使用蛋白质溶液治疗胶原蛋白缺损的方法与流程

使用蛋白质溶液治疗胶原蛋白缺损的方法
1.本技术是申请日为2014年3月11日，申请号为201480028053.2，题目为“使用蛋 白质溶液治疗胶原蛋白缺损的方法”的专利申请的分案申请。


背景技术：

2.本技术涉及在哺乳动物对象中的胶原蛋白缺损位置刺激软骨细胞的方法。特别地， 方法包括使用含细胞因子的溶液，包括源自血液和其它组织的这种溶液。
3.软骨细胞是产生和维持组成软骨的软骨基质的细胞。胶原蛋白是动物中最丰富的蛋 白质，存在于各种组织，包括皮肤、结缔组织、软骨、骨、血管和椎间盘。有各种各样 的胶原蛋白相关疾病，由包含胶原蛋白的组织的疾病以及创伤造成。疾病可以由影响软 骨细胞产生胶原蛋白的遗传缺陷或营养缺陷造成。一些胶原蛋白疾病与自身免疫疾病相 关，如类风湿性关节炎、狼疮和系统性硬化，所述自身免疫疾病在胶原蛋白产生后将其 破坏。这类疾病可能是使人虚弱的且疼痛的。
4.软骨由胶原蛋白纤维组成。因此，胶原蛋白疾病可以影响关节和其他组织结构中的 软骨的组成和功能。软骨缺损可以呈现为软骨表面的洞或撕裂，且可以由磨损、创伤或 疾病造成。由于软骨自我修复能力低，即使是小的软骨缺损，如果不治疗的话，能妨碍 人或其他哺乳动物无痛移动的能力，并且能导致关节表面退化。传统的软骨缺损治疗包 括用关节镜手术修整软骨表面的缺损，或用缝合修复缺损。较新地，软骨缺损的治疗包 括收货软骨细胞，然后对其进行培养，并移植回到软骨缺损以重生软骨。
5.然而，很多这样的治疗可能存在副作用，并且可能有受限制的长期利用，因为潜在 的病症变得严重。因此需要开发治疗软骨缺损和其它胶原蛋白缺损的新疗法，特别是改 进功效和降低副作用的疗法。


技术实现要素：

6.本技术提供用于刺激胶原蛋白产生，包括刺激软骨细胞产生的方法和治疗性组合 物。方法包括在哺乳动物对象中的胶原蛋白缺损位置刺激软骨细胞产生，包括将血液来 源的组合物施用到所述位置，所述组合物包含选自il-1ra、stnf-r1、stnf-rii、igf-i、 egf、hgf、pdgf-ab、pdgf-bb、vegf、tgf-β1和sil-1rii的至少两种蛋白质， 其中各蛋白质在所述组合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。例如，组合 物可以包含：
7.(a)至少约10,000pg/ml的il1-ra；
8.(b)至少约1,200pg/ml的stnf-ri；和
9.(c)蛋白质，选自stnf-rii、igf-i、egf、hgf、pdgf-ab、pdgf-bb、vegf、 tgf-β1、sil-1rii及其混合物，其中所述蛋白质的浓度高于正常血液中所述蛋白质的基 线浓度。
10.在一些实施方式中，所述组合物进一步包含选自stnf-rii、igf-i、egf、hgf、 pdgf-ab、pdgf-bb、vegf、tgf-β1、sil-1rii及其混合物的蛋白质，其中所述蛋白 质在所述组合物中的浓度大于所述蛋白质在正常血液中的浓度。所述组合物可以包含细 胞因子生成细胞、血小板和其组合。
11.本技术还提供制备用于在哺乳动物对象中刺激软骨细胞产物的组合物的方法，包 括：
12.(a)从所述对象获得细胞因子细胞悬液；
13.(b)分级分离所述液体以产生包含白介素-1受体拮抗剂的自体的蛋白质溶液；
14.(c)将所述自体的蛋白质溶液施用到所述对象中的胶原蛋白缺损的位置。
15.所述细胞因子细胞悬液可以包括全血、骨髓抽吸物、脂肪组织、尿液、其部分和其 混合物。例如，分级分离可以包括将血液置于容器，可操作以将所述血液分离为两或多 个部分的分离器；以及离心所述分离器以产生富血小板血浆部分。所述富血小板血浆可 以与固相提取材料如聚丙烯酰胺珠接触，以形成所述自体的蛋白质溶液。
附图说明
16.图1的框图描述生成细胞因子组合物的方法；
17.图2是分级分离装置的图；
18.图3a和3b显示在离心之前(图3a)和之后(图3b)激活样品产生抗炎性细胞因子的 装置；
19.图4是产生血凝块的装置的图；
20.图5是能产生细胞因子组合物的单一装置的图；
21.对应的参考数字指示附图数个视图中的对应部分。应指出，本文所列图意在举例说 明本技术材料、组合物、装置和方法的一般特征，以用于描述某些实施方式的目的。这 些图不一定精确反映任意给定实施方式的特征，且不必定用于完整定义或限制本技术范 围内的特定实施方式。
22.发明详述
23.下列技术描述仅示例一种或多种发明的组合物性质、制造和应用，且不意在限制本 申请或所述其他申请中要求权利的任何特定发明的范围、实施和应用，所述其他申请可 能提交要求对本技术的优先权，或其中公开的专利。在本详细描述的结尾处提供关于术 语和短语的非限制性讨论，用于协助理解本技术。
24.本技术涉及使用包含细胞因子，例如，白介素-1受体拮抗剂(il1-ra)和肿瘤坏死因 子α，的组合物通过如刺激软骨细胞产生而刺激胶原蛋白产生的方法。在各种实施方式 中，在人或其它哺乳动物对象中的刺激胶原蛋白缺损的方法包括：
25.(a)从一个或多个哺乳动物对象获得细胞因子细胞悬液；
26.(b)分级分离细胞因子细胞悬液以生成含一种或多种蛋白质如白介素-1受体拮抗剂 的蛋白质溶液；和
27.(c)将所述自体的蛋白质溶液施用到所述对象中胶原蛋白缺损的位置。
28.蛋白质组合物
29.本技术提供在人或其它哺乳动物对象中刺激软骨细胞产生的方法，所述方法使用包 含溶解、悬浮或另外携带从而以生理学可接受介质形式递送给哺乳动物对象的蛋白质的 组合物(本文称为“蛋白质溶液”)。在各种实施方式中，所述组合物包含产自正常哺乳动 物对象全血的蛋白质(如细胞因子)。所述组合物还包含活细胞，包括血小板、细胞因子 生成细胞和其组合。
30.在各种实施方式中，所述蛋白质溶液包含至少2种选自以下的蛋白质：il-1ra(白介 素-1受体拮抗剂)、stnf-ri、stnf-rii(可溶性肿瘤坏死因子受体2)、igf-i(胰岛素样 生长因子1)、egf(表皮生长因子)、hgf(肝细胞生长因子)、pdgf-ab(血小板衍生生 长因子ab)、pdgf-bb(血小板衍生生长因子bb)、vegf(血管内皮生长因子)、tgf-β1 (转化生长因子βι)、sil-lrii(可溶性白介素受体ii)，其中所述组合物中各蛋白质的浓度 大于正常血液中所述蛋白质的浓度。尽管所述组合物中每一种蛋白质浓度可大于正常血 液中其各自浓度，但不必定2种以上蛋白质的浓度大于正常血液中其各自浓度。
31.在各种实施方式中，蛋白质溶液包括下列组分。
32.表1.蛋白质溶液示例性蛋白质组分
[0033][0034][0035]
蛋白质浓度能用实施例4所示方法测量。
[0036]
优选地，所述组合还包含活的细胞因子生成细胞、裂解的细胞因子生成细胞或两
者。 在优选组合物中，所述蛋白质溶液包含单核细胞、粒细胞和血小板。在各种实施方式中， 蛋白质溶液包含下列组分。
[0037]
表2.蛋白质溶液示例性细胞组分
[0038][0039]
应理解该浓度为种特异性。此外，应理解浓度可随着个体对象而变化。因此，在包 括从含细胞因子生成细胞的血液或其它组织生成蛋白质溶液的方法中，所述蛋白质溶液 的蛋白质和细胞浓度可与上述不同；上述值是浓度均值，如对象群体中所见。
[0040]
在各种实施方式中，所述蛋白质溶液中一种或多种蛋白质或其它组分的浓度大于正 常血液中该组分的浓度。(具有所述更高组分浓度的组合物被称为“富含”这些组分。)如 本文所示，“正常”血液或其它组织中的组分浓度是获得组织的哺乳动物对象一般群体中 所见浓度，例如正常全血中。在抗炎性细胞因子组合物获自特定对象组织的方法中，蛋 白质或细胞的“正常”浓度可以是进行加工获得蛋白质或细胞之前的个体血液中的浓度。
[0041]
因此，在各种实施方式中，所述蛋白质溶液中一种或多种组分的浓度是正常血液中 该组分浓度的大于约1.5倍、约2倍或约3倍。例如，相对于正常(全)血，组合物中的 组分可具有更高浓度，如下所示：
[0042]
·
il-1ra，浓度是至少约2.5倍、或至少约3倍或至少约5倍；
[0043]
·
stnf-ri，浓度是至少约2倍、或至少约2.5倍或至少约3倍；
[0044]
·
stnf-rii，浓度是至少约2倍、或至少约2.5倍或至少约3倍；
[0045]
·
sil-lrii，浓度是至少约1.5倍、或至少约1.8倍或至少约2倍；
[0046]
·
egf，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约5倍；
[0047]
·
hgf，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；
[0048]
·
pdgf-ab，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约5倍；
[0049]
·
pdgf-bb，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约5倍；
[0050]
·
tgf-β1，浓度是至少约3倍、或至少约4倍或至少约6倍；
[0051]
·
igf-1，浓度是至少约1.2倍、或至少约1.4倍或至少约1.5倍；
[0052]
·
vegf，浓度是至少约2倍、或至少约2.5倍或至少约3倍；
[0053]
·
细胞因子生成细胞，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；
[0054]
·
血小板，浓度是至少约2倍、或至少约3倍或至少约4倍；
[0055]
·
中性粒细胞，浓度是至少1.5倍、或至少2倍或至少3倍；
[0056]
·
单核细胞，浓度是至少3倍、或至少4倍或至少6倍；
[0057]
·
淋巴细胞，浓度是至少5倍、或至少8倍或至少10倍；和
[0058]
·
嗜碱性细胞，浓度是至少2倍、或至少4倍或至少6倍。
[0059]
同样，所述蛋白质溶液中的红细胞浓度优选是正常血液中红细胞浓度的至少一半， 或至少三分之一。
[0060]
例如，蛋白质溶液可包含：
[0061]
(a)至少约10,000pg/ml ill-ra；
[0062]
(b)至少约1,200pg/ml stnf-ri；和
[0063]
(c)蛋白质，选自stnf-rii、igf-i、egf、hgf、pdgf-ab、pdgf-bb、vegf、 tgf-β1、和sil-lrii以及其混合物，其中所述蛋白质的浓度大于正常血液中该蛋白质的 基线浓度。另一示例中，蛋白质溶液包含：
[0064]
(a)白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)，浓度是正常血液中il-1ra浓度的至少3倍；
[0065]
(b)可溶性肿瘤坏死因子因子-rl(stnf-rl)，浓度是正常血液中il-1ra浓度的至少2 倍；
[0066]
(c)细胞因子生成细胞，浓度是正常血液中细胞因子生成细胞浓度的至少2倍；和
[0067]
(d)血小板，浓度是正常血液中血小板浓度的至少2倍。
[0068]
在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的il-1ra浓度优选是该蛋白质溶液中的白介 素-lα浓度的至少5,000倍或至少10,000倍。il-1ra:白介素-1β(il-1β)浓度之比优选是至 少100。在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的il-1ra浓度优选是该蛋白质溶液中的 il-1β浓度的至少1500倍或至少8000倍。sil-lrii:白介素-1β(il-1β)浓度之比优选大于 1。在一些实施方式中，所述蛋白质溶液中的sil-lrii优选是该蛋白质溶液中的白介素-1β 浓度的至少2000倍或至少45000倍。
[0069]
制备蛋白质溶液的方法
[0070]
蛋白质溶液可通过多种方法(包括混合个体组分)和方法的任一种制备，(其中一种或 多种组分获自源材料。在各种实施方式中，所述蛋白质溶液通过分级分离细胞因子细胞 悬液制备，从而生成含ill-ra的蛋白质溶液。
[0071]
通过细胞因子生成细胞接触提取物质来获得蛋白质溶液
[0072]
在各种实施方式中，通过从含细胞因子生成细胞的组织获得一种或多种组分来制备 蛋白质溶液。如本文所示，“细胞因子生成组织”是获自哺乳动物对象的组织，包含能生 成细胞因子的细胞。这种细胞包括细胞因子生成细胞、脂肪基质细胞、骨髓基质细胞和 其
组合。应理解细胞因子生成细胞包括单核细胞、淋巴细胞和粒细胞如中性粒细胞、嗜 酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞。用于本技术方法的白细胞优选包括单核细胞和中性粒细 胞。本文所用的细胞因子生成组织包括血液、脂肪组织、骨髓、和其部分，如下进一步 所讨论。
[0073]
本文所用的血液包括全血、血浆、富血小板血浆、贫血小板血浆和血凝块。在优选 实施方式中，本技术方法使用含细胞因子生成细胞和血小板的富血小板血浆(prp)，包 含通过沉淀全血产生的白膜层。本文所用的脂肪组织包括任何脂肪组织，包括白色和棕 色脂肪组织，其可获自皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其它脂肪组织位置。本文所用的 骨髓包括红髓和黄髓。在优选实施方式中，骨髓是获自红髓和黄髓的骨髓浓缩物，包括 造血和间充质干细胞。如上所讨论，相对于根据本技术方法治疗的对象，用于本发明的 血液、脂肪和骨髓组织可以来自自体或同种异体来源。组合物还可以从同种异体的组织 和自体的组织的组合制备。
[0074]
在一些实施方式中，方法包括分级分离液体(“细胞因子细胞悬液”)，所述液体包含 能生成细胞因子如ill-ra和stnf-rl的细胞。如上所讨论，这种细胞包括细胞因子生成 细胞、脂肪基质细胞、骨髓基质细胞和其组合。在一些实施方式中，所述细胞因子细胞 悬液是含细胞因子生成细胞的液体。应理解所述细胞因子细胞悬液包括细胞和胞外液 体，无论细胞和液体的相对比例如何。在一些实施方式中，所述悬液可主要包括细胞， 液体仅作为副成分，基本用于湿润细胞。在一些实施方式中，所述液体可包括两相，由 以下构成：主要由液体组成的相和主要由细胞组成的相，仅在搅拌或其它混合后形成液 体中的细胞的悬液。
[0075]
在一些实施方式中，分级分离细胞因子细胞悬液包括将所述液体与固相提取材料接 触。如图1所示例，这种方法包括：
[0076]
(a)获得细胞因子细胞悬液，如含细胞因子生成细胞的液体(步骤105、115或135， 或其组合)；
[0077]
(b)将组织与固相提取材料接触(步骤140)；和
[0078]
(c)从固相提取材料分离含蛋白质的液体(步骤150)。
[0079]
获得悬液105、115和135能包括产生含细胞液体的任意多种本领域已知方法。这 类方法包括从组织和培养物分离。获得悬液可在所述方法中直接进行，其中健康护理人 员或其他个体进行分离、加工、培养或其它方法以产生悬液，所述过程包括接触和分离 步骤。在一些实施方式中，产生悬液的方法与接触和分离步骤同时进行，作为照护过程 的一部分，如本文进一步所讨论。或者，获得悬液可以是间接的，仅涉及获取悬液以用 于接触和分离步骤，其中产生悬液的加工处理之前由另一方完成。
[0080]
在各种实施方式中，获得包括从血液、脂肪组织、骨髓抽吸物或其它含细胞因子生 成细胞的组织中分离细胞因子细胞悬液，所述悬液包含细胞因子生成细胞或其它细胞因 子生成细胞，如图1的步骤110、120和125所示例。方法可包括从2、3或更多组织来 源获得细胞因子细胞悬液。
[0081]
从血液获得含有细胞因子生成细胞的液体
[0082]
在包括使用血液的实施方式中，血液可直接用于接触固相提取材料，如图1的步骤 140所示例，或在优选实施方式中，可加工所述血液以提供成分血，如prp。产生成分 血的许多装置和方法为本领域已知，采用诸如离心和过滤等手段。
用过滤。另外，含富血小板血浆的血液组分能如下生成：用慢速离心步骤分离血浆与红 细胞以防止血小板成团。在其它实施方式中，从离心血液形成的白膜层可与剩余血浆分 离并重悬形成富血小板血浆。
[0097]
从脂肪组织获得细胞因子细胞悬液
[0098]
在包括使用脂肪组织的实施方式中，所述脂肪组织可直接用于接触固相提取材料， 如图1的步骤140所示例，或所述脂肪组织可处理成提供步骤110的经分离脂肪细胞。 本方法还使用含脂肪来源干细胞的细胞部分。在一些实施方式中，脂肪组织源自通过躯 干抽吸辅助脂肪切除术或抽脂术分离的人皮下脂肪。基质细胞可用任何合适方法从脂肪 组织和/或组织部分分离，包括本领域已知方法如机械和分解离心。基质细胞还可用酶消 化分离。例如，基质细胞能从脂肪组织提取物中分离，通过超声波和/或酶消化处理，离 心富集。分离自脂肪组织的基质细胞可洗涤和成团。
[0099]
例如，在专用收集容器内通过躯干抽吸辅助肿胀吸脂术能收集脂肪组织，所述容器 连接吸入软管和吸脂管。收集容器可具有纱布型网格，允许肿胀液通过并保留固体脂肪 组织。收集脂肪组织后，收集容器从抽吸装置中移出并重新连接离心装置。过滤单元还 可包含孔径约100微米的滤器。一旦含脂肪组织的收集容器连接离心装置，对组织进行 超声波处理。超声波处理后，将完整设备插入离心桶并以例如300xg离心5分钟。离心 后，收集容器与过滤单元一起分离且可弃去。随后，含基质细胞的团块能重悬于生物相 容性溶液，如血浆、血浆浓缩物和富血小板血浆。
[0100]
用于分离和/或分级分离脂肪组织及脂肪细胞的多种方法和装置包括以下专利所述 的那些：美国专利号7,374,678,leach,2008年5月20日公开；美国专利号7,179,391,leach 等,2007年2月20日公开；美国专利号7,992,725,leach等,2011年8月9日公开；美 国专利号7,806,276,leach等,2010年10月5日公开；和美国专利号8,048,297,leach等, 2011年11月1日公开。诸如gps
tm
血小板浓缩系统的装置市售获自巴奥米特公司(美国 印第安纳州华沙)，可用于分离脂肪细胞。
[0101]
从骨髓获得含细胞因子生成细胞的液体
[0102]
在包括使用骨髓的实施方式中，所述骨髓可直接用于接触固相提取材料，如图1的 步骤140所示例，或可处理成提供步骤135的骨髓浓缩物。获得和浓缩骨髓的许多装置 及方法为本领域已知。
[0103]
一种分离和产生骨髓浓缩物(cbma)的示例性过程如下所示。一般，方法600可起 始于步骤605，获得骨髓抽吸物体积。骨髓抽吸物(bma)可以任何选定或一般已知方式 获得。例如，选定骨区域如接近外科手术的部分，能用于获得骨髓抽吸物。一般，进入 装置如注射器和针能用于进入选定骨的髓内区域。可从多个位置抽取小体积的选定部分 以获得适当体积的bma或选定bma部分。
[0104]
一旦步骤605获得选定体积的bma，其可用重力分离器分离并浓缩。本文所用的 分离器可操作分离多组分流体，所述流体一般包括混杂或混合在一起的不同密度的多种 组分或成分，包括上述用于分离来自血液和脂肪组织的部分的那些。分离器可包括相对 于bma具有选定密度的浮标。这种分离器包括上述用于浓缩和分离来自血液和脂肪组 织的部分的那些，包括以下专利所述的那些：美国专利号7,374,678,leach,2008年5月 20日公开；美国专利号7,179,391,leach等,2007年2月20日公开；美国专利号7,992,725, leach等,
2011年8月9日公开；美国专利号7,806,276,leach等,2010年10月5日公开； 和美国专利号8,048,297,leach等,2011年11月1日公开。诸如gps
tm
血小板浓缩系统 的装置市售获自巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)，能用于分离脂肪细胞。例如，可 用于在步骤610和615分级分离bma的分离器和方法还描述于美国申请公开号 2006/0278588,woodell-may,2006年12月14日公开。根据各种实施方式，bma可在步 骤610中置于分离器内。一旦bma置于分离器内，选定部分的bma可在步骤615中 与bma分离。
[0105]
一旦bma置于分离器内，分离器在离心机中以约1,000-约8,000rpm范围旋转。 这对分离器和bma生成正常重力的约65-约4500倍的力，如本领域通常所计算。在此 力作用下，bma样品中密度较高的物质被推向管底部。因此，分离器能用于从骨髓样 品移出有核细胞。在各种实施方式中，浓缩bma的有核细胞浓度是bma中有核细胞 浓度的至少2倍、至少3倍、至少4倍、或至少5倍。
[0106]
从血凝块获得含有细胞因子生成细胞的液体
[0107]
在包括使用血液的其它实施方式中，含细胞因子生成细胞的液体可陷于血凝块内。 通过压缩(“挤压”)、血块破碎或离心能从血凝块产生细胞释放物。通过联合血或成分血 与凝血剂，血凝块能用或未用抗凝剂且用或未用外源性凝血酶制备。合适的凝血剂包括 凝血酶(如牛、重组人、混和人或自体)、自体凝血蛋白和聚乙二醇。钙可采用钙盐形式， 如氯化钙。
[0108]
在一些实施方式中，所述凝血剂包括凝血蛋白，其可以是来源于血液的凝血部分， 所述血液获得自待治疗的患者。合适的凝血部分能通过如下方法获得：用钙溶液(如溶 于乙醇的氯化钙)将全血或血浆加样到血分离装置；可选加热全血或血浆至少约20分钟， 温度为至少约20℃；和分离凝血部分。通过离心加热的全血或血浆可完成分离。合适 的分离装置作为clotalyst
tm
自体凝血酶收集系统(下文的“clotalyst系统”)市售可得，由美 国印第安纳州华沙的巴奥米特公司销售。
[0109]
用图4的装置400生成凝血剂的示例性过程起始于将含氯化钙和乙醇的试剂经第一 端口410注入主室405。玻璃珠也置于主室405。注入试剂后，第一端口410用第一替 换帽415密封。将带抗凝剂的血液经第二端口420注入主室405。注入血液后，第二端 口420用第二替换帽425密封。可选地，注射器和血分离装置400预热到约25℃的温 度。
[0110]
血组分分离装置400的内容物通过重复翻转装置400来混合，例如约12次，从而 使血液接触玻璃珠。混合后，温育装置。温育过程采用一定温度和持续时间，从而允许 装置400的内容物在约25℃加热约15分钟。完成温育阶段后，红细胞、血浆和玻璃珠 的凝结团在主室405的第二末端406形成。完成温育后，充分振荡装置400以去除和破 坏任何可能存在的凝胶。
[0111]
用非离心方法获得含有细胞因子生成细胞的液体
[0112]
如上所述，含细胞因子生成细胞的液体能通过非离心方法如培养获得。如本文所示，
ꢀ“
非离心方法”包括从组织获得含细胞因子生成细胞的组织部分的方法，而不采用离心。 在一些实施方式中，方法是“非重力的”，其中基于密度以外的细胞物理、化学或物理化 学性质，其中所述部分的白细胞浓度高于组织中的白细胞浓度。特别地，这种非重力方 法不同于白细胞部分通过离心全血或其它组织而产生的方法。在一些实施方式中，所述 非离心方法包括仅基于密度以外的所述白细胞性质的方法。非离心方法包括过滤、抗体 结合和
电泳法。
[0113]
例如，如上所讨论，可通过过滤从全血、骨髓抽吸物或其它组织制备细胞因子生成 细胞。获自血液、骨髓、脂肪组织或其它来源的细胞因子生成细胞和其它细胞因子生成 细胞还能用本领域已知方法培养。然后，所述细胞悬于合适介质如血浆，从而维持其活 力并促进与固相提取材料混合或其它接触。含所述细胞的液体还可通过压缩或破坏血凝 块来生成，如上所述。
[0114]
将液体细胞因子细胞悬液接触提取材料并分离蛋白质溶液
[0115]
进一步参考图1的示例过程，温育细胞因子细胞悬液或另外与固相提取材料接触(步 骤140)以生成含蛋白质的液体。随后，从固相提取材料分离此液体(步骤150)，作为本 技术的蛋白质溶液。不意在限制本技术的范围、机制或功能，本文所用的固相提取材料 浓缩液体体积细胞因子生成细胞中的细胞因子或其它蛋白质，在一些实施方式中，可活 化、刺激或另外增加细胞因子生成，包括il-1ra。因此，在一些实施方式中，方法包括 用固相提取材料活化细胞因子细胞悬液。
[0116]
固相提取材料能包括提供特定表面积以接触细胞的多种物质。固相提取材料可以是 连续材料或不连续，且包括多种单独颗粒。例如，固相提取材料可采用多种珠、纤维、 粉末、多孔材料或容器表面形式，所述容器包括含所述细胞的液体。固相提取材料可包 括具有多种横截面形状的几何体，如球形、椭圆形或多边形等。固相提取材料还能包括 类似海绵的连续多孔网络，或能包括多种个体多孔颗粒。相较非多孔材料，固相提取材 料还可因多孔而提供更大的表面积。
[0117]
在一些实施方式中，固相提取材料包括具有大长宽比的颗粒，例如其中颗粒为针样 形状。固相提取材料还可形成为长纤维且可以是或采用类似玻璃棉的形式。
[0118]
一些情况下，固相提取材料能包括保持细胞因子细胞悬液的容器内壁。例如，固相 提取材料可包括含有细胞因子细胞悬液的注射器腔。其它容器包括管如离心管，或血液 分级分离装置或浓缩器组件，如本文他处所述。
[0119]
固相提取材料是连续材料如多孔海绵样材料时，该固相提取材料使用的量足以在固 相提取材料的孔或间隙内吸收或吸附或纳入基本完整液体体积的细胞因子生成细胞。固 相提取材料是不连续材料如多种颗粒时，该固相提取材料能与含所述细胞的液体联合形 成浆样组合物。从具有高固体部分的似膏体到具有低固体部分的易流动浆体，所述浆体 的稠度可变，。
[0120]
固相提取材料能提供大表面积与细胞接触。然而，一些情况下，固相提取材料能进 一步处理以增加其表面积，例如通过物理或化学蚀刻或侵蚀固相提取材料表面。关于化 学侵蚀，根据材料性质，能采用腐蚀剂修饰固相提取材料表面。经修饰表面可用碱或酸 生成，例如色磺酸(chromosulphonic acid)，特别是约20％-约80％强度，优选约50％色磺 酸。固相提取材料能用腐蚀剂温育约5分钟-约30分钟以化学蚀刻表面并增加表面积。 然后，可洗涤固相提取材料去除腐蚀剂。例如，固相提取材料能包括保持细胞因子细胞 悬液的容器内壁，其中内壁蚀刻从而随后增加接触液体的表面积。
[0121]
多种聚合物、金属、陶瓷和玻璃能用作固相提取材料。在一些实施方式中，固相提 取材料包括吸湿材料。合适固相提取材料的示例包括玻璃、矿物、聚合物、金属和多糖。 矿物包括刚玉和石英。聚合物包括聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙烯酰胺。 金属
成。例如，温育可以是24小时或更少，10小时或更少，5小时或更少，2小时或更少， 1小时或更少，30分钟或更少，15分钟或更少，10分钟或更少，5分钟或更少，4分钟 或更少，3分钟或更少，2分钟或更少。温育可以是至少约15秒，至少约30秒，至少 约1分钟，至少约90秒，至少约2分钟，至少约10分钟，或至少约30分钟。在一些 实施方式中，温育是约1分钟-约3分钟。在一些实施方式中，所述液体不温育，但只 在必须时与固相提取材料接触以进行后续处理。所述接触可在周围条件下进行，例如约 20-25℃的温度。
[0128]
在一些实施方式中，搅拌所述细胞因子细胞悬液和固相提取材料以在接触期间更充 分混合这些组分。所述搅拌可通过翻转、振荡、摇动、搅拌或涡旋液体和固相提取材料 来完成。搅拌可增加液体内细胞与固相提取材料的接触。搅拌可进行一次，重复多次， 定期重复，或可连续。当含所述细胞的液体用电磁场刺激时，还可搅拌该液体和固相提 取材料。涉及用聚丙烯酰胺珠和其它固相提取材料生成富含蛋白质溶液的另外方面和特 征参见：美国专利申请公开号2009/0220482,higgins等,2009年9月3日公开；美国专 利申请公开号2010/0055087,higgins等,2010年3月4日公开；美国专利申请公开 2011/0052561,hoeppner,2011年3月3日公开；国际申请公开2012/030593,higgins等, 2012年3月8日公开；和美国专利申请公开2012/0172836,higgins等,2012年7月5日 公开。与使用聚丙烯酰胺珠和其他固相提取材料生产富含蛋白质的溶液相关的其它方面 和特征描述于美国专利申请序列号13/840562,binde等,《用于治疗炎症性疾病的方法和 非免疫原性组合物》(methods and non-immunogenic compositions for treatinginflammatory diseases)；美国专利申请序列号13/841083landrigan等；《用蛋白质溶液治 疗炎症性呼吸道疾病》(treatment of inflammatory respiratory disease using proteinsolutions)；美国专利申请序列号13/837005,woodell-may等；《治疗炎症性疾病的方法 和非细胞组合物》(methods and acellular compositions for treating inflammatorydisorders)；美国专利申请序列号13/837480,o'shaughnessey等.《用蛋白质溶液治疗疼 痛》(treatment of pain using protein solutions)；美国专利申请序列号13/839280,leach 等,《用非离心法从组织制备细胞因子组合物的方法》(methods for making cytokinecompositions from tissue using non-centrifugal methods)；和美国专利申请序列号 13/841103landrigan等,《用蛋白质溶液治疗外周血管疾病》(treatment of peripheralvascular disease using protein solutions)；所有专利都通过引用纳入本文。
[0129]
含细胞因子生成细胞的液体与固相提取材料接触可用合适容器或实现接触的其它 装置进行。接触能在连续过程中进行，其中液体流越过或穿过固相提取材料，或液体和 固相提取材料可包含于容器。如上所讨论，所述容器能包括固相提取材料，或仅用作保 持珠或其它形式材料的容器。本技术所用的容器包括本领域已知的那些，如plasmax
tm plus血浆浓缩器，市售获自巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)，且可包括以下专利所 述的那些装置和应用方法：美国专利号7,553,413,dorian等,2009年6月30日公开；和 美国专利号7,694,828,swift等,2010年4月13日公开。
[0130]
这类装置如图3a和3b所示，用于与聚丙烯酰胺凝胶珠固相提取材料示例性应用。 装置300具有上室305和下室310。上室305具有端壁315，凝胶珠搅拌器325的搅拌 器阀杆320沿着其延伸。装置300还具有沿着端壁315延伸并进入上室305的入口330。 装置300还包
括连通血浆浓缩物回路340的出口335。上室305基底包括滤器345，其 上表面支撑干的浓缩聚丙烯酰胺珠350。
[0131]
使用中，含细胞因子生成细胞的液体355和可选的血小板经入口330注入上室305 并与聚丙烯酰胺珠350混合。流体355和聚丙烯酰胺珠350可通过旋转搅拌器阀杆320 和凝胶珠搅拌器325来混合，以帮助混合流体355和聚丙烯酰胺珠350。然后，混合的 流体355和聚丙烯酰胺珠350在所需温度下温育所需时间。随后，装置300进行离心， 从而液体传到下室310，而聚丙烯酰胺珠350被滤器345保留，由此分离聚丙烯酰胺珠 350与il-1ra和其它蛋白质的所得溶液360，所述溶液收集于下室310。溶液360可经 出口335从装置移出。
[0132]
在一些实施方式中，蛋白质溶液能以某一方法制备，其中含细胞因子生成细胞的液 体从组织中分离，随后在连续过程中接触固相提取材料。再次参考图1，在一些实施方 式中，分离110、120、135和接触140用单一设备进行，本文称为单一分离和浓缩装置 (“s/c装置”)。一个这种装置参见美国专利申请序列号13/434,245,o'connell,2012年3 月29日提交。
[0133]
s/c装置包括分离区、第一浓缩区、第二浓缩区、浮标系统、入口、止回阀、第一 回收端口和第二回收端口。图5显示s/c装置500能从全血产生抗炎性细胞因子组合物。 例如，所述方法可起始于获得一定体积的全血，其经入口510注射填入s/c装置500的 分离区505。浮标系统515位于分离区505内。浮标系统包括第一浮标组件520、第二 浮标组件525以及连接第一浮标组件520与第二浮标组件525的第三浮标组件530。第 一和第二浮标组件520、525之间的空间界定了浮标分离区535。各浮标组件的密度能根 据所需成分血(作为分离结果)来选择。浮标系统515能包括选定浮标系统，如一般用于
ꢀꢀ
ii or gps iii重力血小板分离系统的浮标系统，所述重力血小板分离系统获自巴 奥米特公司(美国印第安纳州华沙)。美国专利号7,845,499、美国专利号7,806,276和美 国专利号7,992,725公开了浮标系统。
[0134]
获得蛋白质溶液的方法包括离心旋转s/c装置500。离心力使浮标系统515能穿过 全血，导致部分全血位于浮标分离区535。例如，此部分可包括富血小板血浆。使用回 收注射器，选定部分能经第三浮标组件530从收集体积535中移出，第三浮标组件530 界定与收集通道545相连的移出通道540。连接弯管550可与移出通道540互连，从而 能经连接弯管550、移出通道540和浮标收集通道545形成真空。收集管555能与带回 收弯管560的连接弯管550互连，回收弯管560从壁565延伸，壁565可以是浓缩区570 的底壁。第二回收管575可首先与止回阀集合580和第一回收端口585相连。第一回收 端口585能通过卢尔锁式连接或其它合适连接与回收注射器相连。
[0135]
止回阀集合580确保移出部分以一个方向流动并防止移出部分再进入第二回收管 575。此外，当材料从第一回收端口585推回止回阀集合580从而材料会进入浓缩区570 时，止回阀580内的阀盘可朝着第二回收管575向下弯曲并关闭开口，从而打开止回阀 集合580内的第二开口。第二开口使该部分能推入浓缩区570。
[0136]
因此，成分血随后经第一回收端口285、止回阀集合580再注入浓缩区570的上体 积588。向上体积588中的成分血加入聚丙烯酰胺珠590，该成分血和聚丙烯酰胺珠590 可振荡混合。可选地，所述成分血和珠590能在方法操作前温育选定时间段。
[0137]
所述方法包括离心旋转的第二步。第二次离心中，通过推动抗炎性细胞因子组合
物 通过滤器592并进入浓缩区570的低浓度区595，抗炎性细胞因子组合物与珠590分离。 所述蛋白质溶液可经第三回收管596撤回并用第二回收注射器从第二回收端口598撤 出。所述注射器能再次通过锁式连接与第二回收端口相连。
[0138]
再次参考图1，液体与固相提取材料接触后，分离蛋白质溶液，如步骤150所示。 通过抽出至少部分液体体积且留下珠，可完成分离。一些情况下，提取材料可在抽出蛋 白质溶液前通过离心沉淀。分离还可由过滤进行，其中所述材料被滤器保留而蛋白质溶 液通过滤器，例如用离心力或真空。如果采用干的聚丙烯酰胺珠与提取材料温育，液体 体积可减少，因为珠在再水合后会膨胀，从而浓缩所得蛋白质溶液。为维持增加的浓度， 分离步骤必须小心以防止挤压珠或液体从膨胀珠中脱离。例如，高离心力或高真空可能 破坏珠和/或将液体抽离珠内部体积。
[0139]
可选的电磁刺激
[0140]
在液体与固相提取材料接触之前或期间，细胞因子细胞悬液能用电磁场刺激。因此， 在一些实施方式中，刺激含所述细胞的液体可在液体接触固相提取材料之前进行。然而， 优选至少部分接触步骤和至少部分刺激步骤在时间上重叠，从而含所述细胞的液体同时 与固相提取材料接触并用电磁场刺激。
[0141]
用电磁场刺激细胞因子细胞悬液可涉及多种形式的电磁场刺激，如脉冲电磁场或电 容耦合电磁场。在一些实施方式中，所述液体用偶联刺激线圈的电源刺激。经过线圈的 电流产生脉冲磁场，其在液体中诱导脉冲电场。线圈可部分包围保持在容器内的液体， 所述容器如管或注射器。线圈可并入保持细胞因子细胞悬液的容器或可移出。例如，塑 料管能用整体式线圈形成或线圈能暂时偶联容器或置于容器内；例如，管能配置成使线 圈可接到容器上。需要时，电源可偶联线圈以进行刺激步骤。
[0142]
用电磁场刺激液体还可包括跨液体放置至少2个电极。然后，电能可应用于电极以 电容耦合电极并在之间产生电磁场。因此，电磁场能穿过液体，从而增加细胞因子生成 速度和/或量。在其它实施方式中，电极能用于产生直流电或者一个或多个线圈能用于产 生脉冲电磁场。
[0143]
刺激期间的电磁场强度可以是至少约0.5微伏/厘米，无论是由直流电、电容耦合电 流或是脉冲电磁场生成。在直流电电极的情况下，电流振幅可以是约1-约200微安，在 一些实施方式中，振幅可以是约20-约100微安。在其它实施方式中，电流可以是约20、 约60或约100微安。然而，应理解电流振幅可以是其它合适量级。
[0144]
刺激步骤中应用的电磁场可恒定或随着时间变化。例如，能应用正弦时变电磁场， 采用跨液体放置的电极。这种正弦时变电磁场可具有约1伏-约10伏的跨电极峰值电压， 在一些实施方式中，峰值电压可以是约5伏。产生的对应电场振幅可为约0.1微伏/厘米 (mv/cm)-约100mv/cm，在一些实施方式中，可为约20mv/cm。正弦时变电场的频率 可为约1,000hz-约200,000hz，在一些实施方式中，频率可为约60,000hz。
[0145]
应用于液体的电磁场还可以是脉冲电磁场。脉冲电磁场能用外部线圈和脉冲发生器 诱导。在此方面，脉冲电磁场可具有约10微秒/脉冲-约2000微秒/脉冲的脉冲持续时间。 在一个实施方式中，脉冲持续时间可以是约225微秒。脉冲可包括电磁爆发，其中爆发 能包括1个脉冲-约200个脉冲。或者，电磁场可具有含约10脉冲-约30脉冲的爆发。 就此而言，在一个实施方式中，各爆发能包括约20脉冲。
[0146]
脉冲电磁场中爆发的频率可变。就此而言，在一些实施方式中，爆发能以约1hz
‑ꢀ
约100hz的频率重复，在其它实施方式中，能以约10hz-约20hz的频率重复。此外， 爆发能以约1.5hz、约15hz或约76hz的频率重复。爆发的持续时间可为约10微秒到 多至约40,000微秒。在此方面，爆发的持续时间可为约4.5微秒。
[0147]
产生电容耦合电磁场的合适装置包括髓刺激器(新泽西州帕西帕尼的 ebi(ebi,l.p.))或dc刺激装置如 xl脊柱融合刺激器(新泽西州帕西帕尼的ebi)。 脉冲电磁场能用多种已知方法和设备生成，如用单线圈或一对亥姆霍兹线圈。例如，合 适的设备包括ebi骨愈合系统2001型(新泽西州帕西帕尼的ebi)和btbs刺激线圈。 关于直流电，电场可用任何已知产生直流电场的装置生成，例如osteogen
tm
植入式骨生 长刺激器(新泽西州帕西帕尼的ebi)。可使用产生电磁场的其它合适设备。
[0148]
根据液体与固相提取材料接触的需要，电磁刺激细胞因子细胞悬液可连续和/或重 复。然而，应理解，用电磁场刺激液体的步骤包括不是与周围条件相关电场或电磁场(如 通过偶然暴露于收音机、电话机、台式计算机或类似设备而产生的电磁场)的场，或除 与周围条件相关电场或电磁场之外还包括其它场。
[0149]
在一些实施方式中，如图1所示的接触和刺激步骤都在小于约1小时内进行。接触 和刺激步骤还能在约20℃-约37℃的温度范围进行。在优选实施方式中，所述细胞因 子细胞悬液的温度在接触和刺激步骤中保持约37℃。接触和刺激步骤之一或两者通常 离体进行。
[0150]
形成蛋白质溶液的其它方法
[0151]
本技术提供形成蛋白质溶液组分的其它方法，如混合蛋白质和其它组分并且分离和 浓缩蛋白质及组分，而不用固相提取材料。例如，如上所述，通过混合这些方法所制备 蛋白质与从同种异体来源分离组织所制备的组分或溶液并用固相提取材料处理，能制备 本技术的蛋白质溶液。
[0152]
例如，多种方法提供非细胞或基本非细胞蛋白质溶液，包括一种或多种上述蛋白质。 不意在限制本技术的范围、机制或功能，这种非细胞抗炎性细胞因子组合物可在某些应 用中提供优势，只要其在施用对象中不产生免疫原性应答。
[0153]
例如，特别地，蛋白质溶液可包括白介素-1受体拮抗剂(il-1ra)，除了上述方法以 外，il-1ra是合成或重组的，或分离自自体、同种异体或异种血液或其它生物来源。例 如，kineret
tm
(阿那白滞素)是il-1ra的重组、非糖基化形式，可获自安进公司(加利福尼 亚州千橡市)。多种重组白介素-1抑制剂和治疗方法参见美国专利号6,599,873,sommer 等,2003年7月29日公开；美国专利号5,075,222,hannum等,1991年12月24日公开； 和美国申请公开号2005/0197293,mellis等,2005年9月8日公开。另外，包括使用自身 体液在内的从体液生成il-1ra的方法参见美国专利号6,623,472,reinecke等,2003年9 月23日公开；美国专利号6,713,246,reinecke等,2004年3月30日公开；和美国专利 号6,759,188,reinecke等,2004年7月6日公开。要生成同种异体抗炎性细胞因子组合 物时，来自多个对象的多种来源il-1ra可汇集在一起。
[0154]
更一般地，制备非细胞蛋白质溶液的方法能包括在天然生成抗炎性细胞因子如 il-1ra的细胞培养物中培养细胞，或培养改造成产生这些细胞因子的细胞。天然生成抗 炎性细胞因子的细胞的非限制性示例包括脂肪组织细胞、脂肪细胞、脂肪来源干细胞、 基质
细胞、骨髓细胞、间充质干细胞和血细胞。
[0155]
在各种实施方式中，细胞系能改造成过量生成抗炎性细胞因子。抗炎性细胞因子的 非限制性示例包括vegf、tnf-α、il-1ra、stnf-ri、stnf-rii、pgdf-ab、pdgf-bb、 igf-i、egf、tgf-β1、sil-lrii和hgf。过表达抗炎性细胞因子的稳定真核细胞系能如 下产生：用重组dna转染真核细胞如哺乳动物细胞，所述重组dna包括编码抗炎性 细胞因子的基因和选择标记。或者，原核生物和酵母通过重组dna转化能改造成过表 达抗炎性细胞因子，所述重组dna包括编码抗炎性细胞因子的基因和选择标记。转化 和转染可用重组dna分子进行，所述分子包括编码抗炎性细胞因子如il-1ra的dna 序列和选择标记。真核和原核细胞能改造成组成型或经诱导过表达抗炎性细胞因子。在 真核和原核细胞中表达抗炎性细胞因子如il-1ra、stnf-ri、stnf-rii和sill-rii的方 法参见美国专利号6,337,072,ford等,2002年1月8日公开；和美国申请公开号 2001/0053764,sims等,2001年12月20日公开。
[0156]
il-1ra基因在人中转录时，mrna可剪接成4个变体，产生4种翻译il-1ra亚型。 seq id no:1、3、5和7分别是il-1ra亚型1-4的cdna，seq id no:2、4、6和8分 别是il-1ra亚型1-4的氨基酸序列。il-1ra亚型统称为“il-1ra”。seq id no:9是stnf-ri 的cdna序列且seq id no:10是stnf-ri的氨基酸序列。seq id no:11是stnf-rii 的cdna序列且seq id no:12是stnf-rii的氨基酸序列。seq id no:13是sil-lri 的cdna序列且seq id no:14是sil-lri的氨基酸序列。seq id no 15和17分别是 sil-lriiv1和sil-lriiv3的cdna且seq id no:16和18分别是sil-lriiv1和sil-lriiv3 的氨基酸序列。il-1riiv2的cdna序列是非编码序列；因此，其不包括在内。
[0157]
为在原核培养物特定例如细菌中表达il-1ra、stnf-ri或stnf-rii(一般称为“感兴 趣蛋白质”)，将cdna序列(seq id no:1、3、5、7、9、11、13、15或17)克隆到适合 细菌的表达载体中。表达载体应包括强启动子和选择标记如抗生素抗性。能杀死细菌细 胞的抗生素的非限制性示例包括氨苄青霉素、四环素、卡那霉素和氯霉素。表达载体还 应包括引起感兴趣蛋白质组成型或诱导型表达的元件。可选地，与功能性偶联感兴趣蛋 白质的标签对应的dna序列可存在于载体中，毗邻感兴趣蛋白质的基因，所述标签能 鉴定和纯化蛋白质。例如，n或c末端his标签能用于检测带抗his抗体的蛋白质，且 能在镍柱上纯化。制备含感兴趣蛋白质表达基因的表达载体时，细菌细胞例如大肠杆菌 (e.coli)能用该表达载体转化。选择标记确保仅转化有载体的细胞在lb肉汤中存活，所 述lb肉汤补充有对应选择标记的抗生素。然后，细菌能在补充有抗生素的lb肉汤中 生长，以用于表达和纯化。表达载体、克隆感兴趣蛋白质到表达载体中的方法、转化原 核细胞的方法、从经转化原核细胞表达蛋白质的方法以及蛋白质纯化方法通常为本领域 普通技术人员已知。
[0158]
为在真核培养物例如哺乳动物细胞中表达感兴趣蛋白质，将cdna序列(seq id no: 1、3、5、7、9、11、13、15或17)克隆到适合特定哺乳动物细胞的表达载体中。表达 载体应包括强启动子和选择标记如抗生素抗性。能杀死哺乳动物细胞的抗生素的非限制 性示例包括遗传霉素和庆大霉素。表达载体还应包括引起感兴趣蛋白质组成型或诱导型 表达的元件。可选地，与功能性偶联感兴趣蛋白质的标签对应的dna序列可存在于载 体中，毗邻感兴趣蛋白质的基因，所述标签能鉴定和纯化蛋白质。制备含感兴趣蛋白质 表达基因的表达载体时，哺乳动物细胞如人细胞能用该表达载体转染。转染细胞能在细 胞培养基中生长，所述培养基补充有对应选择标记的抗生素。抗生素的存在能分离稳定 细胞系。然后，稳定
细胞系能在补充有抗生素的细胞培养基中生长，以用于表达和纯化。 表达载体、克隆感兴趣蛋白质到表达载体中的方法、转染真核细胞和开发稳定细胞系的 方法、从经转染真核细胞表达蛋白质的方法以及蛋白质纯化方法通常为本领域普通技术 人员已知。
[0159]
或者，可培养未通过dna转染改变基因的真核细胞。所述真核细胞可以是原代培 养物，即细胞直接生长自真核供体如人，或真核细胞可以是确立的细胞系。许多确立细 胞系可市售获自美国模式培养物保藏中心(american type culture collection,inc.)(美国 弗吉尼亚州马纳萨斯)。所述细胞能与外源信号如重组蛋白质一起生长。真核细胞通常 在有细胞培养基的培养瓶中培养。从瓶中回收细胞培养基，离心以移出非贴壁细胞。
[0160]
细胞培养可以是单层培养、非贴壁培养或生物反应器。单层培养包括在适当基质上 培养的锚依赖性细胞，所述底物允许细胞粘附和伸展，如细胞培养瓶和细胞培养皿。非 贴壁培养包括在悬液中维持的细胞。合适的细胞是非锚依赖性，或其是适合悬浮培养的 锚依赖性细胞。许多细胞系例如许多昆虫细胞，能单层或悬浮生长。生物反应器是能支 持生物活性环境的装置，其中完成化学过程和/或获得生化活性物质。生物反应器可包括 悬浮或固定细胞。单层培养、非贴壁培养和生物反应器能通过本领域常用方法维持。
[0161]
在一些实施方式中，细胞培养物经受电磁场，从而刺激一种或多种蛋白质生成。用 电磁场刺激培养物可涉及多种形式的电磁场刺激，如脉冲电磁场或电容耦合电磁场。刺 激的方法和条件包括上述那些。
[0162]
细胞培养物能向培养基自然释放抗炎性细胞因子，或所述培养物可经诱导释放抗炎 性细胞因子到培养基中。通过抽吸、离心或过滤可分离培养基，以用于形成非细胞抗炎 性细胞因子组合物。
[0163]
在一些实施方式中，从尿中分离抗炎性细胞因子，用于生成本技术的蛋白质溶液。蛋白 质能通过本领域已知方法从尿中分离。一个这种方法用于proteospintm尿蛋白浓缩 maxi试剂盒，所述试剂盒获自norgen biotek公司(norgen biotek corp.)(加拿大安大略 省索罗尔德)。此试剂盒采用并入旋转柱的离子交换树脂。简言之，获得尿样品且其ph 调至3.5。尿随后转至含离子交换树脂的旋转柱，其置于收集管中。之后柱进行离心， 其中蛋白质附于树脂，剩余液体和盐流入收集管并弃去。随后，用提供的柱活化和洗涤 缓冲剂清洗蛋白质，接着离心。弃去通过的流体，重复洗涤过程。向柱加入洗脱缓冲剂 (10mm磷酸钠，ph 12.5)且向洗脱管加入中和剂。含洗脱缓冲剂的旋转柱置于洗脱管中 并离心，其中洗脱蛋白质并在含中和剂的洗脱管内捕获。
[0164]
治疗组合物
[0165]
本技术还提供含蛋白质溶液和含活性物质、生理学运载体和其组合的第二组分的组 合物。在一些实施方式中，组合物包含安全和有效量的蛋白质溶液以及安全和有效量的 第二活性剂。“安全和有效”量的组分是用于本技术方法时，足以在人或哺乳动物对象中 产生所需治疗效果的量，而没有过度不良副作用(如毒性、刺激或变态反应)，具有合理 的利益/风险比。特定安全和有效量的组分显然随着诸如以下因素而变化：所治疗具体病 症、患者的身体状况、同期疗法(如果有)性质、所用特定组分、特定给药途径和剂型、 所用运载体(如果有)、和所需剂量方案。
[0166]
本文所用活性物质包括生物和药物活性剂。生物活性剂包括成分血，如prp、血液 制品和浓缩骨髓抽吸物(cbma)。
冷冻干燥时，抗炎性细胞因子组合物可用合适介质170水合，在施用前或施用时。通过 混合组合物与溶液可完成水合，所述溶液包括盐水、缓冲液、血液、成分血、骨髓抽吸 物、浓缩骨髓抽吸物和其组合。
[0173]
本技术还提供含血液或其它组织来源的组分的组合物，其适合同种异体施用。特别 地，这类组合物可包括分离自哺乳动物对象或多个哺乳动物对象的蛋白质和其它组分， 所述对象是在本技术方法中给其施用组合物的对象以外的那些。进一步参考图1，从固 相提取材料分离蛋白质溶液后，冷冻干燥使得组合物适宜同种异体施用，所述组合物通 过细胞因子细胞悬液接触固相提取材料来制备，如步骤160所示。在一些实施方式中， 所述组合物能处理成移出接触步骤140后蛋白质溶液组合物中存在的细胞因子生成细 胞。移出细胞因子生成细胞的方法包括本领域已知的那些，包括过滤、凝结和重量法。 在一些实施方式中，分离含血浆的成分血和移出细胞因子生成细胞基本上同时进行。因 此，本技术提供制备非免疫原性抗炎性细胞因子组合物的方法，所述方法包括：
[0174]
(a)从哺乳动物供体获得细胞因子细胞悬液；
[0175]
(b)所述液体与固相提取材料接触以产生富含白介素-1受体拮抗剂的组合物；
[0176]
(c)从所述组合物移出细胞；和
[0177]
(d)冷冻干燥组合物以生成非免疫原性抗炎性细胞因子组合物。
[0178]
在一些实施方式中，向所述蛋白质溶液加入冻存储液，以提供后续低温存储的稳定 性。合适的储液包括本领域的那些，如甘油和二甲亚砜(dmso)。所述组合物可低温保 存，如约1℃-约6℃。在一些实施方式中，所述组合物在约-80℃液氮下保存。所述 冻存储液优选在给哺乳动物对象施用前从蛋白质溶液中移出。移出储液可由本领域已知 方法进行，所述方法用于处理含冻存剂的贮存血液。用洗液如盐水进行洗涤。在这些实 施方式中，待治疗对象的血型可与获得细胞因子细胞悬液的供体血型匹配。
[0179]
治疗方法
[0180]
本技术提供刺激软骨细胞产生，包括在胶原蛋白缺损的位置刺激软骨细胞产生，的 方法。方法包括通过刺激软骨细胞产生治疗胶原蛋白缺损。方法包括将本技术的蛋白质 溶液施用到对象中缺损的位置。如本文所述，“治疗”包括防止缺损的扩大或进展，减小 缺损的尺寸，治愈所述缺损，以及减轻或消除与缺损相关的疼痛。胶原蛋白缺损可以与 急性或慢性疾病相关，并且可以与潜在的骨、肌肉、软骨、血管组织或其它组织的伤害、 创伤、疾病或其它生理机能不全相关。在各种实施方式中，所述疼痛疾病与炎症性疾病 相关，包括il1-ra介导的炎症。这种炎症性疾病包括类风湿性关节炎、骨关节炎、骨质 溶解、肌腱炎、滑膜炎、外周血管疾病、和炎症性呼吸道疾病(如慢性阻塞性肺病、纤 维化、气肿、急性呼吸窘迫综合征和肺炎)。具体的疼痛疾病包括与创伤性损伤、肌肉 拉伤、关节炎(类风湿性关节炎和骨关节炎)、滑膜炎、骶髂关节病变、背疾、术后注射、 肌腱注射、运动医学手术(例如acl修复、mcl修复、btb修复、髌骨修复或软骨修 复)、挫伤、肌肉拉伤、创伤后骨关节炎相关的疼痛。
[0181]
在一些实施方式中，本技术的方法包括将蛋白质溶液施用到胶原蛋白组织缺损的位 置。所述“组织缺损”包括涉及不适合生理或化妆目的的组织的任何病症。这类缺损的示 例包括先天性的那些，由疾病、紊乱或创伤导致或具有其症状的那些，以及手术或其它 医疗过程后随之发生的那些。实施方式包括治疗血管、骨、皮肤、神经和器官组织缺损。 这类
缺损的示例包括由关节炎(骨关节炎和类风湿性关节炎)、脊柱固定术、臀部和其它 关节置换手术、慢性伤口、骨折、组织和肌肉硬化、和脊髓或其它神经损伤导致的那些。 在各种实施方式中，本发明的组合物和方法可用于与修复骨或软骨缺损相关的方法。例 如本技术提供用于在经受骨关节炎的关节位置刺激软骨细胞产生的方法，包括在关节或 在关节附近施用蛋白质溶液。
[0182]
在各种实施方式中，方法用于治疗人的软骨缺损。在其它实施方式中，治疗非人哺 乳动物中的缺损，如陪伴、役用或运动类动物。例如，本技术的这种方法可以用于治疗 马的与关节损伤相关的胶原蛋白缺损。
[0183]
在各种实施方式中，本技术的方法包括制备蛋白质溶液的照护方法。如本文所示，
ꢀ“
照护方法”中本技术的方法在给所治疗对象施用所述蛋白质溶液的时间附近进行。这类 方法可在临近位置进行，如同一房间(例如床边)或另外紧邻用所述蛋白质溶液治疗的哺 乳动物对象。在各种实施方式中，“相邻时间”可以是例如所述蛋白质溶液施用对象的12 小时内、8小时内、2小时内、1小时内或30分钟内。
[0184]
在一些实施方式中，所述蛋白质溶液与伴随治疗一起施用。例如，这种疗法包括施 用上述药物活性剂或生物活性剂。在一些实施方式中，伴随治疗与蛋白质溶液同时施用。 例如，方法可包括用安全和有效量的活性剂施用蛋白质溶液，所述活性剂选自镇痛药和 糖皮质激素。
[0185]
在一些实施方式中，方法包括用上述浓缩骨髓抽吸物施用蛋白质溶液。例如，cbma 与蛋白质溶液可同时施用。
[0186]
本技术的方法一般包括向哺乳动物对象胶原蛋白缺损的位置施用蛋白质溶液。施用 蛋白质溶液能用任何合适装置进行，包括本领域已知用于局部递送组合物到肌肉、关节、 血管或其它组织的装置。例如，用于治疗pvd的局部递送可包括在闭塞动脉中或闭塞 动脉附近，或者在闭塞动脉相邻组织或在所述组织附近注射蛋白质溶液。
[0187]
本技术的实施方式通过下列非限制性实施例进一步说明。
[0188]
实施例1：制备和鉴定蛋白质溶液
[0189]
富含白介素-i受体拮抗剂的蛋白质溶液制备自7个签署知情同意书的人供体。将血 液(55ml)吸入带5ml柠檬酸葡萄糖抗凝液a(acd-a，马萨诸塞州布伦特里的citralabs)的60cc注射器。富血小板血浆(prp)用 iii血小板浓缩系统(800-1 003a，印 第安纳州华沙巴奥米特公司)根据使用说明书产生。通过向含1克聚丙烯酰胺珠的改良 plasmax装置(印第安纳州华沙巴奥米特公司)加入6ml prp，产生所述溶液。从plasmax 装置移出il-1ra溶液并在-50℃冷冻以用于测定。细胞因子含量在16-plexelisa(searchlight蛋白质阵列，马萨诸塞州比尔里卡的aushon生物系统公司(aushonbiosystems))上测定。分析物包括il-4、il-10、il-11、il-i3、il-ira、ifn-γ、stnf-ri、 stnf-rii、il-1α、il-ιβ、tnf-α、il-17、il-18、bfgf、tbf-β1和tbf-β2。
[0190]
所述溶液含有同化细胞因子(bfgf、tgf-β1、tgf-β2(见表3))和抗炎性细胞因子 (il-1ra、stnf-ri、stnf-rii、il-4、il-10、il-11、il-13、ifn-γ(见表4))，不表达大剂 量异化细胞因子(il-lα、il-ιβ、tnf-α、il-17、il-18(见表5))。抗炎性细胞因子il-1ra 和stnf-r均以ng/ml量检测，而所有异化分析物采用pg/ml量。然而，检测到供体间 变异性。对比异化细胞因子il-1和tnf-α与抗炎分析物il-1ra和stnf-r之间的相关 性，未检测到大相
关性(表6)。平均来说，il-1ra是il-lα的约13,260倍且是il-1β的约7,561倍。
[0191]
表3.溶液中的同化细胞因子
[0192][0193]
表4.溶液中的抗炎性细胞因子
[0194][0195]
表5.溶液中的异化细胞因子
[0196][0197]
表6.相关性分析
[0198][0199]
实施例2：从富血小板血浆产生il-1ra
[0200]
il-1ra溶液如下产生。从5个健康志愿者中采全血(70ml)，用acd-a(美国马萨诸 塞州布伦特里)抗凝(10％)。保留部分(10ml)用于全血测量。富血小板血浆(prp)(6ml) 用
ꢀ
ii系统(印第安纳州华沙巴奥米特公司)产生。根据验证程序收集全血和prp样 品的血细胞计数，如woodell-may je,ridderman dn,swift mj,higgins j."生成富血小板 血浆的准确血小板计数：血液分析器验证和计数的制备技术(producing accurate plateletcounts for platelet rich plasma:validation of a hematology analyzer and preparationtechniques for counting)"j.craniofac.surg.(2005)9月16日(5):749-56所述。
[0201]
prp生成后，向改良血浆浓缩装置(plasmax
tm
，美国印第安纳州华沙巴奥米特公司) 加入5ml prp，用装置内的聚丙烯酰胺脱水珠室温温育24小时。与聚丙烯酰胺珠电磁 场接触后，离心血浆浓缩装置以分离血清部分。
[0202]
为分析时间零点时的基线il-1ra水平，全血和prp样品用50μl凝血酶和10％ cacl2(1,000单位/ml)活化。形成血凝块并室温温育30分钟。温育后，所述凝块以3,000 rpm离心5分钟。从凝块中收集血清并保留用于elisa分析。来自血浆浓缩器的血清部 分不需要通过凝血酶活化，可直接测试。分析所有样品的il-1ra，使用elisa试剂盒(il
‑ꢀ
lra quantikine
tm
试剂盒，美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物(r&d systems))。
[0203]
prp样品产生约8倍血小板增加、约5倍总细胞因子生成细胞(wbc)增加、约9倍 wbc单核细胞部分增加、和约3倍wbc pmn部分增加。全血和prp样品的il-1ra生 成与wbc浓度最紧密相关。prp的5倍增长可能源于wbc增加，全血和prp il-1ra 值都能视作基线il-1ra含量。这与血浆浓缩器温育后il-1ra增长195倍不同。此血浆浓 缩装置通常引起血浆蛋白质浓度增加3倍，这归因于干燥过程导致体积减少。此3倍体 积减少不引起所见的il-1ra量水平增加。因此，此水平增加指示在接触固相提取材料(如 聚丙烯酰胺珠)和电磁场刺激期间刺激wbc生成il-1ra。
[0204]
相关性分析显示il-1ra生成与wbc增加的关联比血小板含量更密切。il-1ra水平 与prp中的wbc群不紧密相关。这不令人惊讶，因为wbc未活化，且通过凝血酶活 化血浆来收集血清。然而，可能一旦wbc在血浆浓缩装置中活化，其参与所见的显著 il-1ra生成。
[0205]
实施例3：从prp生成蛋白质溶液
[0206]
从5个人供体收集抗凝血(120cc)。富血小板血浆(prp)用一次性 iii(印第安纳 州华沙巴奥米特公司)制备。将prp加样到改良血浆浓缩装置(plasmax
tm
，美国印第安 纳州华沙巴奥米特公司)并处理。输出分成4组：有和没有凝血酶活化(1m cac12中1000 u/ml)的浓缩血浆中的il-1ra，有和没有凝血酶活化的无细胞il-1ra。il-1ra用elisa(安 迪生物)随着时间测量。
[0207]
prp接触plasmax
tm
装置中的聚丙烯酰胺珠，同时用电容耦合电磁场提供电磁场刺 激。
[0208]
未凝结prp在24小时内平均生成约50ng。无细胞样品在24小时内平均生成约34 ng，而没有变化。一旦凝结，il-1ra洗脱变慢，10小时后仅约30％洗脱。无细胞样品释 放也延迟，但10小时后洗脱100％可用il-1ra。
[0209]
实施例4：产生蛋白质溶液和鉴定健康对象及骨关节炎对象中的细胞因子水平
[0210]
来自健康患者的自体蛋白质溶液(aps)如下制备以用于测量生长因子。从6个供体 通过静脉穿刺各采72ml抗凝全血。3ml的各供体抗凝全血等分到微量离心管中并于
ꢀ‑
50℃冷冻。将60ml抗凝全血加样到 iii一次性装置(美国印第安纳州华沙巴奥米 特公
司)，根据厂商说明书处理以生成prp。prp从 iii装置中移出并加入plasmax
tm
装置(美国印第安纳州华沙巴奥米特公司)，根据厂商说明书处理以生成aps。从各装置 提取aps，等分到微量离心管中，-50℃冷冻。全血和prp的各样品接受3个冻融循环。 就各aps和全血样品而言，用于vegf、pdgf-bb、pdgf-ab、egf、tgf-β1、tgf-p2 和igf-1的quantikine人免疫测定(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物)根据厂商 说明书一式两份进行。
[0211]
来自健康患者的aps如上制备以用于测量抗炎性细胞因子。就各aps和全血样品 而言，用于il-1ra、il-1β、il-8、stnf-ri、tnf-α、il-6、stnf-rii、il-10、il-13和 il-4的quantikine人免疫测定(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的安迪生物)根据厂商说明 书一式两份进行。还进行免疫测定以检测肝细胞生长因子(hgf)和可溶性il-1rii。
[0212]
来自105名骨关节炎患者的aps如上制备以用于测量生长因子抗炎性细胞因子。 aps在-50℃或干冰保存。
[0213]
对比健康供体与oa患者在基线血液和aps中的细胞因子浓度。il-ιβ在oa患者 中浓缩水平更高，但倍数增加仍远低于il-1ra。浓缩到至少健康供体所见水平的其它细 胞因子和生长因子包括stnf-ri、igf-i、il-8、vegf和il-6。可溶性细胞因子stnf-rii 和sil-1rii浓缩到与健康浓缩水平极类似的水平，虽然没有那么高。结果示于表7。
[0214]
表7.从健康患者和骨关节炎患者所得aps的生长因子及抗炎性细胞因子浓度(pg/ml)
[0215][0216][0217]
实施例5：从脂肪组织产生蛋白质溶液
[0218]
脂肪基质细胞如下制备。脂肪组织切成小块(约1cm3)，用2mg/ml i型胶原酶(新 泽西州莱克伍德的沃辛顿生化公司(worthington biochemical corp.))在间歇式机械搅拌 下37℃水浴消化180分钟。通过加入培养基或血源性溶液可中和消化作用。离心细胞 悬液(300xg持续7分钟，25℃)，然后从细胞团块中移出上清。随后，团块重悬于相容 溶液以提供含脂肪基质细胞的液体体积。
[0219]
或者，所述团块悬于获自对象的全血，加入gps
tm
血小板浓缩系统，所述系统来自 巴奥米特公司(美国印第安纳州华沙)。离心后，从该系统提取富血小板血浆层，其还包 含脂肪基质细胞。
[0220]
脂肪基质细胞可选包括富血小板血浆层，随后与聚丙烯酰胺珠组合并通过使用一对 亥姆霍兹线圈施加脉冲电磁场以刺激il-1ra生成。脂肪基质细胞和聚丙烯酰胺珠与液体 溶液分离获得富含il-1ra的溶液。
[0221]
实施例6：从脂肪组织提取物产生蛋白质溶液
[0222]
il-1ra的治疗组合物从分离自脂肪组织的基质细胞产生。分离人基质细胞如下进行： 从吸脂/抽脂术获得人皮下脂肪组织，在i型胶原酶溶液(新泽西州莱克伍德的沃辛顿生 化公司)中消化，37℃温和搅拌1小时。解离细胞用500μm和250μm nitex滤器过滤。 所述部分以300xg离心5分钟。弃上清，细胞团块重悬于相容溶液如血源性溶液。
[0223]
术语的非限制性讨论
[0224]
本文所用的标题(如“背景技术”和“发明内容”)和副标题仅用于本公开范围内主题的 一般结构，且不意在限制本技术公开内容或其任何方面。特别地，“背景技术”中公开的 主题物可包括新技术且不构成对现有技术的列举。“发明内容”中公开的主题物不是本技 术或其任何实施方式完整范围的全部或完全公开。本说明书章节内的材料出于方便按具 体效用分类或讨论，但不应由此推论该材料用于任何给定组合物时，必须或仅根据本文 分类起作用。
[0225]
本公开引用的所有专利和专利申请的公开内容通过引用纳入本文。
[0226]
描述本技术实施方式的说明和特定实施例仅用于阐述目的且不意在限制本技术范 围。特定实施方式、材料、组合物和方法的等价改变、修改和变化在本技术范围内作出， 结果基本相似。此外，列举有所示特征的各种实施方式不意在排除有另外特征的其它实 施方式，或纳入不同组合所示特征的其它实施方式。提供特定实施例以阐明如何制备和 应用本技术的组合物及方法，且除非另有明确说明，否则不用于表示本技术的给定实施 方式有或没有进行或测试。
[0227]
本文所用的单词“优选”或“优选的”指本技术的实施方式在某些情况下提供特定益 处。然而，其它实施方式也可在相同或其它情况下优选。此外，列举一个或多个优选实 施方式不意味着其它实施方式没有用，且不意在从本技术范围中排除其它实施方式。
[0228]
本文所用的单词“包括”和其变体无限制性，从而在列表上列出条目不排除其它类似 条目也可用于本技术的材料、组合物、装置和方法。类似地，术语“能”和“可”及其变体 无限制性，从而关于实施方式能或可包括某些元件或特征的叙述不排除未含有这些元件 或特征的本技术其它实施方式。
[0229]
尽管开放式术语“包括”作为非限制性术语如包括、包含或具有的同义词，在本文中 用于描述本技术的实施方式并要求权利，但实施方式可用更具限制性术语“由
……
组成
”ꢀ
或“基本由
……
组成”替代描述。因此，对于列举材料、组分或方法步骤的任何给定实施 方式，本技术还特定包括由所述材料、组分或方法组成的实施方式，或基本由其组成， 排除额外材料、组分或方法(用于“由
……
组成”)和排除影响实施方式重要性质的额外材 料、组分或方法(用于“基本由
……
组成”)，尽管这些额外材料、组分或方法在本技术中 未明确详述。例如，列举元件a、b和c的组合物或方法详述特定设想了由a、b和c 组成的实施方式，或基本由其组成，排除本领域可能列举的元件d，尽管元件d未明确 描述为被本文排除。此外，如本文所用，术语“基本由所列举材料或组分组成”设想了“由 所列举材料或组分组成”的实施方式。
[0230]
本文所用的“一个”和“一种”表明存在“至少一个”项目；可能时，可存在多个这类项 目。“约”用于数值时，表明计算或测量允许数值略微不精确(用一些方法来达到值精确； 近似或相当接近值；几乎)。出于某种原因，如果“约”提供的不精确根据此通常意义在本 领
域无法理解，则本文所用的“约”表明测量或使用这类参数的普通方法至少可引起变 化。
[0231]
如本文所示，除非另有特定说明，范围涵盖终点且包括披露所有不同值和完整范围 内的更多划分范围。因此，例如，“从a到b”或“从约a到约b”的范围涵盖a和b。披 露特定参数(如温度、分子量、重量比分比等)的值和值范围不排除本文所用的其它值和 值范围。设想给定参数的2个或更多特定示例值可定义所述参数要求的值范围终点。例 如，若参数x在本文中例示具有值a且还例示具有值z，设想参数x可具有从约a到 约z的值范围。类似地，设想披露参数的2个或更多值范围(无论所述范围是嵌套、重 叠或是不同的)会归入该值所有可能的范围组合，其可以用所公开范围的终点要求。例 如，若参数x在本文中例示具有1-10、或2-9、或3-8的值范围，还设想参数x可具有 包括1-9、1-8、1-3、1-2、2-10、2-8、2-3、3-10和3-9在内的其它值范围。