一种超分子蓝铜肽微乳液及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及微乳液技术领域，尤其涉及一种超分子蓝铜肽微乳液及其制备方法与应用。


背景技术：

2.超分子微乳液是一种以超分子离子液体作为微乳液的其中一相，以此制备出的递送载体。超分子微乳液具有优良的稳定性，能够大大提升难溶性药物的溶解度，提高药物的经皮递送效率，是一种很有潜力的药物递送载体。
3.蓝铜肽是甘氨酰组氨酰赖氨酸三肽(glycyl histidine tripeptide，ghk)与铜结合的化合物，天然存在于人的血浆、尿液、唾液、脑脊液的小分子络合物。蓝铜肽能够将机体功能所需的铜离子以无毒的形式递送到细胞中被人体利用。目前的研究证明蓝铜肽的生物学功能包括促进胶原蛋白产生，增加血管生长和抗氧化，其中，抗氧化的主要机理是介于铜元素激发的超氧岐化酶(sod)活性。
4.但因蓝铜肽的高亲水性，很难被皮肤直接吸收；并且目前在对蓝铜肽的递送过程中，效率较低，且成本高。
5.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

6.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种超分子蓝铜肽微乳液及其制备方法与应用，旨在解决传统递送蓝铜肽的方法中，递送效率低、成本高且工艺复杂的问题。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，包括步骤：
9.将甜菜碱和有机酸加入到水中，得到超分子甜菜碱基离子溶液；
10.将蓝铜肽负载到所述超分子甜菜碱基离子溶液中，得到超分子蓝铜肽离子溶液；
11.将乳化剂和助乳化剂进行混合，得到混合乳化剂；
12.将所述混合乳化剂与油相和所述超分子蓝铜肽离子溶液进行混合，得到超分子蓝铜肽微乳液。
13.所述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，其中，所述步骤将甜菜碱和有机酸加入到水中，得到超分子甜菜碱基离子溶液具体包括：
14.在惰性气体氛围下，将甜菜碱与有机酸加入到水中，得到甜菜碱基离子溶液；
15.对所述甜菜碱基离子溶液进行水浴、真空干燥，得到超分子甜菜碱基离子溶液。
16.所述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，其中，所述有机酸包括苹果酸或柠檬酸中的一种或两种。
17.所述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，其中，所述乳化剂包括tween80；所述助乳化剂包括span20。
18.所述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，其中，所述油相包括肉豆蔻酸异丙酯。
19.所述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，其中，所述甜菜碱与所述有机酸的摩尔比为1:1～1:8。
20.所述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，其中，所述乳化剂与所述助乳化剂的摩尔比为1:1～3:1。
21.所述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，其中，所述混合乳化剂与所述油相的摩尔比为1:9～9:1。
22.一种超分子蓝铜肽微乳液，采用上述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法制备得到。
23.一种超分子蓝铜肽微乳液的应用，如上所述的超分子蓝铜肽微乳液用于作为化妆品的配方材料或用于作为药物递送载体材料。
24.有益效果：本发明提供一种超分子蓝铜肽微乳液及其制备方法与应用，所述超分子蓝铜肽微乳液的制备方法包括步骤：将甜菜碱和有机酸加入到水中，得到超分子甜菜碱基离子溶液；将蓝铜肽负载到所述超分子甜菜碱基离子溶液中，得到超分子蓝铜肽离子溶液；将乳化剂和助乳化剂进行混合，得到混合乳化剂；将所述混合乳化剂与油相和所述超分子蓝铜肽离子溶液进行混合，得到超分子蓝铜肽微乳液。该制备方法制备得到的超分子蓝铜肽微乳液具有较高的生物相容性和稳定性，对蓝铜肽具有较高的包封率，大大提高了蓝铜肽的递送效率；而且超分子微乳液技术能够稳定蓝铜肽的结构，同时保留了甜菜碱和有机酸的生物活性和功效，发挥协同作用，使蓝铜肽的生物学功效得到更好的应用和发挥，具有对难溶性药物增溶的显著效果。
附图说明
25.图1为本发明一种超分子蓝铜肽微乳液的制备方法的工艺流程图；
26.图2为本发明实施例1-2所制备的超分子蓝铜肽微乳液的核磁氢谱图；
27.图3为本发明所制备的超分子蓝铜肽微乳液的体外渗透量化图；
28.图4为本发明所制备的超分子蓝铜肽微乳液的清除活性氧的量化图。
具体实施方式
29.本发明提供一种超分子蓝铜肽微乳液及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
30.目前的研究证明，蓝铜肽的生物学功能包括促进胶原蛋白产生，增加血管的生长和抗氧化。其中，抗氧化的主要机理在于铜元素激发的超氧岐化酶活性。但是由于蓝铜肽的亲水性较高，很难被皮肤直接吸收；再加上传统的蓝铜肽递送方法中，效率低、成本高且工艺复杂，导致蓝铜肽很难得到有效的利用。因此，如何提升蓝铜肽的利用率是蓝铜肽应用中面临的主要问题，也是亟需解决的难点。
31.基于此，如图1所示，本发明提供一种超分子蓝铜肽微乳液的制备方法，包括步骤：
32.步骤s10：将甜菜碱和有机酸加入到水中，得到超分子甜菜碱基离子溶液；
33.步骤s20：将蓝铜肽负载到所述超分子甜菜碱基离子溶液中，得到超分子蓝铜肽离
72h，完全除去溶剂中的水。
46.在一些实施方式中，所述惰性气体包括但不限于氮气、氦气；以防止在制备超分子甜菜碱基离子溶液的过程中产生副产物，影响超分子蓝铜肽微乳液对蓝铜肽的递送效率。
47.在一种具体地实施方式中，所述步骤s20中，在惰性气体氛围下，将将0.01mg蓝铜肽缓慢滴入所述超分子甜菜碱基离子溶液中，在25℃下用磁力搅拌6h、透析2h、干燥10h，即可得到所述超分子蓝铜肽离子溶液。
48.在一些实施方式中，所述步骤s40中，将所述混合乳化剂与油相和所述超分子蓝铜肽离子溶液进行混合具体包括：将所述混合乳化剂与所述油相按比例混合，然后再将所述超分子蓝铜肽离子溶液逐滴加入其中，反应得到超分子蓝铜肽微乳液。该微乳液是由水相、油相、混合乳化剂在适当的比例下自发形成的透明或者半透明的小液滴，是一种纳米级粒径、各向同性、低粘度且热力学稳定的水包油混合体系。
49.可选地，先将混合乳化剂与油相混合，再逐滴加入到所述超分子蓝铜肽离子溶液中。具体地，将所述混合乳化剂与肉豆蔻酸异丙酯(油相)混合均匀，在旋涡震荡下逐滴加入甜菜碱基离子溶液或水溶液，观察记录体系在浑浊和澄清之间变化临界点时的各组分百分比，利用伪三元相图确定微乳区，得到超分子蓝铜肽微乳液。
50.在一些实施方式中，所述乳化剂包括tween80(吐温80)；所述助乳化剂包括span20(司班20)。
51.在一些实施方式中，所述油相包括肉豆蔻酸异丙酯。
52.在一些实施方式中，所述甜菜碱与所述有机酸的摩尔比为1:1～1:8；具体地，将所述甜菜碱与所述有机酸按照1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8中的其中一个摩尔比，在一定温度下混合与水溶液中，发生离子交换反应形成甜菜碱基离子溶液，然后在进行水浴、真空干燥，得到超分子甜菜碱基离子溶液。
53.在一种优选地实施方式中，所述甜菜碱与所述有机酸的摩尔比为1：(1-4)，使得制备得到的超分子甜菜碱基离子溶液纯度较高。
54.在一些实施方式中，所述乳化剂与所述助乳化剂的摩尔比为1:1～3:1。
55.可选地，所述步骤s30中，在室温下，按摩尔比为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1将tween80与span20混合，经充分搅拌后得到混合乳化剂。
56.在一些实施方式中，所述混合乳化剂与所述油相的摩尔比为1:9～9:1。作为举例地，所述混合乳化剂与所述油相按照摩尔比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9进行混合。
57.具体地，本发明所提供的超分子蓝铜肽微乳液是在室温下将tween80和span20按摩尔比1:1或1:2或2:1混合，磁力搅拌充分混匀得到混合乳化剂，再按照混合乳化剂和油相的摩尔比为9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9中的任一比例进行混合，在涡旋状态下滴加超分子蓝铜肽离子溶液，观察记录体系在浑浊和澄清之间变化临界点时的各组分百分比，利用伪三元相图确定微乳区。所述制备方法简单易于操作，可满足广泛研究的需求。
58.在一种具体地实施方式中，当所述有机酸为苹果酸时，按照摩尔比为1:1～1:8的比例称取甜菜碱和苹果酸，并在预定温度条件下混合于水溶液中，使所述苹果酸与甜菜碱发生离子交换反应，并通过水浴、真空干燥进行分离纯化，得到超分子甜菜碱基离子溶液；所述苹果酸是存在于多种植物中的有机酸，易被人体吸收，常被用于食品添加剂、化妆品和
保健品等领域，利用苹果酸与甜菜碱进行离子交换反应，使得制备得到的超分子甜菜碱基离子溶液同时具有甜菜碱和苹果酸两种成分的生物学活性。
59.在另一种具体地实施方式中，当所述有机酸为柠檬酸时，按照摩尔比为1:1～1:8的比例称取甜菜碱和柠檬酸，并在预定温度条件下混合于水溶液中，使所述柠檬酸与甜菜碱发生离子交换反应，并通过水浴、真空干燥进行分离纯化，得到超分子甜菜碱基离子溶液；所述柠檬酸是自然界常见的有机酸，常被作为食品添加剂使用，对人体安全无害；利用柠檬酸与甜菜碱进行离子交换反应合成的超分子甜菜碱基离子溶液，同时具有甜菜碱和柠檬酸两种成分的生物学活性。
60.本发明中，以天然的苹果酸和柠檬酸作为阴离子前驱体对甜菜碱进行离子化改性后，得到的超分子甜菜碱基离子溶液是一种纯天然的具有抗氧化作用的超分子溶剂；然后通过负载蓝铜肽，实现蓝铜肽的高效载药，得到具备协同抗氧化功效的超分子蓝铜肽离子溶液；再将tween80与span20混匀后得到混合乳化剂，混合乳化剂与油相按比例混匀，在旋涡震荡下逐滴加入超分子蓝铜肽离子溶液以替代水相，观察记录体系在浑浊和澄清间变化临界点时的各组分百分比，利用伪三元相图确定微乳区，得到超分子蓝铜肽微乳液。该制备方法制备的超分子蓝铜肽微乳液与蓝铜肽单体相比，超分子蓝铜肽微乳液大大提高了蓝铜肽的经皮递送效率；即不仅能够实现蓝铜肽的高效递送，大大增加蓝铜肽的经皮递送效率，而且能够保持蓝铜肽的结构，稳定蓝铜肽，保留了蓝铜肽的生物学功效，并能够发挥协同放大的抗氧化效果，在医用领域具有巨大的应用价值。
61.除此之外，本发明还提供一种超分子蓝铜肽微乳液，采用上述的超分子蓝铜肽微乳液的制备方法制备得到。
62.在所述超分子蓝铜肽微乳液的应用方面，所述超分子蓝铜肽微乳液用于作为化妆品的配方材料或用于作为药物递送载体材料。
63.下面进一步举例实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
64.实施例1
65.本实施例超分子苹果酸基蓝铜肽微乳液的制备方法，包括以下步骤：在氮气氛围下，将0.01mol甜菜碱溶于5ml水中，将0.02mol苹果酸溶于5ml水中，将苹果酸滴入甜菜碱水溶液中，加热反应至60℃，离子交换反应24小时；
66.反应结束后，真空蒸馏至反应液的1/5，过滤洗涤得到甜菜碱苹果酸离子溶液，在真空环境下干燥72小时即可得到超分子甜菜碱苹果酸离子溶液。
67.在室温下，将0.01mg蓝铜肽水溶液滴入所述超分子甜菜碱苹果酸离子溶液中，在25℃下磁力搅拌6h，透析2h，真空干燥24h，即可得到超分子苹果酸基蓝铜肽离子溶液。
68.在室温下，按照摩尔比为1:1、1:2、1:3、2:1、3:1的比例，将乳化剂tween80与助乳化剂span20混合。经磁力搅拌后得到混合乳化剂，再按照摩尔比9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9与肉豆蔻酸异丁酯(油相)分别混合，在搅拌状态下滴入所述超分子苹果酸基蓝铜肽离子溶液，观察记录体系在浑浊和澄清之间变化临界点时的各组分百分比，利用伪三元相图确定微乳区，得到超分子苹果酸基蓝铜肽微乳液。
69.如图2所示，本实施例制得超分子苹果酸基离子的核磁氢谱数据为：1h nmr
(400mhz,d2o)δ4.75(s,18h),4.08(t,2h),3.30(m,7h)，2.34-2.57(m,5h)。
70.实施例2
71.本实施例超分子柠檬酸基蓝铜肽微乳液的制备方法，包括以下步骤：
72.在氮气氛围下，将0.01mol甜菜碱溶于5ml水中，将0.02mol柠檬酸溶于5ml水中，将柠檬酸滴入甜菜碱水溶液中，加热反应至50℃，离子交换反应24小时；
73.反应结束后，真空蒸馏至反应液的1/5，过滤洗涤得到甜菜碱柠檬酸离子，在真空环境下干燥72小时即可得到超分子甜菜碱柠檬酸离子溶液。
74.在室温下，将0.01mg蓝铜肽水溶液滴入所述超分子甜菜碱柠檬酸离子溶液中，在25℃下磁力搅拌6h，透析2h，真空干燥24h，即可得到超分子柠檬酸基蓝铜肽离子溶液。
75.在室温下，按照摩尔比为1：1、1：2、1：3、2：1、3：1的比例，将乳化剂tween80与助乳化剂span20混合。经磁力搅拌后得到混合乳化剂，再按照摩尔比9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9与肉豆蔻酸异丁酯(油相)分别混合，在漩涡震动状态下滴入所述超分子蓝铜肽离子溶液，观察记录体系在浑浊和澄清之间变化临界点时的各组分百分比，利用伪三元相图确定微乳区，得到超分子柠檬酸基蓝铜肽微乳液。
76.对比例1
77.本对比例提供常规的蓝铜肽微乳液，制备方法如下：
78.在室温下，按照摩尔比为1：2的比例，将乳化剂tween80与助乳化剂span20混合。经磁力搅拌后得到混合乳化剂，再按照摩尔比9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9与肉豆蔻酸异丁酯(油相)分别混合，在涡旋震动状态下滴入蓝铜肽水溶液，观察记录体系在浑浊和澄清之间变化临界点时的各组分百分比，利用伪三元相图确定微乳区，得到蓝铜肽微乳液。
79.对比例2
80.本对比例提供纯净的蓝铜肽单体。
81.最后对实施例1-2和对比例1-2进行性能测试，具体结果如下：
82.安全性测试：
83.探究实施例1-2和对比例1-2制得的超分子蓝铜肽微乳液对nhf成纤维细胞的存活率的影响，具体方法如下：
84.利用碧云天生物科技有限公司的cck-8检测试剂盒检测超分子蓝铜肽微乳液对成纤维细胞的毒性作用。
85.结果如表1所示：
86.表1
87.组别细胞存活率(％)实施例198.3
±
1.2实施例299.1
±
1.7对比例197.9
±
1.5对比例298.3
±
1.1
88.由表1数据可知：与以纯水作为水相的微乳液或蓝铜肽单体相比，本发明所涉及的超分子蓝铜肽微乳具有很好的稳定性和很高的安全性。
89.体外渗透量测试
90.结果如图3所示，本发明制备的超分子蓝铜肽微乳液的累计渗透量随着时间的推移，累计渗透量越来越大，与蓝铜肽溶液的差距越来越大。
91.抗氧化性测试1：
92.对实施例1-2和对比例1-2制得的样品进行抗氧化性测试，具体方法为：利用流式细胞仪检测各组处理对活性氧的影响。以过氧化氢处理作为阳性对照组，检测测试样品浓度范围为0-8μg
·
ml-1
时活性氧的水平，统计结果如图4所示。
93.由图4结果可知：与以纯水作为水相的微乳液或蓝铜肽单体相比，本发明所涉及的超分子蓝铜肽微乳具有很好的抑制活性氧效果，说明超分子蓝铜肽微乳在抗氧化性上显示出协同放大的抗氧化活性。
94.综上所述，本发明提供的一种超分子蓝铜肽微乳液及其制备方法与应用，所述超分子蓝铜肽微乳液的制备方法包括步骤：将甜菜碱和有机酸加入到水中，得到超分子甜菜碱基离子溶液；将蓝铜肽负载到所述超分子甜菜碱基离子溶液中，得到超分子蓝铜肽离子溶液；将乳化剂和助乳化剂进行混合，得到混合乳化剂；将所述混合乳化剂与油相和所述超分子蓝铜肽离子溶液进行混合，得到超分子蓝铜肽微乳液。该制备方法制备得到的超分子蓝铜肽微乳液具有较高的生物安全性、生物相容性和稳定性，对蓝铜肽具有较高的包封率，大大提高了蓝铜肽的递送效率；而且超分子微乳液技术能够稳定蓝铜肽的结构，发挥协同作用，使蓝铜肽的生物学功效得到更好的应用和发挥；使蓝铜肽顺利突破皮肤屏障，达到皮肤深层发挥作用，并使蓝铜肽的体外渗透量提升三个数量级左右，实现蓝铜肽的有效经皮递送，避免了常规给药过程中首过消除导致利用率低的问题。同时保留了甜菜碱和有机酸的生物活性和功效，具有对难溶性药物增溶的显著效果。并且，该超分子蓝铜肽微乳液还具有缓释效果，能够缓慢持续递送蓝铜肽，实现绿色安全，对皮肤温和无刺激。此外，该超分子蓝铜肽微乳液在抗氧化、促进皮肤成纤维细胞增值、抗皱和抗衰老方面具有卓越的功效，在化妆品领域具有巨大的应用潜力。
95.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。