一种苦豆碱在改善前列腺癌中的应用

1.本技术涉及医药技术领域，具体涉及一种苦豆碱在改善前列腺癌中的应用。


背景技术：

2.前列腺癌(prostate cancer，pca)是指发生在前列腺的上皮性恶性肿瘤，该类肿瘤为激素依赖型的肿瘤。前列腺癌在我国发病率表现出每年递增的趋势，且发病率增长速度也逐年上升。
3.目前亟需提供一种安全有效的治疗剂用于改善前列腺癌。


技术实现要素：

4.本技术提供一种苦豆碱在改善前列腺癌中的应用，能够提供一种安全有效的治疗剂用于改善前列腺癌，能够通过苦豆碱促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，以改善前列腺癌。
5.第一方面，本技术示出一种苦豆碱在改善前列腺癌中的应用，所述苦豆碱的结构式为：
[0006][0007]
在一些实施例中，所述苦豆碱通过促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，以改善前列腺癌。
[0008]
在一些实施例中，所述苦豆碱通过促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，进而抑制前列腺癌细胞pc3的生长，以改善前列腺癌。
[0009]
在一些实施例中，所述苦豆碱通过促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，进而抑制前列腺癌细胞lncap的生长，以改善前列腺癌。
[0010]
在一些实施例中，所述苦豆碱改善前列腺癌的应用浓度在25μmol/l至1600μmol/l之间。
[0011]
在一些实施例中，所述苦豆碱改善前列腺癌的应用浓度优选为：25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、800μmol/l、1600μmol/l的其中一种。
[0012]
第二方面，本技术还示出一种苦豆碱在制备改善前列腺癌的药物中的应用，所述药物包括唯一活性成分的苦豆碱以及药学上可接受的辅料；所述药物用于改善前列腺癌。
[0013]
以上示出的技术方案，能够提供一种安全有效的治疗剂用于改善前列腺癌，能够通过苦豆碱促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，以改善前列腺癌。
附图说明
[0014]
为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0015]
图1示出了cck8法检测不同浓度的苦豆碱对细胞活力的影响；
[0016]
图2示出了形态学和细胞集落形成试验观察苦豆碱对pc3和lncap细胞活力的影响；
[0017]
图3示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞周期的影响；
[0018]
图4示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞凋亡的影响；
[0019]
图5示出了western-blot检测苦豆碱对pc3和lncap细胞凋亡相关蛋白caspase3、bax、bcl-2表达的影响；
[0020]
图6示出了western-blot检测苦豆碱对lncap细胞凋亡相关蛋白caspase3、bax、bcl-2表达的影响；
[0021]
图7示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞自噬的影响；
[0022]
图8示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞自噬蛋白表达水平的影响；
[0023]
图9示出了western-blot检测苦豆碱对lncap细胞自噬相关蛋白lc3ⅱ、beclin 1、p62表达的影响。
具体实施方式
[0024]
为使本技术的目的、实施方式和优点更加清楚，下面将结合本技术示例性实施例中的附图，对本技术示例性实施方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的示例性实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0025]
基于本技术描述的示例性实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术所附权利要求保护的范围。此外，虽然本技术中公开内容按照示范性一个或几个实例来介绍，但应理解，可以就这些公开内容的各个方面也可以单独构成一个完整实施方式。需要说明的是，本技术中对于术语的简要说明，仅是为了方便理解接下来描述的实施方式，而不是意图限定本技术的实施方式。除非另有说明，这些术语应当按照其普通和通常的含义理解。
[0026]
下面对本技术中涉及的专业术语进行解释。
[0027]
本技术中所使用的术语“苦豆碱”，是苦参属植物来源的天然生物碱，具有多种药理活性，包括抗炎、抗过敏、抗病毒、抗微生物、抗损伤和抗肿瘤的作用。苦豆碱对多种人类癌症发挥抗肿瘤作用，包括多发性骨髓瘤、肠癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌以及骨肉瘤。
[0028]
本技术中所使用的术语“细胞自噬”，是一种自我降解的机制，可以分解细胞中不必要的或功能失调的成分，从而维持细胞的动态平衡，以应对细胞外界的刺激。
[0029]
本技术中所使用的术语“细胞凋亡”，是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。
[0030]
对苦豆碱抗肿瘤作用机制的研究表明，苦豆碱治疗后，人体肿瘤中的jak/stat3、ras-erk和pi3k/akt信号通路均有不同程度的调节。此外，已有的体内研究已经证明了苦豆碱作为治疗剂的安全性和有效性。目前关于苦豆碱通过调控自噬及凋亡抑制前列腺癌的机
制尚未见报道。因此，阐明苦豆碱抑制前列腺癌分子机制，将其发展为辅助治疗前列腺癌等疾病的药物具有极高的潜在价值与社会意义。
[0031]
为此，本技术示出的技术方案，提供了一种苦豆碱，用于改善前列腺癌，本技术示出了一种苦豆碱在改善前列腺癌中的应用，所述苦豆碱的结构式为：
[0032][0033]
在一些实施例中，所述苦豆碱通过促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，以改善前列腺癌。
[0034]
在一些实施例中，所述苦豆碱通过促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，进而抑制前列腺癌细胞pc3的生长，以改善前列腺癌。
[0035]
在一些实施例中，所述苦豆碱通过促进前列腺癌细胞凋亡以及促进细胞自噬，进而抑制前列腺癌细胞lncap的生长，以改善前列腺癌。
[0036]
在一些实施例中，所述苦豆碱改善前列腺癌的应用浓度在25μmol/l至1600μmol/l之间。
[0037]
在一些实施例中，所述苦豆碱改善前列腺癌的应用浓度优选为：25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l、200μmol/l、400μmol/l、800μmol/l、1600μmol/l的其中一种。
[0038]
本技术还示出一种苦豆碱在制备改善前列腺癌的药物中的应用，所述药物包括唯一活性成分的苦豆碱以及药学上可接受的辅料；所述药物用于改善前列腺癌。
[0039]
具体实现中，本技术示出了相关实验以证实上述实施例。
[0040]
首先，本技术通过对前列腺癌细胞进行细胞培养，并将苦豆碱对前列腺癌细胞进行干预。
[0041]
具体实验过程如下：
[0042]
本技术的实验材料包括：实验细胞。其中，实验所用的人前列腺癌细胞细胞株pc3，以及人前列腺癌细胞株lncap，购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
[0043]
本技术的实验材料还包括：实验仪器和实验设备。具体如下表1所示：
[0044]
表1：实验仪器和实验设备
[0045]
[0046][0047]
本技术的实验材料还包括：实验试剂。具体如下表2所示：
[0048]
表2：实验试剂
[0049]
[0050][0051]
本技术的实验用相关试剂配置包括：细胞培养基配置；所述细胞培养基配置方法为在细胞间无菌技术下制作的完全培养基，将配制完成后的培养基存放在100ml离心管，过火焰后封口膜封口，放在4℃冰箱中。
[0052]
其中，细胞培养基的配方如下表3所示：
[0053]
表3：
[0054][0055]
本技术的实验用相关试剂配置包括：50mmol/l苦豆碱贮存液配置；所述50mmol/l苦豆碱贮存液配置方法为称取116mg苦豆碱溶于2ml dmso后，加8ml超纯水形成浓度为50mm/l的苦豆碱母液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌后，于4℃避光保存。该配置过程为无菌操作。
[0056]
在本技术的实验过程中，包括以下步骤：
[0057]
步骤s101，前列腺癌细胞(lncap和pc3)的培养；
[0058]
步骤s101-1，前列腺癌细胞株(lncap和pc3)的接收与相关处理；
[0059]
当获取到购买的前列腺癌细胞细胞株时，确认细胞没有发生污染及细胞的生长状态正常后，对培养瓶瓶身进行全面消毒，然后放入培养箱中进行正常细胞培养。
[0060]
步骤s101-2，前列腺癌细胞的传代；
[0061]
从箱内取培养瓶，显微镜下进行观察；若满足传代条件则放到超净工作台上。移液器抽走原培养基弃于废液缸。吸取3ml d-hanks冲洗培养瓶4遍，吸取d-hanks液弃于废液缸。取1ml胰酶溶液于瓶中消化。盖紧瓶盖消毒后置于co2培养箱中并计时。消化3min后取出并置于镜下查验消化情况，当细胞变为椭圆形，相互之间分离则表明消化完成，抽3ml新液中和。使用移液管吸细胞悬液后再吹打几遍进行混悬，吹打完成后移入事先准备好的无菌
15ml容量尖底离心管中。将15ml容量尖底离心管放到离心机以1000r离心5min，然后移液器吸取上清弃至废液缸。移液器吸取完全培养基轻轻吹打均匀进行重悬，根据需要传代的细胞种类和密度吸取对应的培养基进行稀释。将稀释完成的悬液转移至培养瓶并使其中细胞以一致密度铺于瓶底，放回培养箱。
[0062]
步骤s102，前列腺癌细胞的计数；
[0063]
取出需做细胞计数组别的培养皿，无菌处理后置于操作台上，弃旧液，d-hanks漂4遍，加入1.5ml胰酶，消化结束后再加入3ml带有血清的培养基用以终结消化后转运入5ml ep管中。细胞计数仪进行计数。重复4遍，计算均值，此即为该悬液浓度。
[0064]
步骤s103，cck8检测细胞活性实验；
[0065]
在细胞生长对数期收取细胞，制备成细胞密度分散的细胞悬液，接种于96孔板，大约每孔接种2
×
103个细胞，向96孔板每孔加入细胞悬液100μl，每个实验组4个复孔，还应设置空白对照，同时为减少培养基的蒸发，还应在96孔板边缘的孔中加入pbs 100μl。把96孔板放入培养箱24h，然后去除原培养基，按要求向96孔板每组分别加入含有0、25、50、100、200、400、800、1600μmol/l浓度苦豆碱新细胞培养基，每孔加入100μl，将96孔板放入37℃的5％co2培养箱中培养24h，然后避光条件下在96孔板中每孔加入cck8溶液10μl，再放入培养箱培养2-3h，酶标仪测定吸光值，记录450nm处实验组各孔吸光值数据，然后进行细胞的增殖活力计算：细胞活力％＝(加药组细胞od值-空白组细胞od值/对照组细胞od值-空白组od值)
×
100％。
[0066]
步骤s104，集落形成实验；
[0067]
将pc3和lncap两种细胞系在具有三种不同浓度的苦豆碱(0，100，200μm)的六孔板中进行培养14天。然后用甲醇对细胞进行固定并用0.5％结晶紫染色。当细胞数超过50时，可对其进行菌落计数。
[0068]
步骤s105，细胞凋亡实验；
[0069]
步骤s105-1，细胞对数生长期时，胰酶消化后离心收取细胞，用移液管轻轻吹打分散为均匀的细胞悬液，于6孔板中按每孔5
×
105细胞数进行细胞接种；把接种好细胞的6孔板放置培养箱中稳定12-24h，按照要求向6孔板中加入培养基，每组分别加入2ml含苦豆碱浓度为0、50、100、200μmol/l的培养基，再将6孔板放入培养箱中继续培养24h；然后胰酶消化细胞后离心收集约106个细胞进行后续实验操作。
[0070]
步骤s105-2，用pbs对细胞洗涤2次，离心机转速调至5min，1000r离心，离心后用移液管吸除pbs洗涤液。
[0071]
步骤s105-3，在规格为15ml的离心管中，用pbs 500μl进行细胞重悬，尽可能使细胞分散为单个细胞的细胞悬液。
[0072]
步骤s105-4，在0.5ml pbs细胞悬液中滴加2ml无水乙醇，4℃冰箱过夜。
[0073]
步骤s105-5，离心机5min，2000r离心后用移液管吸出固定液，收集细胞。
[0074]
步骤s105-6，冷pbs洗涤细胞2次，离心机转速调至2000r，5min，离心后用移液管吸出pbs洗涤液。
[0075]
步骤s105-7，移液管吸取冷pbs 500μl，用pbs将细胞进行重悬，且每组加入20μl rnase a，然后37℃，恒温水浴30min。
[0076]
步骤s105-8，离心机条件5min，4℃，2000r，离心后去除上清，收集细胞，后每组加
入pi染液400μl对细胞进行重悬，轻轻混匀，放置4℃冰箱，避光孵育1h。
[0077]
步骤s105-9，用膜联蛋白v-fitc/pi对细胞进行染色，然后在流式细胞仪上进行检测并分析结果。
[0078]
步骤s106，细胞周期实验；
[0079]
细胞生长至对数生长期时，胰酶消化后离心收取细胞，用移液管轻轻吹打成分散为单个细胞的细胞悬液，充分混匀细胞悬液在6孔板中按每孔5
×
105细胞数进行细胞接种；把接种好细胞的6孔板放置培养箱中稳定12-24h，按照要求向6孔板中加入培养基，每组分别加入2ml含苦豆碱浓度为0、50、100、200μmol/l的培养基，再将6孔板放入37℃5％co2培养箱中继续培养24h；然后同细胞传代的方法步骤，胰酶消化细胞后离心收集细胞进行后续实验操作。离心完成后使用pbs进行重悬，并操作细胞计数设备来计数，调整细胞浓度至1000个/μl并转移1ml细胞悬液至2ml离心管中。调整完成后将离心管在4℃下2000r离心5min，弃上清，每管加入500μl 70％乙醇并轻轻吹打混匀，置于﹣20℃冰箱固定6h。到时间后以1000r离心3min，弃上清，pbs洗一遍后1000r离心3min弃上清，每管加入试剂盒中rnasea溶液和pi溶液以1：9体积比配制成的染色工作液500μl进行重悬，轻柔混合均等后用锡箔纸包裹室温保存60min。孵育完成后用相关设备分析细胞周期。
[0080]
步骤s107，western-blot实验；
[0081]
步骤s107-1，提取蛋白原液；
[0082]
在细胞长满培养瓶后即可收取细胞。细胞消化后加入新培养液以终止消化，移入离心管中后在4℃下以1050r离心600s。离心结束后弃上清加入1ml pbs进行重悬，完成后把上述液体运转至1.5ml ep管中，重新在4℃下3000rpm离心5min并重复2次。离心完成时弃pbs后冻存于﹣80℃冰箱。
[0083]
细胞蛋白裂解液配比如下表4：
[0084]
表4：
[0085][0086]
加入的细胞蛋白裂解液量根据细胞量多少进行调节。添加完裂解液后将离心管在混悬振荡器上剧烈震荡0.5min，再放置在冰面静置5min并再操作上步5次以裂解完全。再4℃下12000r离心6min，把上清移至无酶离心管中，放到﹣80℃冰箱待用。
[0087]
步骤s107-2，bca法蛋白定量；
[0088]
bca工作液量＝(样品数+8)
×
200μl。
[0089]
bca工作液配比如下表5：
[0090]
表5：
[0091][0092]
[0093]
bca工作液配制完成后混匀。
[0094]
在96孔板中按下表6添加对应试剂。
[0095]
表6：
[0096][0097]
各个样品孔加入18μl ddh2o，之后加入相对应的蛋白原液2μl。
[0098]
每个孔内加入0.2ml的bca工作液。
[0099]
将96孔板放置于37℃，0.5h。
[0100]
反应结束后将96孔板放进酶标仪内，使用562nm波长计量各孔的od值。
[0101]
依据od值做出蛋白标准曲线，并推算出相关方程计算出各自孔对应的蛋白浓度。
[0102]
根据蛋白浓度添加相对量的双蒸水使各样品蛋白浓度相同，各样品加入其中的5x上样缓冲液量为各自体积的五分之一。
[0103]
将上步中样品100℃煮9min使其变性，降温后保存于﹣20℃冰箱。
[0104]
步骤s107-3，配制sds-page胶
[0105]
将干净的玻璃板内侧面相对，边缘相互对齐后安装到配胶架上，10％浓度分离胶各项配比如下表7。
[0106]
表7：
[0107][0108]
分离胶配制完成后吹打均匀，将胶缓缓注入胶槽内，避免产生气泡。分离胶加注到合适位置后沿玻璃板一侧边缘缓缓加入去离子水使去离子水到达玻璃板边缘，依靠去离子水重力使分离胶胶线水平，上述操作完后等待分离胶凝固。然后丢弃去离子水。浓缩胶的配制如下表8：
[0109]
表8：
[0110][0111]
将混合好的浓缩胶沿玻璃板一侧近边缘处注入两玻璃板间隙，此时加注速度应较快以免浓缩胶发生凝结。加注满浓缩胶不要停留，以尽可能快的速度垂直向下插入事先准备好的梳子。配制完成后的胶静置半小时左右使其充分凝固。
[0112]
步骤s107-4，上样与电泳；
[0113]
取出定量好的实验样品，复温后再震荡混匀，将配制好的有sds-page胶的玻璃板插入到电泳槽中，两块玻璃板之间和电泳槽里面都要倒入一定体积的电泳液。轻柔拔出梳子，靠近边缘的两个泳道内加入4μl蛋白marker，中间泳道内加入40μg蛋白。盖上电泳槽盖板并连接电源，先以恒压80v方式进行电泳。待marker各线间分离明显则将电压设置为120v，当蛋白marker到达胶的底部时结束电泳。
[0114]
步骤s107-5，转膜与封闭；
[0115]
电泳结束后将sds-page胶放置于冷的转膜液中。参照marker和所需蛋白分子量裁下pvdf膜，浸没在甲醇里5min，然后转移到转膜液里。切胶板切下目的蛋白胶条。使用260ma恒流转膜1h。然后取出pvdf膜，把pvdf膜放置于事先配制好的含有10％脱脂奶粉封闭液中，封闭2小时。
[0116]
步骤s107-6，抗体孵育与曝光；
[0117]
pbst漂洗pvdf膜5遍，每遍10min。一抗稀释比例如下表9。
[0118]
表9：
[0119][0120]
将各pvdf膜置于一抗孵育10小时。pbst漂洗4遍，每遍10min。按照1:5000浓度将二抗加入2.5％脱脂奶粉溶液中，放于摇床上孵育2小时。孵育后使用pbst洗4遍，每遍10min。膜上滴加发光工作液后曝光。曝光后的条带使用image j软件分析。
[0121]
步骤s108，免疫荧光检测苦豆碱对pc3和lncap自噬指标lc3ⅱ表达影响；
[0122]
步骤s108-1，从培养箱中取出24孔板，观察细胞状态良好及密度均匀，可将24孔板中爬好细胞的玻片用pbs洗涤3次，每次洗涤3min。
[0123]
步骤s108-2，用甲醇或4％的多聚甲醛对爬片固定15min，用pbs对爬片洗涤3次每次3min。
[0124]
步骤s108-3，细胞用0.5％triton x-100(用pbs配制)进行20min细胞膜的通透，细胞膜表达的分子可省略此步骤。
[0125]
步骤s108-4，pbs洗涤玻片3次，每次3min，吸干玻片上残留的pbs，滴加正常山羊血清在玻片上，室温条件下封闭30min。
[0126]
步骤s108-5，吸水纸吸掉玻片上残留的封闭液，不用对玻片进行清洗，在玻片上滴加稀释好的一抗，放入湿盒，4℃过夜孵育。
[0127]
步骤s108-6，加荧光二抗：用pbst洗涤爬片3次，每次3min，吸干爬片残留的液体，然后避光，滴加稀释好的荧光二抗在玻片上，放在湿盒中20-37℃避光孵育1h，用pbst洗涤玻片3次，每次3min；注意：加入荧光二抗开始，往后所有操作步骤都需在避光环境中进行。
[0128]
步骤s108-7，复染核：在黑暗环境中滴加dapi，避光孵育5min，对细胞进行染核，pbst清洗5min
×
4次，把多余dapi洗掉。
[0129]
步骤s108-8，吸干爬片上残留的液体，抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察和采集图像。
[0130]
步骤s109，数据统计；
[0131]
采用spss 23.0统计学软件包进行统计分析，计量资料以均值
±
标准差表示，组间对比采用单因素方差分析或两独立样本t检验分析；计数资料以百分比表示，采用pearsonχ2检验分析。p＜0.05表示差异具有统计学意义。
[0132]
上述实施例中实验结果如下：
[0133]
图1示例性示出了cck8法检测不同浓度的苦豆碱对细胞活力的影响。如图1a所示，与control组比较，25、50μmol/l苦豆碱组pc3细胞活力无明显差异(p＞0.05)，100μmol/l苦豆碱组pc3细胞活力被抑制(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱组pc3细胞活力被显著抑制(p＜0.01)，且随着苦豆碱浓度增加，抑制越明显，其中1600μmol/l苦豆碱组pc3细胞几乎全部死亡，苦豆碱抑制pc3的ic50值为230μmol/l。
[0134]
进一步如图1a所示，与control组比较，25μmol/l苦豆碱组lncap细胞活力无显著差异(p＞0.05)，50μmol/l苦豆碱组lncap细胞活力被明显抑制(p＜0.05)，100μmol/l苦豆碱组lncap细胞活力被显著抑制(p＜0.01)，且随着苦豆碱浓度增加，抑制作用越强，当800μmol/l苦豆碱处理lncap细胞时，细胞活力约为0，苦豆碱抑制lncap的ic50值为140μmol/l。
[0135]
如图1b以及图1c所示，与control组比较，100、200μmol/l苦豆碱处理pc3和lncap24、48、72和96h后，苦豆碱以时间依赖性方式抑制pc3和lncap细胞活力，此外两种浓度的苦豆碱(100和200μmol/l)处理组的pc3和lncap细胞增殖率差异显着(p《0.05)。
[0136]
图2示例性示出了形态学和细胞集落形成试验观察苦豆碱对pc3和lncap细胞活力的影响。图2a示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞生长形态的影响，高倍镜(
×
200)下显示，与control组比较，100、200μmol/l苦豆碱处理的pc3，细胞形态发生明显变化，包括细胞收缩和细胞表面不规则。
[0137]
与pc3细胞相似，与control组比较，100、200μmol/l苦豆碱处理的lncap，细胞形态同样发生明显变化，包括细胞收缩和细胞表面不规则。
[0138]
图2b和图2c示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞集落形成的影响。如图2b所示，与
control组比较，100μmol/l苦豆碱处理的pc3细胞的集落形成有所减少(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理的pc3细胞的集落形成显著减少(p＜0.01)。
[0139]
进一步如图2b和图2c所示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱处理的lncap细胞的集落形成有所减少(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理的lncap细胞集落形成显著减少(p＜0.01)。
[0140]
图3示例性示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞周期的影响。如图3a所示，细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞增殖受细胞周期阻滞的影响。如图3b和图3c所示，与对照组相比，100μmol/l苦豆碱处理pc3细胞后g1期细胞比例增加(p《0.05)，lncap细胞g1期显著增加(p《0.01)，g2期降低，s期无明显差异；200μmol/l苦豆碱干预pc3和lncap细胞后g1期细胞比例显著增加(p《0.01)，g2期降低，s期无明显差异；即苦豆碱可阻滞g0/g1期pc3和lncap细胞向s期过渡。
[0141]
图4示例性示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞凋亡的影响。如图4a和图4b所示，采用流式细胞术测定细胞凋亡的方法为：与control组比较，100μmol/l苦豆碱组pc3细胞调亡率增加(p《0.05)，200μmol/l苦豆碱组pc3凋亡率明显增加(p《0.01)。如图4c和图4d所示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱组lncap细胞调亡率增加(p《0.05)，200μmol/l苦豆碱组lncap细胞早期调亡率明显增加(p《0.01)。
[0142]
图5示例性示出了western-blot检测苦豆碱对pc3和lncap细胞凋亡相关蛋白caspase3、bax、bcl-2表达的影响。如图5a和图5b所示，western-blot检测苦豆碱对pc3细胞凋亡相关蛋白caspase3、bax、bcl-2表达的影响为：与control组比较，100μmol/l苦豆碱干预48小时后，pc3细胞中bax和caspase3蛋白表达均增加(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理pc3细胞48小时后，细胞中bax和caspase3蛋白表达显著增加(p＜0.01)。与control组比较，100μmol/l苦豆碱处理pc3细胞48小时后，bcl-2蛋白表达明显减少(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理48小时后，pc3细胞中bcl-2蛋白表达显著减少(p＜0.01)。
[0143]
图6示例性示出了western-blot检测苦豆碱对lncap细胞凋亡相关蛋白caspase3、bax、bcl-2表达的影响。如图6a和图6b所示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱干预48小时后，lncap细胞中bax和caspase3蛋白表达均增加(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理lncap细胞48小时后，细胞中bax和caspase3蛋白表达显著增加(p＜0.01)。
[0144]
进一步如图6a和图6b所示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱处理lncap细胞48小时后，lncap细胞中bcl-2蛋白表达明显减少(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理48小时后，lncap细胞中bcl-2蛋白表达显著减少(p＜0.01)。
[0145]
图7示例性示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞自噬的影响。如图7a和图7b所示，绿色荧光，为lc3ⅱ的免疫阳性荧光；蓝色荧光，即细胞核的免疫荧光。根据免疫荧光染色技术的结果显示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱和200μmol/l苦豆碱组pc3和lncap细胞胞浆lc3ⅱ绿色荧光点状表达数量增多，荧光强度增加。
[0146]
图8示例性示出了苦豆碱对pc3和lncap细胞自噬蛋白表达水平的影响。图8a和图8b示出了western-blot检测苦豆碱对pc3细胞自噬相关蛋白lc3ⅱ、beclin 1、p62表达的影响。与control组比较，100μmol/l苦豆碱干预48小时后，pc3细胞中lc3ⅱ蛋白表达增加(p＜0.01)，200μmol/l苦豆碱处理pc3细胞48小时后，pc3细胞中lc3ⅱ蛋白表达显著增加(p＜0.001)。
[0147]
如图8a和图8c所示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱干预48小时后beclin 1表达稍有增加(p＜0.05)，p62表达稍降低(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理pc3细胞48小时后，beclin 1表达显著增加(p＜0.001)，p62表达显降低(p＜0.01)。
[0148]
图9示例性示出了western-blot检测苦豆碱对lncap细胞自噬相关蛋白lc3ⅱ、beclin 1、p62表达的影响。如图9a和图9b所示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱干预48小时后，lncap细胞中lc3ⅱ蛋白表达增加(p＜0.01)，200μmol/l苦豆碱处理lncap细胞48小时后，lncap细胞中lc3ⅱ蛋白表达显著增加(p＜0.001)。
[0149]
如图9a和图9c所示，与control组比较，100μmol/l苦豆碱干预lncap细胞48小时后beclin 1表达稍有增加(p＜0.05)，p62表达稍降低(p＜0.05)，200μmol/l苦豆碱处理lncap细胞48小时后，beclin 1表达显著增加(p＜0.001)，p62表达明显降低(p＜0.01)。
[0150]
综之，已有研究发现细胞凋亡及自噬与肿瘤的发生发展关系极为密切，我们利用苦豆碱干预前列腺癌细胞pc3及lncap发现苦豆碱能够通过调控自噬及凋亡抑制前列腺癌细胞生长。揭示了苦豆碱调节自噬及凋亡信号通路的关联性和作为潜在治疗前列腺癌药物的可能性。表明苦豆碱在辅助治疗前列腺癌方面具有重要的应用价值。
[0151]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。