一种人参根对肺癌小鼠移植瘤生长的影响的研究方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人参根对肺癌小鼠移植瘤生长的影响的研究方法。


背景技术：

2.肺癌是当今世界对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其中非小细胞肺癌约占所有肺癌的85％，且对化疗药物不敏感，而大部分肺癌确诊时已属于中晚期，寻找预防和治疗肺癌的药品已成为迫切需要。人参根中的人参皂苷包含rh2、rg、rg1、rg2、rg3、rg5，rh2具有抑制癌细胞向其它器官转移，增强机体免疫力，快速恢复体质的作用。对癌细胞具有明显的抗转移作用，可配合手术服用增强手术后伤口的愈合及体力的恢复。人体吸收率在16％，最高含量在16.2％；rg具有兴奋中枢神经，抗疲劳、改善记忆与学习能力、促进dna、rna合成的作用；rg1可快速缓解疲劳、改善学习记忆、延缓衰老，具有兴奋中枢神经作用、抑制血小板凝集作用；rg2具有抗休克作用，快速改善心肌缺血和缺氧，治疗和预防冠心病；rg3可作用于细胞生殖周期的g2期，抑制癌细胞有丝分裂前期蛋白质和atp的合成，使癌细胞的增殖生长速度减慢，并且具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等作用；rg5具有抑制癌细胞浸润、抗肿瘤细胞转移、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长的功能。因此本文提供一种人参根对肺癌小鼠移植瘤生长的影响的研究方法，验证人参根对肺癌的影响。而在本研究领域目前多利用实验鼠进行人参根治疗骨质疏松的研究。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种人参根对肺癌小鼠移植瘤生长的影响的研究方法，以解决上述背景技术中提出的问题。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种人参根对肺癌小鼠移植瘤生长的影响的研究方法，具体包括以下步骤：
4.步骤1、细胞培养；用75％乙醇擦拭冻存管外壁。将冻存管中细胞移至含5ml培养液的离心管中，1000rpm离心5min；弃上清，底部细胞用5ml培养液吹吸均匀，移入培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养2-3天；将培养瓶从培养箱中取出，置倒置显微镜下观察细胞覆盖率，达到贴壁面积的80％-90％进行传代；将培养瓶中培养液倒出，沿细胞未贴壁一侧加入1mlpbs，横置摇晃10s倒出，再加入1ml胰酶，横置1min后观察细胞应为悬浮状态；加入2ml培养液终止消化，并吸取培养瓶中培养液冲洗贴壁一侧，冲洗完毕后转移至离心管中，5min、1000rpm离心；弃上清，底部细胞用2ml培养液吹吸均匀，均匀移入两个含4ml培养液的培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养2-3天；对培养后的细胞进行细胞计数；
5.步骤2、动物模型建立：按照细胞传代步骤消化、离心、弃上清，用pbs配成密度5x107个/ml的细胞悬液；取60只spf级icr雄性小鼠皮下注射接种用细胞悬液0.1ml，即每只小鼠接种细胞数为5x106个/只；10只spf级icr雄性小鼠皮下注射pbs磷酸盐缓冲液0.1ml；
6.步骤3、动物分组及给药：建模后小鼠随机分为人参根饮液治疗组、吉非替尼组、模
型组，每组20只；空白组10只，人参根饮液预防组小鼠20只；人参根饮液治疗组以30倍浓缩的饮液9.88ml/kg
·
d灌胃，吉非替尼组0.0325g/kg
·
d灌胃，模型组、空白组以纯净水灌胃，灌胃剂量均为0.2ml，连续灌胃18天；人参根饮液预防组以自由摄取方式提前给药34天，平均每只小鼠摄取量相当于人每天饮用24瓶，第35天皮下接种肺癌细胞悬液，继续给药；
7.步骤4、评价指标：包括外观观察、肿瘤体积、相对肿瘤增殖率、体质量、胸腺指数及脾指数、细胞因子il-6、tnf-α含量；
8.步骤5、结果分析。
9.优选的，所述步骤1中细胞计数的具体方法为：95％乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面；用滴管吸取0.4％台盼蓝染液，按1:1比例加入细胞悬液中；从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中；等待3min，将计数板放在显微镜下观察计数。计算计数板的四角大方格内的细胞数；计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数；在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞；两次重复计数误差不应超过
±
5％；镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞；细胞悬液细胞数/ml＝4大格细胞总数/4
×
10000。
10.优选的，所述步骤4中外观观察具体包括：小鼠健康状况、精神状态、食欲、运动、毛发、大便及肿瘤生长情况。
11.优选的，所述步骤4中肿瘤体积的计算公式为tv＝1/2ab2，其中a为长径，b为短径。
12.优选的，所述步骤4中相对肿瘤增殖率的测定方法为：根据肿瘤体积计算相对肿瘤体积(rtv)，rtv＝vt/v0，其中v0为分组给药前(即d0)的肿瘤体积，vt为每次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率(t/c)，即给药组rtv与模型对照组rtv比值的百分比(t/c＝trtv/crtv
×
100％)，t/c＞60％为无效，≤60％并经统计学处理p＜0.05为有效。
13.优选的，所述步骤4中细胞因子il-6、tnf-α含量的测量方法为：小鼠摘眼球取血，血静置1-2h，离心，取血清，试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定每组小鼠血清中il-6(白细胞介素6)、采用竞争法检测肿瘤坏死因子(tnf-α)的含量。
14.本发明的技术效果和优点：本发明提供了一种有效的验证人参根对肺癌肿瘤细胞具有抑制作用的方法，对后续的人参皂苷用于抑制肿瘤细胞的使用提供了基础。
附图说明
15.图1为实施例中给药前后小鼠体重示意图。
具体实施方式
16.为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
17.实施例
18.一种人参根对肺癌小鼠移植瘤生长的影响的研究方法，具体包括以下步骤：
19.1.细胞培养
20.将细胞冻存管从-80℃中取出，迅速置于37℃中水浴，直至冻存管中无结晶，用75％乙醇擦拭冻存管外壁。将冻存管中细胞移至含5ml培养液的离心管中，1000rpm离心5min。弃上清，底部细胞用5ml培养液吹吸均匀，移入培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养2-3天。将培养瓶从培养箱中取出，置倒置显微镜下观察细胞覆盖率，达到贴壁面积的80％-90％进行传代。将培养瓶中培养液倒出，沿细胞未贴壁一侧加入1ml pbs，横置摇晃10s倒出，再加入1ml胰酶，横置1min后观察细胞应为悬浮状态。加入2ml培养液终止消化，并吸取培养瓶中培养液冲洗贴壁一侧，冲洗完毕后转移至离心管中，5min、1000rpm离心。弃上清，底部细胞用2ml培养液吹吸均匀，均匀移入两个含4ml培养液的培养瓶中，置于37℃、5％co2培养箱中培养2-3天。
21.细胞计数，用95％乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张，把盖片覆在计数板上面。用滴管吸取0.4％台盼蓝染液，按1:1比例加入细胞悬液中。从计数板边缘缓缓滴入，使之充满计数板和盖片之间的空隙中。注意不要使液体流到旁边的凹槽中或带有气泡，否则要重做。等待3min，将计数板放在显微镜下观察计数。计算计数板的四角大方格(每个大方格又分16个小方格)内的细胞数。计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。在一个大方格中，如果有细胞位于线上，一般计下线细胞不计上线细胞，计左线细胞不计右线细胞。两次重复计数误差不应超过
±
5％。镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。细胞悬液细胞数/ml＝4大格细胞总数/4
×
10000。
22.2、动物模型建立
23.按照细胞传代步骤消化、离心、弃上清，用pbs配成密度5x107个/ml的细胞悬液。60只spf级icr雄性小鼠皮下注射接种用细胞悬液0.1ml，即每只小鼠接种细胞数为5x106个/只。10只spf级icr雄性小鼠皮下注射pbs磷酸盐缓冲液0.1ml。
24.3、动物分组及给药
25.建模后小鼠随机分为人参根饮液治疗组、吉非替尼组、模型组，每组20只；空白组10只，人参根饮液预防组小鼠20只。人参根饮液治疗组以30倍浓缩(相当于人每天饮用24瓶)的饮液9.88ml/kg
·
d灌胃，吉非替尼组0.0325g/kg
·
d灌胃，模型组、空白组以纯净水灌胃，灌胃剂量均为0.2ml，连续灌胃18天；人参根饮液预防组以自由摄取方式提前给药34天，平均每只小鼠摄取量相当于人每天饮用24瓶，第35天皮下接种肺癌细胞悬液，继续给药。
26.4、评价指标
27.⑴
外观观察
28.观察各组小鼠健康状况、精神状态、食欲、运动、毛发、大便及肿瘤生长情况等。
29.⑵
肿瘤体积(tv)
30.每天测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式:tv＝1/2ab2，其中a为长径，b为短径。
31.⑶
相对肿瘤增殖率(t/c)
32.各组根据肿瘤体积计算相对肿瘤体积(rtv)，rtv＝vt/v0，其中v0为分组给药前(即d0)的肿瘤体积，vt为每次测量时的肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤增殖率(t/c)，即给药组rtv与模型对照组rtv比值的百分比(t/c＝trtv/crtv
×
100％)，t/c＞
60％为无效，≤60％并经统计学处理p＜0.05为有效。
33.⑷
体质量、胸腺指数及脾指数
34.称量小鼠给药前(即d0)的体质量及最后一次给药后的体质量。最后一次给药后，禁食不禁水，次日将小鼠摘眼球取血，处死，解剖，剥离胸腺、脾脏，称重，计算胸腺指数及脾指数。
35.⑸
细胞因子il-6、tnf-α
36.小鼠摘眼球取血，血静置1-2h，离心，取血清，试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(elisa)测定每组小鼠血清中il-6(白细胞介素6)、采用竞争法(elisa)检测肿瘤坏死因子(tnf-α)的含量。
37.5、实验结果
38.⑴
外观观察
39.观察小鼠外观及生存状态，人参根饮液组治疗组及预防组较模型组小鼠瘤体小，活泼好动，精神状态良好，食欲良好，大便性状未见异常，毛发光泽；吉非替尼组小鼠瘤体小，行动迟缓、不活泼，食欲欠佳，毛发暗淡无光泽；模型组较给药组小鼠瘤体大，空白组小鼠健康状况及精神状态良好，食欲佳，行动灵活。
40.⑵
肿瘤体积(tv)
41.各实验组小鼠肿瘤体积如表1所示，各组均与模型组相比较，**p《0.01，*p《0.05；n＝10。
42.表1各实验组小鼠肿瘤体积(mm3)
[0043][0044]
由上表可知吉非替尼和人参根饮液治疗组肿瘤体积较模型组显著减小，随着给药天数的增加，肿瘤体积先增大后减小。建模小鼠成瘤率100％，人参根饮液预防组小鼠成瘤率为35％，自接种细胞悬液直到肿瘤完全消失周期为8-10天。
[0045]
⑶
相对肿瘤增殖率(t/c)
[0046]
各实验组小鼠相对肿瘤增殖率的影响如表2所示。
[0047]
表2各实验组小鼠相对肿瘤增殖率的影响
[0048][0049]
由上表可知，人参根饮液治疗组给药10-13天的相对肿瘤增殖率分别为57.24％、55.00％、28.14％、17.93％，均《60％，吉非替尼组给药第13天相对肿瘤增殖率达到38.65％
[0050]
⑷
体质量、胸腺指数及脾指数
[0051]
各实验组小鼠体质量、胸腺指数、脾指数的影响如表3所示，各组均与模型组相比较，**p《0.01，*p《0.05；n＝10。
[0052]
表3各实验组小鼠体质量、胸腺指数、脾指数的影响
[0053][0054]
由上表和图1可知，其中图1中，1、2、3、4、5分别代表空白组、模型组、吉非替尼组、人参根饮液治疗组和人参根饮液预防组，人参根饮液治疗组体重增长量与模型组一致，说明人参根饮液对小鼠体重无影响；吉非替尼组体重变化比模型组小，可能与吉非替尼影响小鼠食欲有关；人参根饮液预防组体重变化大，原因是给药周期较长。小鼠胸腺指数、脾指数的测定见表3，吉非替尼组较模型组能够显著降低胸腺指数和脾指数，其中脾指数更为显著；人参根饮液治疗组对小鼠脾指数的影响较大，人参根饮液预防组与模型组比较均能降低胸腺指数和脾指数(p《0.01)。
[0055]
⑸
细胞因子il-6、tnf-α
[0056]
各实验组小鼠il-6、tnf-α的检测结果如表4所示，各组均与模型组相比较，**p《0.01，*p《0.05；n＝10。
[0057]
表4各实验组小鼠il-6、tnf-α的影响
[0058][0059]
有研究表明il-6能够促进某些癌细胞的增殖，试剂盒检测结果显示，人参根饮液预防组可以显著降低白细胞介素6的含量(p《0.01)。吉非替尼、人参根饮液治疗组及预防组与模型组比较均可提升小鼠血清中肿瘤坏死因子(tnf-α)的含量，从而达到抑制肿瘤生长的作用。
[0060]
6、结论
[0061]
综上实验结果可知：人参根饮液治疗组与预防组对小鼠外观和生存状态无任何不良影响，吉非替尼对模型小鼠外观和生存状态有一定的影响，推测是由吉非替尼副作用导致的；
[0062]
人参根饮液治疗组与模型组比较肿瘤体积明显减小，给药第10天起相对肿瘤增殖率《60％，证明人参根饮液具有抗肿瘤作用，且可与比吉非替尼相当；
[0063]
预防组成瘤率显著降低，说明预防组显示出更好的疗效，证实人参根饮液可以有效预防肿瘤形成。能明显降低胸腺指数和脾指数，可能通过调节小鼠免疫功能达到抑制肿瘤生长的目的；
[0064]
可通过降低血清中的il-6浓度水平、升高tnf-α浓度水平，实现肿瘤细胞产生杀伤作用。
[0065]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。