本发明。
[0023]
本发明提供了lc-a(capilliposide a)及其同系物在制备治疗类风湿关节炎药物中的应用。
[0024]
本发明还提供了lc-a及其同系物为活性成分，采用药剂学上可接受的工艺和辅料制备而成的制剂。
[0025]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
[0026]
实施例1
[0027]
在96孔板中接种巨噬细胞raw264.7，密度为每孔1
×
104细胞。细胞贴壁后，加药处理，加药量均不高于40um。细胞分为对照组、模型组、lc-a低剂量组，lc-a高剂量组，对照组加溶剂dmem培养基处理，模型组用含5μg/ml lps的培养基处理，低剂量组用含5μg/ml lps和20μm lc-a的培养基处理，高剂量组用含5μg/ml lps和30μm lc-a的培养基处理，以上所
指浓度均为终浓度。处理24h后，取培养基上清液，用griess试剂检测一氧化氮含量，用酶联免疫吸附试剂盒检测炎症因子tnf-α和il-6浓度。结果如图1所示。lc-a显著抑制了lps导致的tnf-α和il-6以及一氧化氮等炎症因子的释放。
[0028]
实施例2
[0029]
在6孔板中接种巨噬细胞raw264.7，密度为1
×
106cell/well，轻晃使细胞分布均匀后，放入细胞培养箱培养24h，使细胞贴壁后，加药处理，加药量均不高于40um。对照组加溶剂dmem培养基处理，模型组用含1μg/ml lps的培养基处理，低剂量组用含1μg/ml lps和10μm lc-a的培养基共处理，高剂量组用含1μg/ml lps和20μm lc-a的培养基共处理，以上所指浓度均为终浓度。处理24h后，用ripa裂解液(含蛋白酶抑制剂pmsf)裂解细胞，并用bca试剂盒将细胞蛋白裂解液定量为蛋白浓度1μg/μl的含上样缓冲液的蛋白样品。利用western blotting法测定lc-a处理后的erk1/2和nf-κb p65蛋白的磷酸化水平，结果表明lc-a降低了erk1/2蛋白和nf-κb p65蛋白的磷酸化水平，见图2。
[0030]
实施例3
[0031]
选取6周龄大鼠，分为对照组，模型组，lc-a低剂量组，lc-a中剂量组，lc-a高剂量组。在适应性喂养后，对照组在尾部根部皮下注射0.2ml生理盐水，模型组和给药组在尾部根部皮下注射不完全弗式佐剂1∶l乳化的牛ii型胶原0.2ml，记为day0。day7时进行加强免疫，对照组在尾部根部1.5cm处皮下注射0.2ml生理盐水，模型组和给药组注射完全弗式佐剂1∶1乳化的牛ii型胶原0.2ml。从day8开始，每日给大鼠灌胃给药，灌胃体积为1ml/100g体重，连续给药14天，lc-a用质量比为0.5％cmc-na的生理盐水溶液配制。对照组和模型组灌胃质量体积比为0.5％cmc-na的生理盐水溶液，lc-a低剂量组灌胃给药20mg/kg lc-a，中剂量组灌胃40mg/kg lc-a，高剂量组灌胃80mg/kg lc-a。给药后，每日用电子体重秤测定大鼠的体重；以隔天拍摄大鼠后足照片的形式监控大鼠类风湿关节炎外观特征；隔天以排水法测量大鼠后足体积(操作如下：在50ml离心管中加入一定量的纯水，在管壁上水面位置处做标记；将被测大鼠的后足浸没于水中，直至水面没至大鼠的足迹毛发线处，待水面位置稳定后，在管壁上做标记。测定两标记之间相差的水的质量m，水的密度为ρ，则水的体积根据公式汁算得出，水的体积即为大鼠后足体积。)。day22时给药终了，每鼠腹腔注射质量体积比为10％水合氯醛溶液1ml，麻醉大鼠后，颈椎错位法处死大鼠，取左右后足踝关节，新鲜大鼠踝关节在ivis spectrumct仪器中x射线成像，获得大鼠踝关节重建图像；大鼠踝关节用质量体积比为4％多聚甲醛组织固定液固定完全后，浸泡于质量体积比为10％乙二胺四乙酸二钠的pbs溶液中，放置于37℃摇床中摇动脱钙，直到脱钙完全。踝关节组织冲洗去除脱钙液，去除多余表皮和肌肉组织，依次用体积分数75％乙醇、体积分数85％乙醇、体积分数95％乙醇i、体积分数95％乙醇ii、无水乙醇i、无水乙醇ii、二甲苯i、二甲苯ii脱水透明处理，随后在63℃石蜡中浸蜡，用融化的石蜡将组织包埋并固定在组织包埋盒中，冷却制备成石蜡组织块，用石蜡切片机切取厚度为6μm的踝关节断面组织切片，进行苏木素&伊红染色。将组织切片依次用二甲苯i、二甲苯ii、无水乙醇、体积分数95％乙醇、体积分数85％乙醇、体积分数75％乙醇、纯水脱蜡复水处理，随后用苏木素染液、纯水、分化液、纯水、伊红染液、纯水i、纯水ii染色处理，再用体积分数95％乙醇i、体积分数95％乙醇ii、无水乙醇i、无水乙醇ii、二甲苯i、二甲苯ii脱水透明封片，用扫片机获取高清晰度的大鼠踝关节断面切
片染色图。取肝、脾、左肾、右肾，称重计算脏器指数。
[0032]
实验结果：
[0033]
1、从day10开始模型组大鼠后足踝关节出现皮肤发红、足爪肿胀，表现出非常明显的类风湿关节炎症状；day21时，模型组的大鼠类风湿关节炎症状明显，后足踝关节、足趾关节部位表面皮肤发红，足趾无法自然伸展开，出现组织肿胀肥厚的特征，也可观察到症状严重的大鼠在鼠笼中匍匐爬行，后足运动能力严重受限。相比于模型组，lc-a低、中、高剂量给药组大鼠的红肿症状均得到了明显的缓解，足趾能够伸开，并且未观察到大鼠运动能力的衰减。表明lc-a对大鼠类风湿关节炎症状有明显改善作用，结果见图3中的(a)和(b)图。
[0034]
2、从day10开始模型组的大鼠后足体积相比正常组开始出现明显增大，在day14左右达到高峰，相比day0时大鼠后足的体积平均增大了50％左右，并维持至实验结束。lc-a低、中和高剂量组大鼠的后足体积和正常对照组相近，说明lc-a减轻了类风湿关节炎模型大鼠后足肿胀度，结果见图4。
[0035]
3、踝关节x射线成像结果见图5，可见正常组大鼠左右后足的踝关节软骨表面光滑清晰，胫骨和距骨、距骨和足舟骨、根骨之间啮合紧密，没有骨侵蚀现象。模型组大鼠踝关节连接不紧密，滑膜表面显得粗糙，且大部分跖骨的弯曲程度高于正常组，表明ra引起了骨侵蚀和足部周围组织肿胀。在lc-a给药组中，骨侵蚀现象得到了缓解，关节的连接处紧密整齐，接近正常对照组，跖骨的扭曲变形程度和模型组相比也有一定的改善。
[0036]
4、踝关节切片h&e染色图结果见图6，可见正常对照组大鼠的踝关节软骨表面光滑，关节腔内无明显异物，且关节连接处分界清晰；模型组的大鼠则可以看到有较多成纤维细胞(图中红色三角指出)侵入了软骨内部和滑膜，滑膜表面呈明显的“毛刺状”，不平整。lc-a给药组关节软骨的侵蚀现象明显轻于模型组，说明lc-a对类风湿性关节炎关节软骨具有显著的保护作用。
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5、大鼠体重数据和脏器指数见图7中的(a)和(b)图，结果显示，和正常组、模型组大鼠相比，lc-a低、中、高剂量给药组的大鼠体重未发生降低现象，脏器指数无明显变化，表明lc-a有较好的安全性。
[0038]
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。