抑制RORγt表达或促进Foxp3表达的物质在哮喘预防治疗药物中的应用

抑制ror
γ
t表达或促进foxp3表达的物质在哮喘预防治疗药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及抑制rorγt表达或促进foxp3表达的物质在哮喘预防治疗药物中的应用。


背景技术：

2.哮喘(asthma)是以气道高反应、可逆的气流受阻、气道黏液增多为特征，由肥大细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、上皮细胞等多种细胞和细胞成分参与的复杂的慢性气道炎性疾病，其发生是遗传与环境相互作用的结果。流行病学研究表明，细颗粒物(pm2.5)浓度每增加10μg/m3，哮喘发病率增加2.24％。虽然有很多研究对pm2.5暴露与哮喘的相关机制进行报道，但pm2.5各个成分对哮喘的影响机制还不是很清楚，在人群研究方面尚未有证据证明pm2.5中各成分和哮喘患者之间的免疫机制。
3.通常认为，辅助性t淋巴细胞中的th1和th2亚群免疫应答失衡，是哮喘发生的关键因素。关于th1/th2平衡理论研究己经有很多研究报道，但近年来越来越多的研究显示，单独的th1/th2免疫失衡难以全面解释哮喘患者的发病机制。th17和调节性t淋巴细胞(regulatory t cells,treg)被发现是th细胞的两类新亚群，并与哮喘等自身免疫性疾病的发生密切相关。th17细胞能释放il-17，并间接招募中性粒细胞，进一步加重哮喘发作。treg细胞及其细胞因子的抑制也与哮喘的发生相关。因此，treg/th17及其相关细胞因子il-17/il-10的失衡也是哮喘发病机制的重要病理生理基础。th17细胞的分化受孤核受体γt(rorγt)的特异性调控，cd4+t细胞向th17细胞的分化往往伴随着家族特异性转录因子rorγt和标志性细胞因子il-17的表达。另一方面，叉头转录因子(foxp3)是treg细胞不可缺少的主要转录因子，它的稳定表达对treg细胞的发育和功能至关重要，foxp3缺乏会导致cd4+t细胞向treg细胞分化不足。foxp3可通过与rorγt的直接相互作用抑制th17细胞的分化。因此rorγt与treg细胞的foxp3在功能上相互制约，成为维持treg/th17细胞平衡的关键。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，解决现存的问题，本发明提供抑制rorγt表达或促进foxp3表达的物质在哮喘预防治疗药物中的应用。
5.本发明通过以下技术方案予以实现。
6.一种抑制rorγt表达或促进foxp3表达的物质在哮喘预防治疗药物中的应用。
7.所述抑制rorγt表达或促进foxp3表达的物质能够抑制cd4
+
细胞向th17细胞分化，或者促进cd4
+
细胞向treg细胞分化。
8.所述哮喘为支气管哮喘、变应性哮喘、运动诱发性哮喘、药物诱发性哮喘或者粉尘诱发性哮喘。
9.抑制rorγt表达或促进foxp3表达的物质能够抑制支气管哮喘、变应性哮喘、运动
诱发性哮喘、药物诱发性哮喘或者粉尘诱发性哮喘中炎症因子的产生。
10.抑制rorγt表达的物质为il-17a抗体、白藜芦醇、洋地黄毒苷或二甲双胍；促进foxp3表达的物质为信号转导和转录激活因子stat5、薯蓣皂甙、姜黄素类似物或地塞米松。
11.本发明在一年四个季节分别对哮喘患者进行随访共计8次，检测肺功能、血常规、鼻上皮内衬液和血浆中细胞因子、外周血中treg/th17细胞数目以及stat3、rorγt、stat5和foxp3的基因表达水平。经统计学分析表明，哮喘患者在暴露于pm2.5之后，其有机成分、金属成分和水溶离子均与treg/th17或其细胞因子的失衡有关。
附图说明
12.图1是流式细胞术检测cd4
+
cd25
+
cd127-treg(a)和cd4
+
il-17a
+
th17(b)细胞在cd4
+
细胞中的百分比；
13.图2是rt-pcr检测基因表达时的熔解曲线和扩增曲线；
14.图3是elisa检测鼻上皮内衬液和血浆中细胞因子的标准曲线；
15.图4是pm2.5与其有机、金属、水溶离子成分及温湿度之间的spearman相关分析性分析图；
16.图5是pm2.5每增加一个iqr，哮喘患者各结局指标的变化；
17.图6是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者肺功能(fvc、fev1、fvc/fev1、vc)的变化；
18.图7是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者肺功能(pef、mmef、mvv)的变化；
19.图8是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者外周血中中性粒细胞(ne)、淋巴细胞(ly)及nlr的变化；
20.图9是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者鼻上皮内衬液中细胞因子(il-17、il-23、il-10、tgf-β)的变化；
21.图10是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者血浆中细胞因子(il-17、il-23)的变化；
22.图11是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者血浆中细胞因子(il-10、tgf-β)的变化；
23.图12是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者外周血中treg和th17细胞的变化；
24.图13是pm2.5各成分每增加一个iqr，哮喘患者外周血中基因表达(stat3、rorγt、stat5、foxp3)的变化；
25.图14至图22分别为图5至图13的敏感性分析结果。
具体实施方式
26.下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。构成本技术的说明书附图用来提供对本技术的进一步理解，本技术的示意性实施例及其说明用于解释本技术，并不构成对本技术的不当限定。
27.一、临床随访与样本检测
28.1、哮喘患者纳入与随访
29.34例成年哮喘患者收集于山西省山西医科大学第一医院呼吸与危重症医学科。入
选的哮喘患者均已明确确诊哮喘，并排除吸烟患者、合并其他影响肺功能的肺部疾病或其他重大疾病患者。病例的收集和实验设计获得山西医科大学人群伦理审查委员会批准(编号：2018ll233)，参与的患者均签署知情同意授权书。患者的基本信息在基线随访中通过调查问卷收集。一年时间内对患者随访8次，每个季度随访两次，两次的时间间隔为一周。随访期间，记录患者每天室内外活动时间、及用药情况。
30.2、肺功能检查
31.采用fgc-a+型全自动肺功能测试仪(安徽电子科学研究所)对哮喘患者进行肺功能检查。测试fvc时，患者采取站立位，夹鼻夹，含吹筒，在平静呼吸数次适应之后，深吸气到肺总量位再以最大的力气、最快的速度呼气至残气位；测试vc时，患者采取站立位，夹鼻夹，含吹筒，平静地呼吸至少四次，在平静呼气末作最大缓慢呼气达残气位后，一次最大吸气至肺总量位再缓慢呼气；测试mvv时，患者采取站立位，夹鼻夹，含吹筒，在平静的呼吸4-5次后以最大呼吸幅度、最大呼吸速度持续呼吸12秒，其呼吸次数在10-15次。测试过程中为减少结果误差，患者要进行多次的肺功能检查，每次间隔1min，每次测试结果变化不得超过5％。肺功能结果以实测值占预测值的百分比表示。
32.3、血液标本收集与保存
33.抽取空腹时肘静脉血约10ml至edta抗凝管中，上下颠倒混匀后分装保存。2ml抗凝全血转移至无菌冻存管，-80℃保存；1ml抗凝全血转移至无菌冻存管，后加入1ml rnalater，-80℃保存；将剩余抗凝全血在3000rpm离心15min，吸取上层血浆至无菌冻存管，-80℃保存。
34.4、鼻腔上皮内衬液标本(nasal epithelial lining fluid，elf)收集与保存
35.使用喷鼻壶向患者右侧鼻孔喷入1-2喷(约100μl)无菌生理盐水，揉捏鼻翼使鼻孔充分湿润；用灭过菌的镊子小心取一片采样膜，插入受试者鼻孔，鼻夹夹闭2min后，取出置于无菌离心管a中；将装有采样膜的无菌离心管a置于无菌工作台中室温干燥24h；将采样膜转移至无菌离心管b(规格小于离心管a，且管底有孔)内；将装有采样膜的离心管b置于离心管a中，并向离心管b加入100μl洗脱液【1％牛血清白蛋白(bsa)和0.05％聚乙二醇辛基苯基醚(tritonx-100)溶于pbs(不含钙镁离子)中混匀后配成】，静置1min后，13000r/min 4℃离心2min，重复洗脱2次后，将收集到的洗脱液上清置于-80℃保存。
36.5、实时荧光定量pcr检测患者血中rorγt和foxp3的表达
37.5.1 mrna的提取
38.1)取加了rnalater的全血400μl加入1.5ml离心管中，再加入0.75ml rnaiso plus(takara bio(dalian)inc.,china)吸打混匀，冰上静置10min；
39.2)加入0.15ml氯仿，上下颠倒混匀，冰上静置10min；
40.3)12000r/min4℃离心15min后，吸取上清转移至另一离心管中(切勿吸出白色的中间层)；
41.4)加入0.75ml异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静置10min；
42.5)12000r/min4℃离心10min后，弃上清；
43.6)加入0.75ml 75％乙醇(depc水配置)，7500r/min 4℃离心5min后，弃上清；
44.7)倒扣于吸水纸，空气干燥5～10min；
45.8)加入10μl depc水，溶解rna；
biosciences,usa)，避光孵育15min后，1000rpm离心4min，弃上清；加入2ml 1：10稀释的perm/wash缓冲液，1000rpm离心4min，弃上清；加入10ul pe mouse anti-human il-17a，混匀后避光孵育30min(5min摇一次)，加入2ml pbs，1000rpm离心4min，弃上清；加入200ul pbs重悬，流式细胞仪(becton dickinson,usa)检测cd4+il-17a+th17细胞。
68.7、人treg细胞的检测
69.在流式管中加入100μl人抗凝新鲜全血，加入12μl fitc mouse anti-human cd4,15μl apc mouse anti-human cd25和4μl pe mouse anti-human cd127(bd pharmingen,bd biosciences,usa)涡旋震荡混匀，室温避光孵育20min(每5min摇一次)；每管加入2ml红细胞裂解液，混匀后室温避光孵育10min，1000rpm离心4min，弃上清(若裂红不完全，继续加入800μl红细胞裂解液室温避光孵育5min，1000rpm离心4min，弃上清)；加入200ul pbs重悬，流式细胞仪检测cd4+cd25+cd127-treg细胞。
70.8、采用酶联免疫技术检测和鼻粘液和血浆中il-17、il-23、il-10、tgf-β的水平
71.本实验使用人白细胞介素17(il-17，货号：jl19255)、人白细胞介素23(il-23，货号：jl19269)、人白细胞介素10(il-10，货号：jl19246)、人转化生长因子β(tgf-β，货号：jl47455)酶联免疫分析试剂盒(上海江莱生物)。设置标准品孔和样本孔，向各标准品孔中加入50ul对应浓度的标准品；样本孔分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂)和待测样本孔，向待测样本孔中加入40ul样本稀释液，然后再加10ul待检测样本(将样本稀释5倍)，轻轻晃动混匀；除空白孔外，每孔加入100ul酶标试剂，封板后置于37℃温育1h；每孔加满20倍稀释的洗涤液，静置30s弃去，重复5次后拍干；每孔先加入50ul显色剂a，再加50ul显色剂b，轻轻震荡混匀后在37℃避光显色15min；每孔加50ul终止液终止反应(此时蓝色立转为黄色)。以空白孔调零，在450nm波长测量各孔的吸光度(od值)。以标准品的浓度为横坐标，od值为纵坐标绘制标准曲线，根据样本的od值由标准曲线算出样本相应的浓度，再乘以稀释倍数即为待测样本的实际浓度。
72.二、个体pm2.5暴露评估与pm2.5中重金属成分分析
73.1、室内pm2.5监测
74.使用dusttrak气溶胶监测仪(dusttraktm ii 8530/8532,tsi)进行室内pm2.5浓度监测。在测量前，清洗监测仪的进气口，并根据中流量颗粒物采样器(100l/min，武汉天虹)校准所有监测仪。每次使用前清洗2.5μm校准冲击器，并对每个监测仪进行调零。在目前的研究中，监测仪被放置在离地面1.5米的高度，距离墙壁超过1米。pm2.5数据以1分钟为间隔记录30min，并计算不同微环境(包括卧室、客厅和厨房)中每30min室内pm2.5浓度的平均值。
75.2、室外pm2.5监测及采集
76.从环境监测总站官网(http://www.cnemc.cn/)实时记录随访期间太原市上兰、南寨、巨轮、尖草坪、桃园、坞城、金胜、小店和晋源九个监测站点的日均pm2.5浓度。根据调查问卷中患者的家庭住址信息定位其家庭住址的经纬度，使用arcgis软件中的反距离加权法计算患者的室外pm2.5暴露浓度。同时在距离地面约10m的高度放置中流量颗粒物采样器，使用90毫米直径的石英滤膜(ahlstrom munksjo，芬兰)收集大气pm2.5。
77.3、个体pm2.5暴露评估
78.通过随访期间收集患者的时间活动记录表获得患者在室内外的活动/停留时间，
并通过公式1计算得到每位患者的个体pm2.5暴露浓度。
79.individual pm2.5exposure＝(c
in
×
t
in
+c
out
×
t
out
)
÷
24
ꢀꢀꢀꢀꢀ
公式1
80.其中，c
in
为室内pm2.5浓度(μg/m3)；c
out
为室外pm2.5浓度(μg/m3)；t
in
室内停留时间(h)；t
out
为室外停留时间(h)。
81.4、pm2.5中有机成分分析
82.4.1滤膜前处理及测定
83.参考《中化人民共和国国家和环境保护标准》hj 6472013用高效液相色谱方法测定pm2.5中多环芳烃。将石英滤膜放入索氏提取器中，加入0.1ml十氟联苯溶液，100ml 1+9(v/v)乙醚/正己烷提取液，水浴温度设置为70-80℃，以每小时回流不少于4次的速度提取16-18h。回流完毕，冷却至室温后，清洗提取器及接口处，并将清洗液转移至瓶底，在提取液中加入无水硫酸钠至硫酸钠颗粒可自由流动，放置30min，脱水干燥。将提取液转移至浓缩瓶中，用自动浓缩仪，温度控制在45℃以下浓缩至1ml，加入3ml乙腈，再浓缩至1ml以下，将溶剂完全转换为乙腈，最后准确定容到1.0ml上机。
84.上机条件为梯度洗脱程序：60％乙腈+40％水，保持8min；随后乙腈比例匀速增加到30min，乙腈比例升至100％，保持12min；在42.5min回到最初流动相比例60％乙腈+40％水，保持7.5min。流动相流速：1.00ml/min；柱温箱温度：25℃；荧光检测器：初始激发波长270nm；发射波长324nm；紫外检测器：波长为220nm；进样量为10μl。记录色谱峰的保留时间和峰高(或峰面积)，参考1.6.4.2标准曲线方程计算出多环芳烃的溶液浓度。
85.4.2标准曲线的绘制
86.取一定量多环芳烃标准使用液和十氟联苯标准使用液溶于乙腈中，制备多环芳烃质量浓度分别为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/ml的标准使用液，贮存在棕色小瓶中。通过自动进样器分别移取5种浓度的标准使用液10μl，注入液相色谱，得到各不同浓度的多环芳烃的色谱图。以峰高或峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
87.4.3多环芳烃质量浓度的计算
[0088][0089]
ρ：样品中多环芳烃的质量浓度，μg/m3；
[0090]
ρ1：从标准曲线中得到的多环芳烃的溶液浓度，μg/ml；
[0091]
v：样品的浓缩体积，ml；
[0092]
vs：标准状况下采样总体积，m3；
[0093]
df：稀释因子(目标化合物的浓度超出曲线，进行稀释的倍数)
[0094]
5、pm2.5中重金属成分分析
[0095]
5.1绘制标准曲线
[0096]
取7个100.00ml容量瓶，分别加入金属混合标准溶液[锰(mn)、铜(cu)、铅(pb)、镍(ni)、铬(cr)、钒(v)、镉(cd)、硒(se)、砷(as)]0、1、3、5、8、10、20ml(162760-01-01，上海安谱)，然后用1％硝酸溶液(德国默克)稀释至标线，摇匀，配制成工作标准溶液，浓度分别为0、10、30、50、80、100、200μg/l。依照浓度从低到高的顺序进样，测定发射强度，分别以各元素的发射强度(if)对应其相应的浓度(μg/l)绘制校准曲线。
[0097]
5.2滤膜消解
[0098]
取石英滤膜，用陶瓷剪刀将其剪碎，碎片置于聚四氟乙烯消解管中，加入10ml硝酸-盐酸混合溶液(于约500ml超纯水中加入55.5ml硝酸和167.5ml盐酸，再用超纯水稀释至1l)，使滤膜浸没其中，加盖，至于微波消解仪中，设置程序为(1)0-130℃升温10min，(2)130-200℃升温15min，(3)200℃消解15min，(4)200℃-70℃降温30min。以超纯水淋洗内壁，加入约10ml超纯水，静置半小时进行浸提，过滤，定容至50ml，待测。
[0099]
5.3上机检测
[0100]
通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms,nexion300x，美国)测量过滤器的重金属含量。仪器分析的主要指标条件为(1)测定模式：ked，(2)载气流量：1.1l/min，(3)辅助气体流量：0.8l/min，(4)冷却气流量：14l/min，(5)氮气流量：4.1l/min。
[0101]
6、pm2.5中水溶离子成分分析
[0102]
6.1滤膜前处理
[0103]
小心剪取一张颗粒物滤膜样品(平行样品剪取半张)，放入聚乙烯瓶，加入50.0ml去离子水浸没滤膜，加盖浸泡30min后，置于超声波清洗器中超声提取20min。提取液在离心机中以4000r/min离心10min后，经抽气过滤装置过滤，待测。
[0104]
6.2标准曲线
[0105]
氟离子曲线浓度点分别为：0、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00mg/l
[0106]
氯离子曲线浓度点分别为：0、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、40.00mg/l
[0107]
硝酸根离子曲线浓度点分别为：0、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、40.00mg/l
[0108]
硫酸根离子曲线浓度点分别为：0、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、40.00mg/l
[0109]
铵根离子曲线浓度点分别为：0、0.10、0.50、1.00、2.00、5.00mg/l
[0110]
6.3上机条件
[0111]
6.3.1氟离子、氯离子、硝酸根离子、硫酸根离子：
[0112]
碳酸盐淋洗液，流速：1.00ml/min，抑制型电导检测器
[0113]
进样量：50ul，进样时间：25min，抑制电流：25ma.
[0114]
6.3.2铵根离子
[0115]
甲烷磺酸淋洗液，流速：1.15ml/min，抑制型电导检测器
[0116]
进样量：50ul，进样时间：15min，抑制电流：59ma.
[0117]
三、统计学分析
[0118]
1、统计描述
[0119]
使用spss 21.0(ibm spss statistics)对pm2.5及其各成分的浓度、哮喘患者的肺功能及各项生物指标进行描述性分析；对pm2.5和其各成分进行spearman相关性分析。
[0120]
2、回归分析
[0121]
在r3.6.1中安装lme4包，使用lmer函数构建混合效应模型，分析pm2.5及其成分对哮喘患者肺功能及各项生物指标的影响。具体方法为，以pm2.5及其成分作为固定效应，以患者个体作为随机效应，调整季节、年龄、性别、体重指数(bmi)、温度和湿度，若肺功能和各项生物指标不符合正态分布，则对其进行对数转换后再分析。所有分析均以固定效应升高一个四分位数间距(iqr)，肺功能或生物指标改变的百分比表示。p《0.05表示差异有统计学意义，在图中以红色表示。
[0122]
3、敏感性分析
[0123]
为了确定分析结果的稳定性，排除参与不足8次以上的患者后再进行敏感性分析。分析方法与上述的回归分析相同。
[0124]
四、结果
[0125]
1、统计描述结果
[0126]
哮喘患者的基本特征及其肺功能和各项生物指标的描述性结果见表3。纳入的34名哮喘患者中有20例女性和14例男性，平均年龄为45岁，平均bmi为23.36kg/m2，其中有79.41％的患者使用药物。大部分患者接受了大学及以上的教育，并从不吸烟和饮酒。
[0127]
流式细胞术检测treg和th17细胞的结果如图1所示。rt-pcr检测基因表达情况，其溶解曲线和见图2。elisa检测鼻上皮内衬液和血浆中细胞因子的标准曲线见图3。
[0128]
表3研究对象的基本特征及肺功能和各项生物指标的描述性结果
[0129]
[0130][0131]
pm2.5及其多环芳烃、重金属和水溶成分的统计描述和季节变化见表4和表5。全年室外pm2.5的平均浓度为62.44μg/m3，个体pm2.5暴露浓度为60.14μg/m3。pm2.5中有机成分浓度最高的是bbf、flt、chr、pyr，金属成分浓度最高的是fe、zn、pb、mn，水溶离子成分最高的是so4、no3、nh4。对颗粒物及其成分进行季节性分析发现，所有颗粒物及其成分在季节之间均存在统计学差异，p＜0.001。
[0132]
表4 pm2.5及其各成分和气象条件的描述性分析
[0133]
[0134][0135]
表5 pm2.5及其各成分和气象条件的季节性分析
[0136]
[0137]
[0138][0139]
2、pm2.5浓度与其各成分的相关性分析
[0140]
对pm2.5与其各成分和温湿度进行spearman相关分析，结果如图4所示。除mn、v、zn、baa、bap、bkf、f、nh4、so4、湿度之外，pm2.5与其他所有成分和温度之间均存在显著的相关性。
[0141]
3、回归分析结果
[0142]
pm2.5对哮喘患者肺功能和各生物指标的影响参见图5。pm2.5各成分对哮喘患者肺功能指标fvc、fev1、fvc/fev1、vc、pef、mmef和mvv的影响参见图6和图7。pm2.5中多环芳烃dba和ipy，水溶离子中cl和f可以显著降低fvc、fev1、vc、pef和mvv，此外，重金属ni和se也可以显著降低mvv。从图8中可以发现，影响血常规中ne、ly和nlr的pm2.5成分主要是重金属(cd、cu、mn、ni、se、v、zn)和多环芳烃(baa、bbf、bkf、bpe、dba、flt、ipy、pyr)，水溶离子中仅发现cl可以显著升高ne。如图9所示，pm2.5中多环芳烃、重金属和水溶离子均发现了与鼻粘液中细胞因子的显著相关性。其中重金属cr既可以显著升高il-23的水平，同时还可以显著降低tgf-β的水平。进一步分析pm2.5各成分对血浆中各细胞因子的影响，结果参见图10和图11。发现多环芳烃成分对血浆细胞因子的影响更为明显，其中baa、bap、bbf、bkf、bpe、dba、flt、ipy、pyr对血浆中il-17、il-23和tgf-β均有显著影响。重金属中as、cu和mn对血浆中il-17、il-10和tgf-β均有显著影响。水溶离子中cl和f对血浆中il-17和tgf-β有显著影响。由附图12可知，少数pm2.5成分可以显著改变treg和th17的水平。pm2.5中仅重金属(fe、mn、v)和多环芳烃nap可以显著降低stat5的表达，结果参见附图13。
[0143]
4、敏感性分析结果
[0144]
如图14-22所示，在排除随访不足8次的哮喘患者之后进行再分析，结果与全人群的分析结果类似，说明回归结果稳定可信。
[0145]
综上所述，pm2.5及其各成分通过引起treg/th17及其相关细胞因子失衡导致肺功能下降从而加重哮喘。因此，以上研究结果充分表明了针对th17细胞抑制剂或treg细胞激动剂有望作为预防大气污染加重哮喘的药物进行应用。
[0146]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。