一种脉冲释放疫苗及其应用

本发明涉及一种脉冲释放疫苗及其应用，属于医药。

背景技术：

1、新型冠状病毒疫情的爆发使得疫苗的关注提升到了前所未有的高度，疫苗接种仍是预防传染病最有效的方法之一。

2、目前的疫苗按抗原来源大致可以分为三种：减毒活疫苗或灭活疫苗、核酸疫苗以及亚单位疫苗。减毒活疫苗免疫原性强但安全性低，灭活疫苗安全性高但效力低；核酸疫苗免疫迅速，但其稳定性差、储存条件苛刻；亚单位疫苗安全性高，其组成成分为病原体特定蛋白，免疫针对性强，但免疫原性较差，需借助佐剂才能实现免疫作用。

3、三类疫苗虽然各有优势和缺点，但在应对新冠病毒的过程中，各类疫苗单次免疫后，都未在体内获得足够的中和抗体水平，或中和抗体水平短暂达峰后迅速降低，需要进行第二次甚至是第三次加强免疫，才产生与康复者血清相仿的中和抗体水平。多次免疫接种已成为对新冠病毒有效预防能力的关键步骤。

4、然而，多针免疫具有极大的局限性，主要包括①容易造成免疫脱失，多次免疫需要付出大量的时间、经济和管理成本；②对于特殊工作人群，如海外派驻人员、边境驻守人员等，难以准时完成后续接种；③大量人群免疫，所需的疫苗制剂可能会受限于包装材料等的供应。对于上述问题，免疫次数的减少都可有效避免。此外，who在其疫苗研究特别专题(thewho special program for vaccine development)中也指出，理想的疫苗载体应通过单次注射实现有效免疫，尤其是在发展中国家，减少免疫次数可以显著提高疫苗接种率。因此，有必要提供一种脉冲释放疫苗。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种实现单针免疫脉冲释放的疫苗，免疫原性强，没有明显毒性并可免疫注射，可在体内有效诱导免疫反应；本发明可通过皮下注射、皮内注射和肌肉注射的方式对动物进行免疫；本发明提供的疫苗的制备条件温和过程简单。

2、本发明提供的脉冲释放的疫苗为包覆了聚电解质膜的自愈合多孔微球，所述自愈合多孔微球的内部载有抗原，其中所述自愈合多孔微球由聚酯类聚合物经复乳-乳化溶剂挥发法制备得到多孔微球后，通过聚合物材料自身的自愈合特性制备；聚电解质膜由抗原和相反电荷的聚阳离子或聚阴离子电解质通过静电吸附形成。

3、具体地，所述自愈合多孔微球按照包括如下步骤的方法制备：

4、将聚酯类多孔微球加入至所述抗原的溶液中，首先进行孵育，而后加热得到自愈合微球。

5、优选地，采用水或hepes缓冲液配制所述抗原的溶液，所述抗原的质量-体积浓度为1～20mg/ml；

6、所述孵育的温度为2～8℃，时间为6～24h；

7、所述加热的温度为37～55℃，时间为6～24h，优选高于所述聚酯类聚合物的玻璃化转变温度1～2℃。

8、所述自愈合多孔微球的孔隙率为35％～60％，孔径为0.01～2μm，粒径为1～100μm，优选为10～50μm，更优选为20～40μm，载有抗原的质量百分比为0.5％～10.0％。

9、具体地，所述聚电解质膜按照包括如下步骤的方法制备：

10、以所述自愈合多孔微球为载体，在其表面以所述聚阳离子电解质或所述聚阴离子电解质和所述抗原为材料通过静电作用力进行逐层自组装；

11、优选地，所述逐层自组装的步骤如下：

12、将所述载有抗原的自愈合多孔微球加入至所述聚阳离子电解质或聚阴离子电解质的溶液中，进行孵育ⅰ；然后加入所述抗原的溶液，进行孵育ⅱ；然后重复上述过程，通常重复5～15次；

13、所述孵育ⅰ和所述孵育ⅱ后均进行离心分离的步骤。

14、优选地，采用下述溶剂配制所述聚阳离子电解质的溶液、所述聚阴离子电解质的溶液和所述抗原的溶液：

15、水、pbs、nacl水溶液(0.5m)或hepes缓冲液(如10mm，ph7.4)；

16、所述聚阳离子电解质或所述聚阴离子电解质与所述抗原的质量比为1：1～3；

17、荷正电的抗原需要所述聚阴离子电解质共同组装成膜，荷负电的抗原需要聚阴离子电解质共同组装成膜；

18、所述聚阳离子电解质可为聚赖氨酸(pll)、聚烯丙基胺盐酸盐、聚乙烯亚胺、聚精氨酸、鱼精蛋白或壳聚糖，与带负电的抗原配合；

19、所述聚阴离子电解质可为聚谷氨酸、聚苯乙烯磺酸钠、聚丙烯酸聚甲基丙烯酸、硫酸葡聚糖、透明质酸、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，带正电的抗原配合。

20、所述孵育ⅰ的温度为2～8℃，时间为10～30min；

21、所述孵育ⅱ的温度为2～8℃，时间为10～30min；

22、所述离心分离的速率为2000～6000×g，离心时间为2～6min。

23、本发明采用的聚酯类的多孔微球由聚酯类聚合物经复乳-乳化溶剂挥发法制备得到；

24、所述聚酯类聚合物为聚乳酸(pla)、丙交酯乙交酯共聚物(plga)或聚己内酯(pcl)；

25、所述聚乳酸的特性粘数为0.2～8.0dl/g，重均分子量为10000～200000；

26、所述丙交酯乙交酯共聚物的特性粘数为0.1～7.0dl/g，重均分子量为10000～100000；

27、所述聚己内酯的特性粘数为0.1～2.0dl/g，重均分子量为30000～100000。

28、所述多孔微球的孔隙率为80％～90％，孔径为0.05～5μm，粒径为1～100μm，优选为10～50μm，更优选为20～40μm；

29、优选地，所述复乳-乳液溶剂挥发法的步骤如下：

30、将所述聚酯类聚合物配制成油相，所述油相与内水相混合得到初乳；将所述初乳转移至外水相中得到复乳；所述复乳经固化后挥去溶剂即得；

31、可在如下溶剂中进行固化：水、缓冲液、以氢氧化钠或盐酸调节了ph的水溶液、含有乳化剂或乙酸乙酯、二氯甲烷等有机溶剂的水溶液；

32、所述内水相为致孔剂的水溶液；

33、采用如下有机溶剂配制所述油相：二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙酸甲酯、乙醚或乙醇混合液等与水不相容，易挥发的有机溶剂；

34、所述致孔剂为碳酸氢钠或碳酸氢铵；

35、所述内水相中所述致孔剂的质量浓度为0.1％～2.0％，优选为0.25％～1.5％，更优选为0.5％～1.0％或1％。

36、优选地，所述外水相可为聚乙烯醇(pva)、明胶、羟丙甲基纤维素(hpmc)或吐温的水溶液，质量浓度为0.1～3.0％，优选2％；

37、所述内水相与所述油相的体积比可为1：1～20如1：4；

38、所述油相与外水相的体积比为1：5～25，如1：7.5。

39、优选地，所述抗原为鸡卵白蛋白、流感病毒相关抗原、新型冠状病毒相关抗原或乙肝病毒相关抗原。

40、本发明提供的脉冲释放疫苗可为治疗性疫苗和预防性疫苗。

41、本发明提供的脉冲释放疫苗可为亚单位疫苗、rna疫苗或dna疫苗。

42、基于自愈合技术和逐层自组装技术，本发明提供的疫苗的脉冲释放由两部分组成，第一次脉冲释放为自组装膜上抗原释放，实现疫苗的首次注射；随着自组装膜和微球的降解，抗原自微球内部释放形成第二次脉冲释放，实现疫苗的第二次加强注射。

43、本发明以多孔聚酯微粒为载体，通过物理扩散法包载抗原，并通过低温加热使多孔微球发生自愈合，使得孔封闭；然后基于逐层自组装技术，在自愈合微球表面以抗原和聚电解质进行自组装。本发明基于自愈合技术和逐层自组装技术实现抗原在体内脉冲释放，模拟疫苗的多次注射；制备的疫苗可有效募集抗原递呈细胞，并释放抗原，被抗原递呈细胞摄取，引起t细胞的活化增殖，并诱导抗原特异性抗体产生。