硫烷硫供体化合物在制备治疗肝癌的药物和克服肝癌化疗耐药性的化疗药物中的应用

1.本发明属于医药制品技术领域，具体涉及硫烷硫供体化合物在制备治疗肝癌的药物和克服肝癌化疗耐药性的化疗药物中的应用。


背景技术：

2.肝癌是威胁全球公众健康的重大疾病，其发病率和死亡率逐年上升，在各种肝癌中，肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,hcc)是肝癌的主要类型。除手术外，目前可用于hcc治疗的手段较为匮乏，即使使用价格昂贵的靶向治疗药物，由于hcc细胞的代谢重编程，肿瘤极易产生耐药，其中线粒体氧化-还原重编程是hcc对多种药物耐药的重要原因，克服该类耐药对hcc的治疗将产生极大的推动作用。
3.硫烷硫是含六个价电子，不带电荷的亲核试剂。上世纪50年代，研究已显示，硫烷硫化合物具有抗癌活性，熟知的大蒜素、莱菔硫烷是常见的天然硫烷硫供体。鉴于传统硫烷硫化合物的化学稳定性差、挥发性强、结构修饰局限，亟待开发化学稳定性好、挥发性弱的，同时具有抗肝细胞肝癌活性的硫烷硫供体。


技术实现要素：

4.为克服现有技术中的上述不足，本发明的目的之一在于提供硫烷硫供体化合物在制备肝细胞肝癌治疗药物中的应用。本发明提供的硫烷硫供体化合物为过硫化半胱氨酸前体化合物(persulfided cysteine precursor,pscp)，其通过释放活性硫烷硫分子，可发挥抗肝细胞肝癌的活性。
5.本发明的目的之二在于提供硫烷硫供体化合物在制备克服肝细胞肝癌化疗耐药性的化疗药物中的应用，通过抑制线粒体的抗氧化功能，可增强肝细胞肝癌化疗敏感性。
6.为了实现上述目的之一，本发明采用以下技术方案：
7.本发明提供硫烷硫供体化合物在制备治疗肝癌的药物中的应用，所述硫烷硫供体化合物具有体内外的抗肝细胞肝癌的活性，所述硫烷硫供体是过硫化半胱氨酸前体化合物，其化学结构式如下式所示：
[0008][0009]
进一步地，所述硫烷硫供体化合物能够抑制肝癌细胞的线粒体复合体i的功能。
[0010]
进一步地，所述硫烷硫供体化合物能够下调铁-硫簇生物合成蛋白编码基因的表达。
[0011]
进一步地，所述硫烷硫供体化合物作为肝细胞肝癌治疗的有效抗癌成分，通过添加药剂学可接受的辅料和载体后，用于制备治疗肝细胞肝癌的药物。
[0012]
进一步地，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂中的任何一种。
[0013]
与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：
[0014]
(1)通过对基因测序结果进行生物信息学分析(差异表达分析、功能富集分析、肝细胞肝癌患者生存分析)，本发明显示：所提供的硫烷硫供体(pscp) 可下调线粒体复合体1和铁-硫簇生物合成蛋白编码基因的表达；其中铁-硫簇相关基因uqcrfs1、isca1、glrx3和线粒体复合体1相关基因ndufs1、 ndufs3、ndufs5、ndufab1存在相互作用；上述部分基因高表达可降低肝细胞肝癌患者的生存率。这些结果说明：本发明提供的硫烷硫供体(pscp)通过抑制铁-硫簇生物合成基因的表达，使nadh脱氢酶亚基ndufs5结构中的铁-硫簇形成障碍，从而降低线粒体复合物i的功能。
[0015]
(2)本发明所提供的硫烷硫供体(pscp)可损害肝细胞肝癌线粒体功能，包括抑制nadh脱氢、降低线粒体膜电位、减少atp的生成、增加氧自由基(ros) 的含量，具有潜在的克服化疗耐药作用。
[0016]
(3)根据本发明所提供的硫烷硫供体(pscp)下调铁-硫簇生物合成基因表达和抑制线粒体复合体1功能的相关证据，表明pscp具有潜力制备治疗肝细胞肝癌的药物和克服肝细胞肝癌化疗耐药的药物，临床应用前景良好。
附图说明
[0017]
为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例和现有技术描述中使用的附图作简单介绍。显而易见地，下列描述中的附图仅是本技术的一些实施例，对于本领域技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
[0018]
图1是实施例1提供的硫烷硫供体(pscp)处理snu398肝癌细胞后全基因转录组测序的生物信息学分析结果。
[0019]
图2是实施例2提供的铁-硫簇基因集和线粒体复合体i(nadh脱氢酶) 基因集相互
作用示意图。
[0020]
图3是实施例3提供的铁-硫簇和线粒体复合体i(nadh脱氢酶)基因集中的核心基因对肝细胞肝癌患者生存率的影响。
[0021]
图4是实施例4提供的硫烷硫供体(pscp)抑制snu398肝癌细胞线粒体功能的结果：4a图示出了pscp抑制atp生物合成，4b图示出了pscp升高 nadh/nad
+
比值，4c图示出了pscp升高ros含量，4d图示出了pscp抑制线粒体复合体i(nadh脱氢酶)的活性，4e图和4f图示出了pscp损害线粒体膜电位。
[0022]
图5是实施例5提供的硫烷硫供体(pscp)抑制肝细胞肝癌生长的结果图： 5a图和5b图示出了pscp剂量依赖性地抑制肝癌移植瘤在裸鼠体内生长，5c 图示出了pscp剂量和时间依赖性地抑制snu398肝癌细胞的活力。
[0023]
图6是本发明提供的硫烷硫供体(pscp)的化学结构式。
具体实施方式
[0024]
为了使本技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清晰，以下将结合实施例对本技术的技术方案进行详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。
[0025]
实施例1
[0026]
本实施例提供硫烷硫供体(pscp)处理肝癌细胞后，基因表达分析。pscp，即过硫化半胱氨酸前体化合物，为本发明所用硫烷硫供体。pscp在肝癌细胞内产生硫烷硫的具体机制如下式所示。
[0027][0028]
1.分析方法
[0029]
选择snu398肝癌细胞(此类细胞具有多基因突变和多重耐药性)，并用 pscp处理此细胞48h。收集细胞，提取mrna进行全基因转录组测序。对测序数据进行基因集富集分析(gsea)，阈值设置如下：p值＜0.05，fdr＜0.25， |nes|＞1，结果如附图1所示。
[0030]
2.分析结果
[0031]
请参阅附图1，从图中可以看出，pscp处理可抑制snu398肝癌细胞线粒体功能和铁-硫簇相关基因集的表达。
[0032]
实施例2
[0033]
本实施例是为明确实施例1中线粒体功能的抑制和铁-硫簇相关基因表型的改变是否存在关联而进行的分析。将铁-硫簇和线粒体复合体i(nadh脱氢酶) 活性基因集中的基因进行蛋白-蛋白互作分析(ppi)，结果如附图2所示。
[0034]
请参阅附图2，从图中可以看出，左边的铁-硫簇生物合成基因集和右边的 nadh脱氢酶活性基因集存在明显的相互作用。在铁-硫簇基因集中相互作用度较高的基因为uqcrfs1、isca1、glrx3；在nadh脱氢酶活性基因集中为 ndufs1、ndufs3、ndufs5、ndufab1等
基因。
[0035]
实施例3
[0036]
本实施例为明确上述基因集中的核心基因对肝癌患者生存率的影响。下载 tcga_lihc的临床资料，观察铁-硫簇和nadh脱氢酶活性基因集中的核心基因表达水平对肝癌患者生存率的影响，结果如附图3所示。
[0037]
请参阅附图3，从图中可以看出，pscp处理可下调snu398肝癌细胞线粒体nadh脱氢酶亚基ndufs5基因和铁-硫簇生物合成基因uqcrfs1和 glrx3的表达(图3a-c)；进一步，ndufs5或uqcrfs1和glrx3基因的高表达可降低肝癌患者的生存率(图3d-f)。结合实施例2中uqcrfs1与 ndufs5之间存在相互作用关系，提示pscp通过抑制铁-硫簇生物合成蛋白编码基因uqcrfs1和glrx3的表达，致使nadh脱氢酶亚基ndufs5结构中的铁-硫簇形成障碍，从而抑制线粒体的功能。
[0038]
实施例4
[0039]
本实施例探究了硫烷硫供体(pscp)对snu398肝癌细胞内线粒体功能的影响，检测指标包括：atp含量、nadh/nad
+
比值、ros含量、线粒体复合物i活性、线粒体膜电位。具体实验方法如下。
[0040]
(1)细胞内atp的检测方法：
[0041]
将50μl20
×
反应缓冲液加入950μl去离子水中，制成1ml 1
×
反应缓冲液。将此缓冲液与d-荧光素酶混合，制成10mm d-荧光素酶原液，用前避光保存。将25mg dtt加至1.62ml去离子水，制成100mm dtt溶液。配制不同浓度的atp标准溶液。
[0042]
标准反应体系配制如下：将8.9ml去离子水、0.5ml反应液、0.1ml dtt 原液和0.5ml d-荧光素酶原液加入试管中，反复颠倒混匀，避免涡旋损坏荧光素酶，用前避光保存。
[0043]
将不同浓度的atp标准品或pscp处理snu398肝癌细胞后的细胞裂解液加至上述反应体系中，加样量不超过总体积的10％。根据标准曲线，计算各组细胞内atp的绝对含量，结果如附图4a所示。
[0044]
(2)检测细胞内nadh/nad
+
的比值：
[0045]
采用商品化的试剂盒，检测各组snu398肝癌细胞内nadh和nad
+
的含量，计算nadh/nad
+
比值，结果如附图4b所示。
[0046]
(3)检测细胞内ros的含量：
[0047]
使用ros荧光探针2',7'-二氯二氢荧光素(dcfh)-da对pscp处理后 snu398肝癌细胞内ros进行定量检测。样品经488nm激光激发后，用荧光酶标仪测定525nm波长处的发射信号，结果如附图4c所示。
[0048]
(5)线粒体膜电位的检测：
[0049]
pscp处理后的snu398肝癌细胞经线粒体染料jc-1和细胞核染料dapi 双染后，应用共聚焦显微成像技术观察线粒体膜电位。荧光强度用imagej软件进行定量分析，计算红/绿荧光强度的比值。结果如附图4e所示。
[0050]
(6)线粒体复合物i活性的检测：
[0051]
snu398肝癌细胞经pscp处理后，收集线粒体，并根据蛋白浓度进行标准化。往上述线粒体沉淀物中加入200μl试剂ⅱ和2μl试剂ⅲ，在4℃进行低温超声破碎。所得线粒体基质
样品，用酶标仪检测340nm波长nadh的氧化速率，计算线粒体复合物i的活性，结果如附图4d所示。
[0052]
实施例的实验结果如下：
[0053]
在100～400μm浓度范围内，硫烷硫供体(pscp)处理snu398细胞24h 后，细胞内atp的生物合成被明显抑制(图4a)，而nadh/nad
+
的比值(图 4b)以及胞内ros的含量明显升高(图4c)，进一步地，线粒体复合体i的活性被pscp显著抑制(图4d)。结合图4a、图4b和图4d的结果，表明pscp 可通过抑制线粒体复合体i的功能，致使nadh无法脱氢及后续电子传递，无法向线粒体外膜转运h
+
建立势能梯度以驱动atp合成酶，导致atp含量降低。最后，通过共聚焦显微成像技术也进一步证实了pscp处理可引起线粒体膜电位的损失(图4e和图f)，结合图4c的结果，表明pscp处理可以降低线粒体的抗氧化功能，将有助于克服肝癌患者的化疗耐药。
[0054]
实施例5
[0055]
本实施例观察了硫烷硫供体(pscp)对肝细胞肝癌生长的影响。在balb/c 裸鼠移植瘤(cell-derived xenograft,cdx)模型，皮下接种肝癌h22细胞，接种量为6
×
106/只。自第三天开始，腹腔注射不同剂量的pscp，每日一次，连续2 周。实验完成后，腹腔注射10％水合氯醛，过量麻醉处死动物，取皮下肿瘤组织进行拍照。结果表明：pscp处理可剂量依赖性地抑制移植瘤的生长(图5a 和图5b)；另外，在细胞模型，用50～400μm pscp处理snu398肝癌细胞24～72 h，处理完成后用cck-8法检测细胞存活率。结果表明：pscp处理可剂量和时间依赖性地抑制snu398肝癌细胞的存活率(图5c)。统计结果以mean
±
sd 表示(n＝4)，
*
p《0.05，
**
p《0.01vs control。
[0056]
上述实施方案仅为本发明的优选实施方案，不能以此来限定本发明的保护范围。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化和替换均属于本发明所要求保护的范围。