一种透明软骨脱细胞基质复合支架的制备方法

1.本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种透明软骨脱细胞基质复合支架的制备方法。


背景技术：

2.关节软骨(articular cartilage)在关节中相连骨的表面，覆有一层关节软骨，或为透明软骨，或为纤维软骨。剧烈运动造成的软骨损伤以及机体衰老产生的软骨退化已成为骨科临床治疗中经常面临的问题。由于软骨组织自身无血管、无淋巴，使得软骨组织损伤后自修复能力十分困难，目前，组织工程化软骨移植修复是关节软骨修复的治疗方法之一。软骨组织工程是将软骨种子种植于可生物降解、组织相容性好的生物材料形成复合物，然后再把该复合物植入软骨缺损处，生物材料自行降解的过程中，种植的细胞形成新的软骨来填充缺损。
3.目前对于关节软骨的研究多采用高分子材料或是ⅰ型或ⅱ型胶原海绵等支架进行软骨缺损修复，由于医用高分子材料生物相容性差且其降解产物对组织有破坏性，而单一的胶原海绵力学性能差，还可能会导致软骨骨化，采用多层结构存在形态不稳定容易造成层分离等现象。可见，不同的生物材料制备软骨支架还存在一定的缺陷。现有技术中制备软骨支架常采用透明质酸或胶原基质作为软骨组织的重要构成成分，但是，采用这两种材料进行制备时还需要添加更多的反应试剂和原料来制备软骨支架，如：为了提高胶原的力学强度往往会添加化学交联剂进行制备，由于交联剂具有细胞毒性，制备的支架不适宜用来和细胞共培养，这种方法不仅提高了制备成本，其方法也繁琐复杂，其制备得到的软骨支架的力学强度和细胞相容性都较差。如中国专利公开了一种具有仿生功能界面骨软骨复合组织一体化工程支架，其中，采用2型胶原和壳聚糖制备软骨层，但是该方法最终制备的是多层的骨-软骨复合支架，并不能仅适用于软骨修复，且该方法制备得到的软骨层对的力学强度和生物相容性还有待提升，对其具体的性能并没有精确探究和说明，也并不适用于软骨或间充质干细胞的粘附生长，以及后期的增殖分化等。因此，急需研究和开发出能够仅适用于软骨修复的，能和细胞共同培养，具有优良力学性能、孔隙率的软骨支架，在降低软骨支架的制备成本、简化制备过程的同时，能应用于组织工程软骨的模型研究中，为软骨缺损治疗提供最佳的选择。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供仅适用于软骨修复的一种透明软骨脱细胞基质复合支架的制备方法。
5.本发明的目的是提供一种透明软骨脱细胞基质复合支架的制备方法。
6.本发明另一目的是提供一种透明软骨脱细胞基质复合支架。
7.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
8.本发明研究采用猪的关节透明软骨来制备脱细胞软骨海绵基质，其含有透明软骨
的基本构成胶原：2型胶原，还保留了大量软骨基质本身的蛋白聚糖成分和生物活性因子，利用动物软骨制备脱细胞胶原基质，具有良好的生物相容性和弹性，能够一定程度上模拟软骨的基本结构；再结合壳聚糖水凝胶，改善其力学强度，在不用添加其他任何交联剂或生物化学材料的前提下，制备得到能适用于细胞培养的，具有优异孔隙率和力学强度的软骨支架，仅适用于软骨修复。
9.本发明提供一种透明软骨脱细胞基质复合支架的制备方法，包括以下步骤：
10.s1.提取关节软骨组织：选取猪膝关节，进行冲洗后剥离软骨组织，并将软骨组织切碎、冻干、粉碎，得到软骨粉末；
11.s2.软骨粉末脱细胞处理：在步骤s1制备得到的软骨粉末中添加表面活性剂和蛋白酶阻断剂，脱细胞后漂洗，收集沉淀；
12.s3.向步骤s2收集的沉淀加入核酸酶，消化，漂洗，再收集沉淀，冻干，即得软骨脱细胞基质；
13.s4.复合支架的制作：将步骤s3制备得到的软骨脱细胞基质配制为混悬液；再将软骨脱细胞基质混悬液和壳聚糖水凝胶添加到支架模具中，混合后冻干处理，即得透明软骨脱细胞基质复合支架。
14.优选地，步骤s1中采用猪膝关节为健康新鲜猪膝关节，并选取股骨远端及胫骨近端关节面的透明软骨。
15.优选地，步骤s1中将软骨组织切碎为3～5mm直径的软骨组织碎片。
16.优选地，步骤s1的软骨粉末粒径为100μm以下。
17.优选地，步骤s1中冻干先将软骨组织碎片于-70～-90℃预冻8～10h后，再进行冻干12～16h。
18.优选地，其特征在于，步骤s2中采用的表面活性剂和蛋白酶阻断剂为triton x-100和苯甲基磺酰氟。
19.优选地，步骤s2中脱细胞条件为：0～5℃，90～100rpm/min，10～14h。
20.更优选地，步骤s2中脱细胞为在4℃下震荡12h。
21.优选地，步骤s3中的核酸酶采用50μ/ml dna酶和1μ/ml rna酶。
22.优选地，步骤s5中的软骨脱细胞基质混悬液的质量分数为9.99～10.01％，所述壳聚糖水凝胶的质量体积浓度为0.99％～1.01％。
23.更优选地，软骨脱细胞基质配制为混悬液的质量分数为10％，壳聚糖水凝胶的质量体积浓度为1％。
24.优选地，步骤s5中软骨脱细胞基质混悬液和壳聚糖水凝胶的体积比为1～15:1。
25.更优选地，软骨脱细胞基质混悬液和壳聚糖水凝胶的体积比为10:1。
26.优选地，步骤s5中冻干为：在-70～-90℃预冻8～10h后，再冻干6～9h。
27.更优选地，在-80℃条件下冷冻10h再冻干8h。
28.本发明提供上述方法制备得到的透明软骨脱细胞基质复合支架。
29.本发明具有以下有益效果：
30.本发明方法制备得到软骨支架的仅适用于软骨修复，采用猪软骨来制备脱细胞软骨海绵基质，含有2型胶原，并保留了大量软骨基质本身的蛋白聚糖成分和生物活性因子，利用动物软骨制备脱细胞胶原基质，能够一定程度上模拟软骨的基本结构；采用壳聚糖作
为原料，通过优化使用比例，使支架的力学条件更加稳固，同时具有良好的孔隙率、吸水性以及生物相容性和弹性。本发明不采用交联剂也可以很好的保存脱细胞基质里的活性生物因子，也能具有良好的细胞相容性，构成的支架有较好的孔隙率，利于细胞的三维生长和增殖分化，获得最适宜用于组织工程软骨的复合支架。
附图说明
31.图1为添加不同比例的脱细胞软骨基质与和壳聚糖的透明软骨脱细胞基质复合支架(1:1、5:1、10:1、15:1)的外观比较；
32.图2为三组添加不同比例壳聚糖的透明软骨脱细胞基质复合支架在干、湿两种状态下的大体外形(a、b、c分别为15:1、10:1、5:1在干燥状态下的外观；d、e、f分别为15:1、10:1、5:1在浸泡pbs溶液后湿润状态下的外观)；
33.图3为扫描电镜不同放大倍数下的e10c1组透明软骨脱细胞基质复合支架(左为放大倍数390倍，右为放大倍数490倍)；
34.图4为atdc5细胞在透明软骨脱细胞基质复合支架的生长情况；
35.图5为atdc5细胞在透明软骨脱细胞基质复合支架上生长的扫描电镜图。
具体实施方式
36.以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
37.除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
38.f12/dmem细胞培养基、胰蛋白酶(tn)和edta购自gbico公司，美国；胎牛血清购自sigma公司，德国；cck8试剂盒购自dojindo公司，日本。
39.小鼠软骨瘤细胞株atdc5细胞购自于abgent公司，加拿大。
40.实施例1透明软骨脱细胞基质复合支架的制备
41.1、提取关节软骨组织：
42.(1)选用健康新鲜猪膝关节，进行流水冲洗和漂洗；
43.(2)将股骨远端及胫骨近端关节面的透明软骨剥离，并切成3～5mm直径的软骨组织碎片；
44.(3)采用pbs漂洗软骨碎片3次，根据清洗程度，分别漂洗15、10、5min；
45.(4)将软骨碎片-80
°
预冻8～10h后，冷冻干燥机冻干12～16h；
46.(5)将冻干后的软骨碎片用粉碎机多次短时间(30s～90s)粉碎，以防止粉碎机工作时温度过高而破坏软骨细胞外基质中的生物活性成分。
47.(6)采用100μm筛网筛选出粒径100μm以下的软骨粉末备用。
48.2、猪透明软骨粉末脱细胞处理：
49.(1)将含1％triton x-100和0.035％蛋白酶阻断剂苯甲基磺酰氟(pmsf)的10mmol/l tris-hcl缓冲液加入上述步骤制备得到的软骨粉末至全部浸没，在4
°
下90～100rpm/min震荡12h脱细胞；
50.(2)将脱细胞后的软骨粉末用去双蒸水漂洗3次后收集沉淀；
51.(3)上述沉淀加入含有50μ/ml dna酶和1μ/ml rna酶，37
°
下90～100rpm/min震荡，消化6h；
52.(4)用去双蒸水漂洗3次，收集沉淀，冻干24h，制得软骨脱细胞基质备用。
53.3、壳聚糖水凝胶配制：
54.称取壳聚糖溶于0.1mol/l醋酸溶液，配成质量体积浓度为1％的壳聚糖水凝胶。
55.4、复合支架的制作：
56.(1)将软骨脱细胞基质加入至双蒸水中，制得质量分数为10％的软骨脱细胞基质混悬液；
57.(2)准备好高2.0cm，直径为1.0cm的圆柱形支架模具；将10％的软骨脱细胞基质混悬液与1％的壳聚糖水凝胶按体积比为1:1，分别在模具内充分混合，-80℃条件下冷冻8～10h。
58.(3)冻干8h，制得圆柱状透明软骨脱细胞基质复合支架(e1c1组)。
59.实施例2透明软骨脱细胞基质复合支架的制备
60.本实施例制备的透明软骨脱细胞基质复合支架，在提取关节软骨组织、猪透明软骨粉末脱细胞处理、壳聚糖水凝胶配制的制备方法步骤均同实施1。在复合支架的制作中，采用的10％的软骨脱细胞基质混悬液与1％的壳聚糖水凝胶的体积比为5:1，分别在模具内充分混合，于-80℃条件下冷冻8～10h，再冻干8h，制得圆柱状透明软骨脱细胞基质复合支架(e5c1组)。
61.实施例3透明软骨脱细胞基质复合支架的制备
62.本实施例制备的透明软骨脱细胞基质复合支架，在提取关节软骨组织、猪透明软骨粉末脱细胞处理、壳聚糖水凝胶配制的制备方法步骤均同实施1中所示。在复合支架的制作中，采用的10％的软骨脱细胞基质混悬液与1％的壳聚糖水凝胶的体积比为10:1，分别在模具内充分混合，于-80℃条件下冷冻8～10h，再冻干8h，制得圆柱状透明软骨脱细胞基质复合支架(e10c1组)。
63.实施例4透明软骨脱细胞基质复合支架的制备
64.本实施例制备的透明软骨脱细胞基质复合支架，在提取关节软骨组织、猪透明软骨粉末脱细胞处理、壳聚糖水凝胶配制的制备方法步骤均同实施1。在复合支架的制作中，采用的10％的软骨脱细胞基质混悬液与1％的壳聚糖水凝胶的体积比为15:1，分别在模具内充分混合，于-80℃条件下冷冻8～10h，再冻干8h，制得圆柱状透明软骨脱细胞基质复合支架(e15c1组)。
65.上述实施例1～4中制备得到不同比例的透明软骨脱细胞基质复合支架，具体为不同的10％的软骨脱细胞基质混悬液与1％的壳聚糖水凝胶的体积比为1:1(e1c1组)、5:1(e5c1组)、10:1(e10c1组)、15:1(e15c1组)四个比例组，以只采用软骨脱细胞基质进行制备作为对照。在单独使用透明软骨脱细胞基质时支架的稳定性很差，在轻微外力的作用下或与水溶液接触，支架的结构就会被破坏。添加少量壳聚糖以后可以显著提高透明软骨脱细胞基质稳定性，使支架成型。而不同比例的壳聚糖会产生不同复合支架状态，如图1所示，采用透明软骨脱细胞基质与壳聚糖体积比为1:1时，支架结构较松散，成型度较差；在逐渐增加脱细胞基质含量后，随壳聚糖比例的减少，透明软骨脱细胞基质复合支架变得更致密、易成型，表面可见细小孔洞。
66.不同比例的透明软骨脱细胞基质复合支架的在干燥和浸泡后状态如图2所示，软骨脱细胞基质与壳聚糖比例从左至右分别为15:1、10:1、5:1，干燥状态时，三组支架均为白色不透明海绵状圆柱体，具有一定弹性；在浸泡液体后，15:1的支架出现部分塌陷，10:1、5:1的支架则不出现塌陷。
67.实施例5透明软骨脱细胞基质复合支架的性能表征
68.1、孔隙率测定
69.由于无水乙醇不容易引起支架的体积改变，本实施例采用无水乙醇液体法测定透明软骨脱细胞基质复合支架的孔隙率。采用电子天平称量干燥条件下支架的质量，记为m1。将支架完全浸入无水乙醇中30min后取出，悬起待无液体滴落，称量此时支架的质量，记为m2。分别采用实施例2～4制备得到的三组不同体积比的软骨脱细胞基质混悬液：壳聚糖水凝胶为5:1(e5c1组)、10:1(e10c1组)、15:1(e15c1组)进行测定，按照下列公式(1)计算支架的孔隙率，每组3个平行样本，测量后取平均值。
[0070][0071]
ρ为无水乙醇在20
°
时的密度(0.789g/cm3)，v为支架体积。
[0072]
孔隙率测定结果如下表1所示，在添加不同比例的壳聚糖所获得的复合支架孔隙率差异无统计学意义，但可明显改善支架的力学强度。
[0073]
表1不同比例的透明软骨脱细胞基质复合支架孔隙率
[0074][0075][0076]
注：f值代表单因素方差分析的统计值，p》0.05代表差异无统计学意义。
[0077]
2、吸水率
[0078]
采用电子天平称量干燥条件下支架的质量，记为m1。将支架完全浸入去离子水中30分钟后取出悬起，待无水滴落，称量此时支架的质量，记为m2。分别采用实施例2～4制备得到的三组不同体积比的软骨脱细胞基质混悬液：壳聚糖水凝胶为5:1(e5c1组)、10:1(e10c1组)、15:1(e15c1组)进行测定，按照下列公式(2)计算支架的吸水率，每组3个平行样本，测量后取平均值。
[0079][0080]
吸水率测定结果如下表2所示，不同胶原与壳聚糖比例的复合支架吸水率有明显差异，胶原添加越多，吸水率越小；其中，以体积比15:1的脱细胞软骨ⅱ型胶原/壳聚糖组(e15c1组)吸水率最低，为(707.97
±
72.28)％。
[0081]
表2不同比例的透明软骨脱细胞基质复合支架吸水率
[0082][0083]
注：a-e15c1组和e5c1组的吸水率有显著差异，t＝3.408，p《0.05；b-e10c1组和e5c1组的吸水率有显著差异，t＝3.167，p《0.05。
[0084]
3、压缩力学性能测试
[0085]
使用电子万能试验机测定复合支架在干、湿两种状态下的压缩力学性能。设置电子万能试验机的运行参数，压缩速率设置为0.5mm/min，当支架压缩至自身形变的70％或达到屈服强度时停止。测量支架在干燥状态下的直径和高度，记录压缩过程中支架的受力情况，每组6个平行样，取平均值。把支架完全浸在pbs中30分钟后取出，擦干表面液体，记录压缩过程中支架的受力情况，每组6个平行样，取平均值。分别采用实施例2～4制备得到的三组不同体积比的软骨脱细胞基质混悬液：壳聚糖水凝胶为5:1(e5c1组)、10:1(e10c1组)、15:1(e15c1组)进行测定，最后根据应力-应变图的斜率计算压缩模量。
[0086]
由压缩模量的检测结果可知，制得的三组支架均为直径为9mm，高为5mm的圆柱状，e15c1组在浸泡pbs缓冲液后外形塌陷，因此不再测定这组在湿润状态下的压缩模量。结果如下表3所示，在透明软骨脱细胞基质复合支架中，壳聚糖的含量比例会影响支架的力学性能。
[0087]
表3不同比例复合支架的抗压强度
[0088][0089]
注：a-干燥状态下e10c1组和e15c1组比较t＝2.297，p《0.05；
[0090]
b-干燥状态下e10c1组和e5c1组比较t＝3.014，p《0.05；
[0091]
c-湿润状态下e10c1组和e5c1组比较t＝8.137，p《0.01；
[0092]
d-e5c1组的干燥和湿润状态下的压缩模量比较t＝10.368，p《0.01。
[0093]
实施例6透明软骨脱细胞基质复合支架的细胞相容性
[0094]
1、扫描电镜
[0095]
综合上述透明软骨脱细胞基质复合支架的性能表征结果，采用实施例3制备得到的10:1体积比的透明软骨脱细胞基质复合支架(e10c1组)进行扫描，将透明软骨脱细胞基质复合支架切薄片，喷金后，固定于观察台行扫描电镜观察。
[0096]
结果如图3所示，电镜下观察到材料呈疏松多孔状态，材料表面光滑，没有残留的
细胞。综合上述性能结果可知，在采用软骨脱细胞基质混悬液：壳聚糖水凝胶的体积比为10:1时，制备得到的透明软骨脱细胞基质复合支架具有良好孔隙率和适宜吸水率、抗压强度。
[0097]
2、细胞生长曲线
[0098]
将复苏冻存的小鼠软骨瘤细胞株atdc5细胞，以含5％胎牛血清的f12/dmem于37℃，5％co2，饱和湿度条件下培养细胞并增殖传代；细胞增殖到90％融合的时候，以0.25％tn和0.1％edta消化细胞，以5000个/片的数量接种于直径5mm的复合支架薄片，培养7天，于1、3、5、7天4个时间点分别以cck8试剂盒，于450nm光波长下检测吸光度值，反映atdc5细胞在复合支架材料的增殖情况。采用实施例3制备得到的透明软骨脱细胞基质复合支架(e10c1组)。
[0099]
atdc5细胞在复合支架上的生长曲线如图4所示，采用透明软骨脱细胞基质复合支架e10c1组在接种atdc5细胞后，在最初1～5天为缓慢增殖状态，到第7天达到增殖高峰，说明材料具有良好的细胞相容性，但是多孔疏松的三维结构可能改变了细胞的增殖方式，延后了细胞的生长。
[0100]
3.细胞在透明软骨脱细胞基质复合支架上生长的扫描电镜
[0101]
将融合生长的atdc5细胞消化收集为2.5
×
105个/ml的细胞悬液，接种到实施例3制备得到的透明软骨脱细胞基质复合支架(e10c1组)上，并于37℃，5％co2饱和湿度条件下培养3天后，以2.5％戊二醛固定标本，乙醇梯度脱水后，送扫描电镜观察。
[0102]
结果如图5所示，细胞在支架材料上粘附生长，形态正常并相互堆叠融合，呈三维生长状态。说明该材料具有细胞相容性良好，为细胞提供接近天然三维环境的生长空间，有利于细胞的正常增殖分化。
[0103]
综上，本发明提供的透明软骨脱细胞基质复合支架的制备方法，其制备得到的软骨支架的仅适用于软骨修复，采用猪软骨来制备脱细胞软骨海绵基质，含有2型胶原，并保留了大量软骨基质本身的蛋白聚糖成分和生物活性因子，利用动物软骨制备脱细胞胶原基质，能够一定程度上模拟软骨的基本结构；采用壳聚糖作为原料，通过优化使用比例，使支架的力学条件更加稳固，同时具有良好的生物相容性和弹性。本发明不采用交联剂也可以很好的保存脱细胞基质里的活性生物因子，也能具有良好的细胞相容性，构成的支架有较好的孔隙率，利于细胞的三维生长和增殖分化，获得最适宜用于组织工程软骨的复合支架。
[0104]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。