西印度樱桃果实萃取物用于减缓皮肤失去弹性的用途1.本技术是中国国家申请号为201911413101.0、申请日为2019年12月31日、发明名称为“西印度樱桃幼果的萃取物用于调控体重、美肌、抗发炎及抗老化的用途”的发明专利申请的分案申请。
技术领域：
：2.本发明涉及植物提取物领域，尤其是有关于一种西印度樱桃幼果的萃取物用于提升皮肤的胶原蛋白含量、提升皮肤的弹力蛋白及减缓皮肤失去弹性的用途。
背景技术：
：：3.皮肤组织是由表皮、真皮及皮下组织所构成，其中真皮含有大量胶原蛋白及玻尿酸，而与皮肤的保水性及弹力息息相关。人类皮肤会随着年纪、生理因素或环境因素，而有老化、肤质粗糙或产生皱纹等现象，如正常年轻人的皮肤都具一定的弹性和张力，当表情肌松弛后，皮肤会很快复原，使皱纹消失；但进入中年后，皮肤开始明显老化，皮肤变薄、变硬、干燥、张力降低；真皮胶原蛋白减少、弹力纤维变性、断裂，使皮肤的张力和弹性降低，因此，当表情肌松弛后，皮肤不能很快复原，久之则使皱纹成形；且随年龄的增大，皮肤和皮下组织更加松弛，加上面部支持组织的萎缩或缺失，以及肌肉的松软，皮肤会在重力的作用下发生滑坠，形成更深的皱纹。而肌肤粗糙是由于干燥、紫外线、清洁剂或化学物质等刺激性物质等外在重要因素，或激素平衡的紊乱等内在重要因素而产生的肌肤困扰，并伴随角质层屏障功能的下降、角质层水分量的下降、表皮代谢回转的亢进、鳞屑的产生而角质粗糙化等现象。因此皮肤上的细胞若失去弹性及保湿功能，会引起皮肤褶皱、干燥及失去光泽等现象。4.另一方面。皮肤是保护人类个体的最大屏障，它具有对抗水分散失、病原菌以及各种环境损害的功能。暴露于大量的紫外线(ultraviolet,uv)、游离辐射(ionizingradiation)、药物或异生物质(xenobiotics)会促使皮肤生成活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ros)以及自由基(freeradicals)。当所累积的活性氧分子以及自由基的数量超过细胞或组织本身的抗氧化能力时，便会形成氧化性压力(oxidativestress)。接着，活性氧分子以及自由基会与细胞内的组合物(包括dna、蛋白质以及脂质等)相反应，进而对皮肤产生非所欲的影响。5.黑色素生成(melanogenesis)(亦即黑色素合成(melaninsynthesis))是指当皮肤黑色素细胞(dermalmelanocyte)在受到环境因素(诸如紫外线(ultraviolet,uv))或生理因素(诸如疲劳(fatigue)、压力(stress)、慢性发炎(chronicinflammation)以及体内不正常的α-促黑素细胞素(α-melanocytestimulatinghormone,α-msh)的释放)的诱发之后，在黑色素细胞内的酪胺酸(tyrosine)经由酪胺酸酶(tyrosinase)的催化(它是黑色素生成的速率-限制步骤(rate-limitingstep))以及一系列的氧化还原反应而被转化为黑色素(melanin)的过程。黑色素可以保护皮肤的下皮层(hypodermis)免于紫外线所造成的光损害(photodamage)，但是当黑色素被大量地累积于皮肤上或不正常地分布时可能会导致皮肤疾病(skindisorders)，诸如雀斑(lentigines)、斑点(freckle)、黑皮病(melasma)、老人斑(agespots)以及色素过多(hyperpigmentation)等。6.为了达到皮肤美白(skinwhitening)及美肌的目的，目前已有许多黑色素生成抑制剂(melanogenesisinhibitors)被使用来淡化或去除累积于皮肤上的黑色素或是黑斑，而这些黑色素生成抑制剂大多是经由下列的作用机制来调控黑色素的生成：(1)在黑色素生成之前：例如抑制酪胺酸酶的mrna转录(mrnatranscription)(诸如c2-神经酰胺(c2-ceramide)、维生素a酸(tretinoin)以及香草酸(vanillicacid))与醣化(glycosylation)(诸如泛硫醇磺酸钙(calciumd-pantetheine-s-sulfonate,passo3ca))；(2)在黑色素生成的期间：例如抑制酪胺酸酶的活性(诸如对苯二酚(hydroquinone)、熊果苷(arbutin)以及曲酸(kojicacid))、加速酪胺酸酶的降解(degradation)(诸如亚麻油酸(linoleicacid)以及苯硫脲(phenylthiourea))，以及促进多巴醌(dopaquinone)的还原(reduction)(诸如抗坏血酸(ascorbicacid))；以及(3)在黑色素生成之后：例如促进黑色素分解(诸如亚麻油酸(linoleicacid))、抑制黑色素体运输(melanosometransfer)(诸如烟碱酰胺(niacinamide)以及丝胺酸蛋白酶抑制剂(serineproteaseinhibitor))，以及加速皮肤更新(turnover)(诸如甘草甙(liquiritin)以及乙醇酸(glycolicacid))。7.脂肪为人体内的必要成分，但过度的脂肪成分对人体会造成损害。肥胖会导致慢性发炎，促使体内的发炎反应，诱发脂肪细胞转变为胰岛素抗性细胞，进而导致高血糖、高胆固醇、高血压、及脂肪代谢异常。因此肥胖是目前亟需解决的问题。8.除此之外，醣化反应(glycation)与皮肤与体内老化相关，更与危害国人健康甚巨的糖尿病有关。醣化反应的本质就是梅纳反应(maillardreaction)或称为羰胺褐变反应(carbonyl-aminebrowning)，这是糖的醛(酮)基与含胺基物质(例如蛋白质、胜肽、胺基酸、磷脂、核酸或上述的衍生物)的胺基之间的一种非酵素性醣化(nonenzymaticglycosylation；glycation)反应。长期处于高血糖症状下，会引起葡萄糖自动氧化与蛋白质糖化作用，形成高度醣化终产物(advancedglycationendproducts,ages)。而ages更可引起多种老化疾病，例如皮肤皱纹、白内障、粥状动脉硬化、肾脏衰竭等。9.当人类食用的碳水化合物为淀粉时，不论是直链或是支链的淀粉都可被唾腺和胰脏中的α-淀粉酶快速地分解。淀粉酶是一种分解酶，其水解双链葡萄糖中连结的α-1,4-糖苷键的酶，根据作用的方式可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。α-淀粉酶为水解大量的α链与α链连接的多醣(诸如淀粉、肝醣)而产生葡萄糖及麦芽糖的酵素；α-淀粉酶在人体或是其他哺乳动物中发现的型式为淀粉酶(唾液、胰脏等)，亦会出现在含有淀粉的种子作为一种食物的储存，以及许多微生物会分泌α-淀粉酶。10.由于α-淀粉酶可将淀粉转化成醣类，进而造成血糖浓度上升，因此本领域的研究人员已开始将α-淀粉酶抑制剂应用于糖尿病及代谢症候群的治疗。11.瘦体素(leptin)为人体调节体重的重要因子，可抑制食欲及脂肪增生，并增加基础代谢率，将体脂肪控制于适当范围中。许多长期肥胖者皆有瘦体素分泌不足的问题，难以减重且容易复胖。12.然而，目前用来解决上述问题(包括调控体重、美肌、抗发炎及抗老化)的医药品、食品产品或保养品大多由化学成分所制成，长期使用不但对人体健康有害无益，且这些产品往往价格昂贵，并非为一般使用者所能负担。为了解决上述问题，本领域的技术人员亟需研发出具有调控体重、美肌、抗发炎及抗老化的功效的新颖医药品、食品产品或保养品以造福有此需求的广大族群。技术实现要素：13.有鉴于此，本发明的目的为提供一种西印度樱桃(malpighiaglabra)幼果的萃取物用于制备一调控体重、美肌、抗发炎及抗老化的组合物的用途，其中该西印度樱桃幼果的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为一萃取溶剂对该西印度樱桃幼果进行萃取而制得。14.在本发明的一实施例中，该西印度樱桃幼果与该萃取溶剂的体积比例介于1～5：5～20。15.在本发明的一实施例中，该西印度樱桃幼果的萃取物的有效浓度至少为0.0625mg/ml。16.在本发明的一实施例中，该调控体重包括抑制α-淀粉酶(α-amylase)活性、抑制脂肪酶(lipase)活性及提升瘦体素(leptin)含量。17.在本发明的一实施例中，该美肌包括抑制皮肤黑色素生成、提升皮肤的胶原蛋白含量及提升皮肤的弹力蛋白含量。18.在本发明的一实施例中，本发明的目的为提供一种西印度樱桃(malpighiaglabra)幼果的萃取物用于制备提升皮肤的胶原蛋白含量的组合物的用途，其中所述西印度樱桃果实的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂于75℃至95℃下对所述西印度樱桃果实进行萃取而制得，其中所述西印度樱桃果实是指开花后第25～35天的西印度樱桃的果实，且所述萃取溶剂与所述西印度樱桃果实的体积比介于5～20：1～5。19.在本发明的一实施例中，本发明的目的为提供一种西印度樱桃(malpighiaglabra)幼果的萃取物用于制备提升皮肤的弹力蛋白含量的组合物的用途，其中所述西印度樱桃果实的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂于75℃至95℃下对所述西印度樱桃果实进行萃取而制得，其中所述西印度樱桃果实是指开花后第25～35天的西印度樱桃的果实，且所述萃取溶剂与所述西印度樱桃果实的体积比介于5～20：1～5。20.在本发明的一实施例中，该皮肤黑色素生成为蓝光损伤所诱发的皮肤黑色素生成。21.在本发明的一实施例中，该抗发炎为抑制脂肪细胞导致的慢性发炎。22.在本发明的一实施例中，该抗老化为降低活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ros)表现量。23.在本发明的一实施例中，本发明的目的为提供一种西印度樱桃(malpighiaglabra)幼果的萃取物用于制备减缓皮肤失去弹性的组合物的用途，其中所述西印度樱桃果实的萃取物是以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂于75℃至95℃下对所述西印度樱桃果实进行萃取而制得，其中所述西印度樱桃果实是指开花后第25～35天的西印度樱桃的果实，且所述萃取溶剂与所述西印度樱桃果实的体积比介于5～20：1～5。24.在本发明的一实施例中，该西印度樱桃幼果为西印度樱桃开花后25～35天的果实。25.在本发明的一实施例中，该组合物是一医药品、一食品产品或一保养品。26.综上所述，本发明西印度樱桃幼果的萃取物的功效在于：可藉由抑制α-淀粉酶(α-amylase)活性、抑制脂肪酶(lipase)活性、提升瘦体素(leptin)含量、抑制蓝光损伤所诱发的皮肤黑色素生成、提升皮肤的胶原蛋白含量、提升皮肤的弹力蛋白含量、抑制脂肪细胞导致的慢性发炎、及降低活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ros)表现量，达到调控体重、美肌、抗发炎及抗老化的功效。另一方面，西印度樱桃幼果的萃取物可有效预防三高，适合开发作为美肌与体重管理的产品。27.以下将进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求所界定者为准。附图说明28.图1是本发明西印度樱桃幼果的萃取物的原花青素含量检测的数据图；29.图2是本发明西印度樱桃幼果的萃取物的黄酮含量检测的数据图；30.图3是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在抑制α-淀粉酶活性上的功效的数据图；31.图4是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在抑制脂肪酶活性上的功效的数据图；32.图5是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在提升瘦体素含量上的功效的数据图；33.图6是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在降低ages诱发的ros表现量上的功效的数据图，其中***表示p《0.001；34.图7是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在抑制蓝光损伤所诱发的皮肤黑色素生成上的功效的数据图，其中***表示p《0.001；35.图8是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在提升皮肤的胶原蛋白含量上的效用的数据图，其中**表示p《0.01；36.图9是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在提升皮肤的弹力蛋白含量上的效用的数据图，其中*表示p《0.05；37.图10是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在抑制脂肪细胞导致的慢性发炎上的功效的数据图，其中*表示p《0.05；**表示p《0.01。具体实施方式38.定义39.本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。40.使用excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(sd)表示，个此之间的差异以史徒登氏t-检定(student'st-test)分析。41.依据本发明，西印度樱桃(malpighiaglabra)是一种金虎尾科(malpighiaceae)金虎尾属(malpighia)小乔木，原产热带，果实可食用。又称亮叶金虎尾。西印度樱桃原产于南美、墨西哥南部、波多黎各、多米尼加、海地、巴西、中美等地，但现在也开始在得克萨斯和亚洲的热带地区种植。西印度樱桃以含有丰富的维生素c而著称，可透过种子、扦插等方式繁殖。生长环境喜干燥的沙质土壤和充分日照。42.如本文中所使用的，用语“西印度樱桃幼果(malpighiaglabrafruitlet)”意指西印度樱桃开花后25～35天的果实。43.依据本发明，西印度樱桃幼果的萃取物可以使用新鲜的西印度樱桃幼果而被制备，或者可使用预先经过一选自于由下列所构成的群组中的加工处理的西印度樱桃幼果而被制备：干燥处理、研磨处理、切碎处理，及其组合。44.如本文中所使用的，用语“抗老化(anti-aging)”意指预防、减缓人类皮肤外观的老化现象，例如：皱纹的产生及失去弹性等。评量实现此目的的程度将根据熟悉此项技艺者已知的诸多因素来决定，诸如消费者的全身状态、年龄、性别等。45.如本文中所使用的，用语“抑制黑色素生成(inhibitionofmelanogenesis)”与“抑制黑色素合成(inhibitionofmelaninsynthesis)”、“去色素(depigmenting)”、“淡化黑色素(lighteningthemelanin)”、“美白(whitening)”、“肤色淡化(skincolorlightening)”、“漂白(bleaching)”、“净白”、“增白(brightening)”、“退黑”以及“驱黑”可被交换地使用。46.依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)、口服地(orally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterileaqueoussolution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterilepowder)、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pill)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersiblepowder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)、外部制剂(externalpreparation)以及类似的物。[0047]依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceuticallyacceptablecarrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspendingagent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegratingagent)、分散剂(dispersingagent)、黏结剂(bindingagent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelatingagent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wettingagent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelayingagent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。[0048]依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebufferedsaline,pbs)、含有醇的水性溶液(aqueoussolutioncontainingalcohol)以及它们的组合。[0049]依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteralroutes)来投药：腹膜内注射(intraperitonealinjection)、皮下注射(subcutaneousinjection)、表皮内注射(intraepidermalinjection)、皮内注射(intradermalinjection)、肌肉内注射(intramuscularinjection)、静脉内注射(intravenousinjection)以及病灶内注射(intralesionalinjection)。[0050]依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(externalpreparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。[0051]依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。[0052]依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(whitepetrolatum)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preservingagents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorptionenhancers)、安定剂(stabilizingagents)、胶凝剂(gellingagents)[诸如974p(974p)、微结晶纤维素(microcrystallinecellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(activeagents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odorabsorbers)、香料(fragrances)、ph调整剂(phadjustingagents)、螯合剂(chelatingagents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusiveagents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizingagents)、渗透增强剂(penetrationenhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。[0053]依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptableadjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screeningagent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloringagent)、增稠剂(thickeningagent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。[0054]依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueoussolution)、水-醇溶液(aqueous-alcoholsolution)或油性溶液(oilysolution)、呈水包油型(oil-in-watertype)、油包水型(water-in-oiltype)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonicwater)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeupremoverproducts)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(bodycleansingproducts)等。[0055]依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂(externaluseagents)一起合并使用：美白剂(whiteningagents)[诸如维生素a酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素c]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatoryagents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultravioletabsorbers)、植物萃取物(plantextracts)[诸如芦荟萃取物(aloeextract)]、皮肤营养剂(skinnutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acneagents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitisagents)、抗过角化剂(antihyperkeratolyticagents)、抗干皮肤剂(anti-dryskinagents)、抗汗剂(antipsoriaticagents)、抗老化剂(antiagingagents)、抗皱剂(antiwrinkleagents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheicagents)、伤口治疗剂(wound-healingagents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。[0056]依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(foodadditive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。[0057]依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermentedfoods)、烘培产品(bakeryproducts)、健康食品(healthfoods)以及膳食补充品(dietarysupplements)。[0058]实施例1.西印度樱桃(malpighiaglabra)幼果的萃取物的制备[0059]首先，将开花后第25～35天的西印度樱桃(malpighiaglabra)(来自于巴西(brazil))的果实(即西印度樱桃幼果)切成12mm的大小，然后进行均质，接而以水、醇类、含水醇类或其组合作为萃取溶剂对均质后的西印度樱桃幼果进行萃取，其中萃取的温度介于75℃至95℃，萃取溶剂与西印度樱桃幼果的体积比介于5～20：1～5。接着，将所得到的产物进行离心，取离心后的上清液得到一滤液，然后于50～60℃下对滤液进行减压浓缩而得到一浓缩产物。之后，对浓缩产物进行喷雾干燥，得到本发明西印度樱桃幼果的萃取物。[0060]实施例2.西印度樱桃幼果的萃取物的原花青素及黄酮含量检测[0061]原花青素(proanthocyanidin,opc)含量检测的分析方法主要是参考colorimetryoftotalphenolicswithphosphomolybdic-phosphotungsticacidreagents,v.l.singleton,josepha.rossiamjenolvitic.,january1965,16:144-158所述方法并加以修饰。将适当稀释后的样品取0.1ml，加入0.6ml的4％香草醛甲醇溶液，再加入0.3ml浓hcl，混合均匀且于室温下避光反应15分钟后，以elisa读取仪(elisareader)测定500nm吸光值。对照组以等量去离子水代替，另以儿茶素(catechin)配制100、200、300、400、500、600、700及800μg/ml的甲醇溶液，进行同步试验并绘制标准曲线，作为定量参考依据。在本实施例中，本发明西印度樱桃幼果的萃取物被使用作为实验组，而西印度樱桃成熟果实的萃取物被使用作为比较组，其中西印度樱桃成熟果实的萃取物的制备方法大致上是相同于本发明西印度樱桃幼果的萃取物，不同之处在于：以西印度樱桃成熟果实取代西印度樱桃幼果。本实施例的结果显示于图1。[0062]图1是本发明西印度樱桃幼果的萃取物的原花青素含量检测的数据图。由图1可见，与比较组相较之下，实验组的原花青素含量有显著的提升，其中与比较组相较之下，实验组的原花青素含量提升13.3倍。本实验结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物会大量释出原花青素。[0063]另外，黄酮含量检测的分析方法主要是参考zhishenjiaetal.,(1999),foodchemistry,64:555-559所述方法并加以修饰，取200μl的适当稀释后的样品加入1000μl的h2o，混合均匀后，加入200μl的5％柠檬酸钠(sodiumnitrite)，静置6分钟后加入200μl的10％硝酸铝(aluminumnitrate)，再静置6分钟。最后加入2ml的4％氢氧化钠(sodiumhydroxide)与1.4ml的h2o，混合均匀，于500nm下进行分析，以芸香素(rutin)为标准品绘制标准曲线。在本实施例中，本发明西印度樱桃幼果的萃取物被使用作为实验组，而西印度樱桃成熟果实的萃取物被使用作为比较组，其中西印度樱桃成熟果实的萃取物的制备方法大致上是相同于本发明西印度樱桃幼果的萃取物，不同之处在于：以西印度樱桃成熟果实取代西印度樱桃幼果。本实施例的结果显示于图2。[0064]图2是本发明西印度樱桃幼果的萃取物的黄酮含量检测的数据图。由图2可见，与比较组相较之下，实验组的黄酮含量有显著的提升，其中与比较组相较之下，实验组的黄酮含量提升2.34倍。本实验结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物会大量释出黄酮。由于西印度樱桃幼果的萃取物的原花青素及黄酮含量最高，因此以西印度樱桃幼果的萃取物拿来进行后续实验。[0065]实施例3.西印度樱桃幼果的萃取物在抑制α-淀粉酶活性上的效用评估[0066]本实验方法主要是参考e.apostolidisetal.,(2007),innovativefoodscience&emergingtechnologies,8:46-54方法来进行。首先，准备下列实验材料：0.02m磷酸钠缓冲液(含6mm氯化钠，ph6.9)、2n氢氧化钠、二硝基水杨酸(dinitrosalicylicacid)呈色试剂(又称为终止剂)、1％可溶淀粉(starch)及α-淀粉酶(α-amylase)。[0067]二硝基水杨酸呈色试剂的制备方式如下：取1g的3,5-二硝基水杨酸加入50ml去离子水，缓慢地加入30g酒石酸钾钠(sodiumpotassiumtartratetetrahydrate)，再加入20ml的2n氢氧化钠，以去离子水定量至100ml。以二氧化碳填充保存，保存期限以两周为限。[0068]1％可溶淀粉的制备方式如下：取1g可溶淀粉溶于100ml的0.02m磷酸钠缓冲液，缓慢地加热使的完全溶解后，温度降温至室温后定量至100ml。分析前至少要置于室温下4到5分钟。[0069]α-淀粉酶(5units/ml)制备方式如下：α-淀粉酶(sigmachemicalco.，美国)以0.02m磷酸钠缓冲液进行溶解，其固体活性为10至30units/mg，以每毫克100units计算，500ku约有50g的α-淀粉酶固体，配制5units/ml可配制成100l的α-淀粉酶，将其冰浴或储存于4℃。[0070]接着，以0.02m磷酸钠缓冲液(含6mm氯化钠，ph6.9)为对照组，以添加2.5wt％西印度樱桃幼果的萃取物作为实验组，实验组及对照组分别有0分钟反应组及10分钟反应组。[0071]之后，准备实验组及对照组，分别取200μl置于微量离心管中，皆各取两管一管作为0分钟反应组另一管作为10分钟反应组；各组加入200μl溶于磷酸钠缓冲液的α-淀粉酶(5units/ml)，混合均匀后，置于25℃下培养10分钟使酵素作用；0分钟反应组，先加入二硝基水杨酸呈色试剂(作为终止剂)，再加入200μl1％可溶淀粉，以避免继续反应；10分钟反应组，加入200μl1％可溶淀粉，混合均匀后，置于25℃下培养10分钟，再加入400μl的二硝基水杨酸呈色试剂，混合均匀后，置于沸水中反应5分钟，将其冷却至室温。0分钟反应组及10分钟反应组皆以适当水量稀释至可测定范围，例如：150μl反应后样品及850μl水，以分光亮度计于540nm侦测吸光值，且背景值以缓冲溶液进行归零。[0072]α-淀粉酶活性抑制能力的计算公式如下：[0073]α-淀粉酶抑制百分比＝[1-(asample10-asample0)/(acontrol10-acontrol0)]×100％[0074]asample10＝实验组10分钟反应组的吸光值[0075]asample0＝实验组0分钟反应组的吸光值[0076]acontrol10＝对照组10分钟反应组的吸光值[0077]acontrol0＝对照组0分钟反应组的吸光值lep(leptin)elisakit)(elabscience)决定瘦体素含量。[0086]图5是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在提升瘦体素含量上的功效的数据图。由图5可见，与对照组相较之下，实验组的瘦体素含量有显着提升(提升18％)。本实施例的结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物可有效提升瘦体素含量，藉此达到调控体重的功效。[0087]实施例6.西印度樱桃幼果的萃取物在降低高度醣化终产物(advancedglycationendproducts,ages)诱发的活性氧分子(reactiveoxygenspecies,ros)表现量上的效用评估[0088]本实施例抗醣化(抑制非酵素褐变，避免体内功能性蛋白质变性)的实验流程如下：以200mm磷酸盐缓冲液(phosphatebuffer)(ph7.4)配制胶原蛋白(collagen)(60mg/ml)(含0.06％nan3)及d-果糖(d-fructose)(1.5m)。之后，分成3组，其中包括1个实验组(即样品)、1个age组及1个对照组。实验组及age组被处理以ages(0.2ml的胶原蛋白及0.2ml的d-果糖混合均匀)。接着，将0.25mg/ml西印度樱桃幼果的萃取物添加至实验组中，而对照组则不做任何处理。接着，于50℃下反应24小时。于上述醣化反应的原点及终点各取0.1ml进行荧光检测(激发波长360nm，放射波长460nm)。[0089]相对ages形成(％)的计算方式如下：[0090][0091]图6是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在降低ages诱发的ros表现量上的功效的数据图。由图6可见，与对照组相较之下，age组的ros阳性细胞有显着提升，这表示ages会诱发细胞产生大量ros。而与age组相较之下，实验组的ros阳性细胞有显着降低(降低57.1％)。本实施例的结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物可有效降低ages诱发的ros表现量，藉此达到抗老化的功效。[0092]实施例7.西印度樱桃幼果的萃取物在抑制蓝光损伤所诱发的皮肤黑色素生成上的效用评估[0093]首先，将老鼠皮肤黑色素瘤细胞株b16f10(购自于atcccrl-6475)培养于杜贝可氏改良的依格氏培养基(dulbecco’smodifiedeagle’smedium,dmem)[添加有1％青霉素/链霉素(gibco)及10％fbs(gibco)]中。于6孔培养盘的每孔中加入3ml的培养基，使每孔具有1.5x105个b16f10细胞。在37℃下培养24小时后，移除培养基。[0094]之后，将b16f10细胞分成4组，其中包括1个实验组、1个对照组、1个蓝光组及1个比较组。将12j/cm2剂量的蓝光照射蓝光组、实验组及比较组的细胞历时1小时。将0.0625mg/ml西印度樱桃幼果的萃取物添加至实验组的细胞中，及将0.0625mg/ml曲酸(kojicacid)(一种黑色素生成抑制剂)添加至比较组的细胞中。至于对照组的细胞则不做任何处理。[0095]各组细胞培养物在37℃下培养48小时后，移除培养基并以1xpbs(gibco)冲洗两次。之后，加入胰蛋白酶(trypsin)来处理细胞3分钟并将悬浮的细胞收集于15ml体积的离心管中，接而以400xg/5分钟进行旋转(spin)以沉淀细胞。在以1xpbs冲洗两次之后，以200μl的1xpbs再悬浮细胞沉淀物(cellpellet)。接着，将细胞溶液于液态氮中放置10分钟，接而于室温下静置30分钟进行解冻。在解冻完全之后，以12,000xg进行旋转30分钟，接而移除上清液并添加120μl的1nnaoh(配于ddh2o)。在混合均匀之后，于60℃干浴槽中静置1小时。之后，取100μl的体积至96孔培养盘中并于450nm的波长下以elisa读取仪来读取各孔的吸光值(od450)。[0096]黑色素含量(％)是藉由将所测得的吸光值(od450)代入下列公式而计算出：[0097]黑色素含量(％)＝(各组所测得的od450吸光值/对照组所测得的od450吸光值)×100％[0098]各组之间的统计学显著差异是藉由史徒登氏t-检定来决定。本实施例的结果显示于图7。[0099]图7是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在抑制蓝光损伤所诱发的皮肤黑色素生成上的功效的数据图。由图7可见，与对照组相较之下，蓝光组的黑色素表现量有显着提升，这表示蓝光损伤会诱发皮肤黑色素生成。而与蓝光组及比较组相较之下，实验组的黑色素表现量有显着降低。本实施例的结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物可有效抑制蓝光损伤所诱发的皮肤黑色素生成，藉此达到美肌的功效。[0100]实施例8.西印度樱桃幼果的萃取物在提升皮肤中胶原蛋白含量上的效用评估[0101]首先，以添加有10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)及1mm丙酮酸钠(sodiumpyruvate)的最低必需培养基(mem)(gibco)培养人类皮肤纤维母细胞(humanskinfibroblast)ccd-966sk(crl-1881)于24-孔盘，500μl培养基的细胞浓度为2×104细胞/孔，接而于37℃进行培养24小时，并以pbs清洗。[0102]接着，将经培养的细胞分成2组，其中包括1个对照组及1个实验组。将实施例1得到的西印度樱桃幼果的萃取物以无血清培养基稀释为具有0.25mg/ml浓度的稀释液，继而添加500μl的该稀释液至实验组的细胞中，至于对照组的细胞则添加500μl的无血清培养基。之后，收取1,000μl的培养基并转移至1.5ml微量离心管中，接而添加200μl的胶原蛋白分离&浓缩试剂(collagenisolation&concentrationreagent)，并翻转离心管6～8次。接着，于4℃进行培养隔夜。之后，取出离心管并以12,000rpm离心10分钟，接而移除1,000μl的上清液。接着，以sircoltm可溶性胶原蛋白分析套组(sircoltmsolublecollagenassaykit)(biocolorlifescienceassays,northernireland,uk)来分析各组的胶原蛋白相对百分比。添加1,000μl的染剂至离心管中，并轻微振荡30分钟，接而以12,000rpm离心10分钟，并移除上清液。接着，添加750μl的酸-盐类清洗试剂(acid-saltwashingreagent)，并以12,000rpm离心10分钟。之后，移除上清液并翻转离心管，接而以棉花棒移除离心管中的液体。接着，添加250μl的碱性试剂并充分振荡混合，继而以光谱讯号传感器测量波长555nm的吸光值，藉此计算出胶原蛋白分泌率，其中以对照组的胶原蛋白分泌率作为100％的基准。本实施例的结果显示于图8。[0103]图8是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在提升皮肤中胶原蛋白含量上的效用的数据图。由图8可见，与对照组相较之下，实验组所测得的胶原蛋白相对百分比有显着的提升。本实施例的结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物确实可提升皮肤中胶原蛋白含量，藉此达到美肌的功效。[0104]实施例9.西印度樱桃幼果的萃取物在提升皮肤中弹力蛋白(elastin)含量上的效用评估[0105]本实验是参考fastintm弹力蛋白分析套组(fastintmelastinassaykit)的用户操作指南来进行。首先，以添加有10％胎牛血清(fbs)、1％青霉素/链霉素及1mm丙酮酸钠的最低必需培养基(mem)(gibco)培养人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk(crl-1881)于6-孔盘，2ml培养基的细胞浓度为1×105细胞/孔，接而于37℃进行培养24小时。[0106]接着，将经培养的细胞分成2组，其中包括1个对照组及1个实验组。将实施例1得到的西印度樱桃幼果的萃取物以培养基稀释为具有0.25mg/ml浓度的稀释液，继而添加2ml的该稀释液至实验组的细胞中，至于对照组的细胞则添加2ml的培养基。在培养各组细胞48小时后，移除培养基并以1xpbs清洗一次。接着，对各组细胞处理胰蛋白酶(trypsin)3分钟，然后以培养基终止胰蛋白酶活性并转移至1.5ml体积的试管中。之后，透过胰蛋白酶收取细胞并转移至1.5ml体积的微量离心管中，然后以300xg离心5分钟。接着，将细胞沉淀物保留在大约300μl的pbs(gibco)中，然后对300μl的细胞悬浮液加入100μl的1.0m草酸(oxalicacid)，并在100℃的加热仪中作用1小时。之后，对每个试管加入等体积的弹力蛋白沉淀试剂(elastinprecipitatingreagent)，盖上试管并短暂涡旋混合，静置15分钟以完成沉淀。接着，以10,000xg离心10分钟，然后排出试管的液体内容物，透过将倒置的试管轻拍到纸巾上，以除去试管中剩余的大部分流体。[0107]接着，添加1ml的染料试剂，透过颠倒试管来混合内容物，然后将试管放在机械振荡器上作用90分钟。之后，排出试管中未结合的染料。弹力蛋白-染料复合物可以观察到为在试管的底部和内部下壁中的红棕色沉积物。接着，对每个试管中加入250μl的染料解离试剂，然后盖上试管，藉由涡旋混合器将染料释放到溶液中，确保所有结合的染料都已进入溶液。之后，将每个试管的内容物转移到96孔盘中，并将盘放入elisa读取仪中，在513nm下测量吸光值。本实施例的结果显示于图9。[0108]图9是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在提升皮肤中弹力蛋白含量上的效用的数据图。由图9可见，与对照组相较之下，实验组所测得的弹力蛋白含量有显着的提升。本实施例的结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物确实可提升皮肤中弹力蛋白含量，藉此达到美肌的功效。[0109]实施例10.西印度樱桃幼果的萃取物在抑制脂肪细胞导致的慢性发炎上的效用评估[0110]收取已分化的脂肪细胞op9(crl-2749tm)培养基(条件培养基，其会诱发脂肪细胞发炎，分泌发炎因子)备用。在96孔盘每孔种1x104颗raw264.7(tib-71tm)，于37℃培养箱培养24小时后，将原培养基吸除，置换成脂肪细胞条件培养基，以每200μl加到96孔盘中，并同时处理待测样品。[0111]之后，将op9细胞分成3组，其中包括1个实验组、1个病理对照组及1个空白对照组。实验组及病理对照组的细胞被处理以op-9条件培养基，俾以诱发发炎反应。接着，将0.25mg/ml西印度樱桃幼果的萃取物添加至实验组的细胞中，而空白对照组的细胞则被添加dmem(gibco)、1％青霉素/链霉素(gibco)及4mml-麸酰胺酸(l-glutamine)(gibco)。放回37℃培养箱反应18小时后，每孔取出150μl移至新的96孔盘中，再每孔加入130μl的ddh2o，接着加入革利士试剂套组(griessreagentkit)(invitrogen)中的a剂及b剂各10μl到每孔中，于室温反应30分钟，最后使用全光谱光学分析仪量(biotek)测波长548nm下的吸光值。[0112]图10是本发明西印度樱桃幼果的萃取物在抑制脂肪细胞导致的慢性发炎上的功效的数据图。由图10可见，与空白对照组相较之下，病理对照组的发炎程度(no含量)有显着提升，这表示脂肪细胞会诱发发炎反应。而与病理对照组相较之下，实验组的发炎程度(no含量)有显着降低(降低8.5％)。本实施例的结果显示，本发明西印度樱桃幼果的萃取物可有效抑制脂肪细胞导致的慢性发炎，藉此达到抗发炎的功效。[0113]综上所述，本发明西印度樱桃幼果的萃取物可藉由抑制α-淀粉酶活性、抑制脂肪酶活性、提升瘦体素含量、抑制蓝光损伤所诱发的皮肤黑色素生成、提升皮肤中胶原蛋白含量、提升皮肤中弹力蛋白含量、抑制脂肪细胞导致的慢性发炎、及降低ros表现量，达到调控体重、美肌、抗发炎及抗老化的功效。另一方面，西印度樱桃幼果的萃取物可有效预防三高，适合开发作为美肌与体重管理的产品。[0114]以上所述仅为举例性，而非为限制性者。任何未脱离本发明的精神与范畴，而对其进行的等效修改或变更，均应包含于后附的权利要求中。[0115]当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。当前第1页12当前第1页12