一种cGAS蛋白的小分子抑制剂的制作方法

本发明涉及一种小分子抑制剂，特别是涉及一种针对cgas蛋白的小分子抑制剂。本发明具体是涉及药物黄芩素作为cgas-sting信号通路抑制剂，在制备治疗相关疾病药物中的应用。

背景技术：

1、肺癌是恶性肿瘤中发病率和死亡率最高的疾病，占所有癌症相关死亡的30%，每年导致约160万人死于肺癌。肺癌可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，大约85%的患者属于非小细胞肺癌，含肺腺癌和肺鳞状细胞癌是其中两种最常见的亚型。

2、肿瘤的发生有着多种机制，其中促癌基因和抑癌基因的突变常常发挥着关键作用。在已知的癌症相关基因中，p53和kras是肿瘤特别是肺癌发生中最常见的两种突变基因，也是占肺癌绝大多数的非小细胞肺癌发生中常见的突变。虽然kras/p53基因双突变是肺癌常见的突变形式之一，但其驱动肺癌发生的机制有待深入阐明。

3、慢性炎症可以促进肿瘤发生。除环境因素外，kras、p53、myc等基因的突变亦可引发慢性炎症。其中，kras和p53异常可导致线粒体功能障碍、活性氧（ros）产生和下游信号传导（如n-fkb、stat3等），最终促进炎癌转变。

4、有研究表明，线粒体代谢和ros产生是kras诱导的致瘤性所必需的。线粒体通过提供能量、钙缓冲和调节细胞凋亡，在细胞存活中发挥着重要作用，它的损伤与肿瘤发生有着千丝万缕的关系。

5、肺癌的发展也与线粒体dna（mtdna）突变有关。mtdna的基因特征因肺癌亚型、分期和严重程度而异。特别值得注意的是，线粒体损伤过程中会释放dna，然而kras和p53是否通过调控mtdna释放进而影响肺癌发生并不清楚。

6、环gmp-amp合酶（cgas）是识别mtdna的重要受体，其活化受到精细调控。生物大分子的相分离作为细胞内生化反应的聚集分割机制，参与细胞生命活动的各个阶段和过程。近期研究发现，cgas介导的固有免疫激活同样受到相分离的调节。

7、cgas的n端带有正电荷且无序，这能够促进其与带负电的dna结合，导致cgas-dna复合物的液-液相分离。这种cgas-dna复合物的相分离创造了一个相对独立的环境，能够避免cgas被负调节因子如核酸外切酶trex1、baf等所抑制。因此，cgas的相分离能够进一步促进cyclic gmp-amp（cgamp）的产生，并诱导i型干扰素与下游炎症性细胞因子的表达。

8、越来越多的研究表明，cgas在肿瘤发生与进展中发挥双向调控作用。cgas-sting信号通路慢性激活可通过i型干扰素下游的stat等通路活化驱动肿瘤发生和转移。cgas还可以通过抑制dna同源重组修复，引起基因组不稳定增强，促进肿瘤发生。cgas已经成为癌症预防和治疗的重要靶标，使用针对cgas的小分子药物对肿瘤发生进行干预是一种重要策略。

9、kras以及p53突变是否通过增加mtdna释放驱动cgas通路，进而驱动肺癌发生亟待明确。

10、随着低剂量螺旋ct的技术的不断普及，大大提升了临床上早期肺癌合并多发结节的诊断和发现。然而，对于早期肺癌合并多发结节，除手术之外的干预手段非常有限。基于肺癌发生和演进的机制，开发新型的药物干预手段，是早期肺癌合并多发结节治疗的重要方向。

11、在预防线粒体损伤方面，天然化合物一直是发现新候选药物的宝库。许多黄酮类化合物被证明在保护线粒体方面有效，而黄芩素是其中的佼佼者。中药黄芩（ scutellariae  radix）的根部含有三十几种丰富的黄酮类衍生物，黄芩素和黄芩苷是其中的主要成分。因具有显著的抗炎、抗癌和改善线粒体功能的作用，黄芩素受到制药、化妆品和食品行业的日益关注。大量研究表明，黄芩素对线粒体功能和结构有保护效果，并对线粒体功能障碍及引发的疾病有治疗作用。

12、虽然黄芩素在抗炎、抗癌以及线粒体保护方面的效果无可争辩，但其背后的机制却并不明朗。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种cgas蛋白的小分子抑制剂。

2、本发明的目的还在于提供黄芩素作为cgas-sting信号通路抑制剂的应用。

3、本发明研究发现，在人为诱导的kras/p53双突变小鼠肺癌模型中，会造成mtdna释放的显著增加，并通过激活cgas介导的炎症应答，驱动肺炎癌转变发生。

4、但本发明同时也发现，黄芩素在保护kras/p53双突变小鼠肺部线粒体功能完整性的同时，在源头上抑制了mtdna的异常释放，又可以特异性地与cgas蛋白结合，并阻断cgas相分离以及下游通路的活化，进而抑制炎癌转变过程，抑制肺癌的发生，验证了黄芩素对肿瘤发生的阻断作用。

5、在相应的蛋白质和转录组学数据中，本发明研究发现，cgas是黄芩素的新的作用靶点，黄芩素对cgas通路的激活有抑制作用。

6、基于上述研究发现，本发明提供了一种cgas蛋白的小分子抑制剂，该抑制剂中包含有活性成分黄芩素。

7、进一步地，本发明提供了黄芩素作为小分子抑制剂，在制备cgas-sting信号通路抑制剂药物中的应用。

8、具体地，本发明所述药物作为cgas-sting信号通路抑制剂，可用于治疗cgas-sting信号通路异常激活的疾病，包括炎症性疾病和癌症，特别是肺癌。

9、本发明所述药物还可用于防治或治疗cgas过度活化相关疾病。

10、cgas除了与多种癌症的发生发展相关外，还与各种自身炎症、自身免疫和退行性疾病相关，具体包括：系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、aicardi-goutieres综合征、帕金森病、缺血性脑损伤、布卢姆综合征、一般神经变性、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、痴呆、黄斑变性、脑损伤、非酒精性脂肪肝性炎、酒精性肝病、急性胰腺炎、败血症、二氧化硅诱导的纤维化、心梗、主动脉瘤、慢性心衰、衰老、老化、肾小管肾炎、肥胖、胃肠道炎症性疾病。

11、更具体地，本发明所述药物作为cgas-sting信号通路抑制剂，是通过靶向与cgas的结合，抑制了mtdna对cgas蛋白的慢性激活。

12、通过一系列的生化实验，本发明证明了黄芩素可以直接与cgas结合，有效抑制cgas的相分离和mtdna对cgas蛋白的慢性激活，并最终抑制炎癌转变的发生。因此，本发明研究从临床与动物实验数据出发，阐明了在临床常见的kras/p53双突变情况下，mtdna释放与cgas在癌症发生中扮演的角色，并找到了可同时抑制这两个过程的小分子——黄芩素（baicalein），在分子水平上阐明了黄芩素在肺癌发生中的抗癌作用原理。

13、本发明在原发性肺癌小鼠模型上证实了黄芩素的抗肿瘤效果，并在针对肺组织进行蛋白与转录组学分析后，发现黄芩素对线粒体具有良好的保护作用，同时，黄芩素显著抑制了cgas-sting信号通路相关基因的表达，并维持了肺组织中免疫系统的功能。

14、线粒体被广泛认为是活性氧（ros）的主要内源性来源，过量的ros会损害线粒体内的蛋白质和dna等重要分子，对细胞产生不利影响。人为诱导的kras突变与p53基因敲除细胞中的最大耗氧量显著上升，mtdna释放增加。p53可以调控氧化磷酸化复合物的组装，mtdna的修复、复制和转录以及维持正常线粒体稳态的自噬等多种途径。

15、p53缺失的细胞中，线粒体是唯一具有自身dna的细胞器，在线粒体受损的情况下会有mtdna释放。而黄芩素作为一种多酚类化合物，具有抗氧化清除自由基的功能，在p53缺失的情况下，黄芩素可能通过清除自由基等机制有效保护线粒体，并抑制mtdna的释放，进而阻断胞内监视途径的活化。

16、本发明明确了cgas在识别kras/p53基因突变诱导的mtdna中的关键作用。kras/p53基因突变引起细胞质中游离mtdna含量增加，并且可以直接激活cgas-sting通路，包括tbk1和irf3的磷酸化及下游i型干扰素和cxcl10的表达，从而诱发炎症。

17、本发明研究提示，在kras/p53诱导肿瘤发生的过程中，mtdna-cgas-sting通路发挥着重要作用，cgas通路是早期肺癌干预的重要分子靶点。

18、特别值得注意的是，在细胞水平上，本发明证明了黄芩素可以有效地抑制mtdna释放、抑制cgas-sting通路下游因子的产生。

19、在动物实验中，相比于cre组，黄芩素组的小鼠肺组织中cgas-sting通路表达水平显著降低，特别是i型干扰素下游的stat1磷酸化水平可以被黄芩素显著抑制。

20、这些现象显示出黄芩素强大的抗炎作用，提示黄芩素可能通过阻断cgas-sting-ifn i-stat1信号通路抑制炎癌转变过程。

21、值得注意的是，转录组学与蛋白质组学数据发现，黄芩素在原发性肺癌模型小鼠的肺组织中维持了肿瘤发生早期肺组织中中性粒细胞的数量，在肿瘤发生期抑制了th17细胞数量，并维持了b和nk细胞的数量。

22、越来越多的证据表明，cgas-sting通路的长期激活，可以通过招募更多treg细胞等方式，最终诱导出免疫抑制性的肿瘤微环境，使得肿瘤细胞逃逸宿主免疫。因此，黄芩素可能通过抑制cgas活化，避免了因cgas慢性激活造成的肿瘤微环境免疫抑制的发生以及肿瘤细胞的免疫逃逸，维持了肺组织中免疫系统的功能。

23、此外，黄芩素还抑制了血管生成相关蛋白的表达。这是一个肿瘤恶性程度的重要指标，提示黄芩素可能通过抑制血管形成阻断肺癌的发生。

24、转录组和蛋白质组学数据提示，黄芩素除抑制cgas驱动的炎癌转变外，还可能同时通过多种免疫效应机制抑制肺癌发生。

25、黄芩素作为中药单体的研究备受关注，前期研究已经发现黄芩素的多个作用靶标，包括黄芩素作为tlr4结合配体以及pi3kγ的结合配体。本发明研究进一步明确了cgas是黄芩素新的作用靶标。

26、spr实验表明，黄芩素可以直接结合cgas，解离常数仅为3.2µm。通过分子docking理论计算和蛋白质突变实验，本发明预测并证明了第376-379号氨基酸残基为cgas蛋白与黄芩素的结合位点。

27、特别重要的是，黄芩素结合cgas后，可以直接导致cgas完全失去与双链dna结合的能力及其合成cgamp的酶活性，且黄芩素通过这个位点与cgas的结合对其抑制作用的发挥十分关键。

28、研究发现，cgas介导的固有免疫激活同样受到相分离的调节。cgas的n端带有正电荷且无序，这能够促进其与带负电的dna结合，导致cgas-dna复合物产生液-液相分离，并产生一个相对独立的环境，能够避免cgas被负调节因子如核酸外切酶trex1、baf等所抑制，促进其合成cgamp的能力。值得注意的是，相分离在细胞中普遍存在，参与调控多种生物学过程，其功能紊乱与肿瘤等多种疾病的发生密切相关。因此，通过筛选小分子化合物来调节细胞异常相分离，已经成为药物开发的重要方向。通过阻止cgas的异常相分离，促使cgas-dna复合体的聚集沉淀，从而降低产生cgamp的效率。

29、特别有趣的是，本发明发现，黄芩素可以直接抑制cgas的相分离，进而阻断其活化过程，阻止肺癌的发生。这也是目前报道的首个可以直接抑制cgas相分离的小分子，为肺癌的早期干预提供了重要的候选药物。

30、特别值得注意的是，cgas-sting信号通路的过度活化与自身免疫性疾病的发病密切相关，因而，黄芩素作为cgas抑制剂的这一重要发现，也为cgas-sting通路活化相关的免疫性疾病提供了新的治疗手段。

31、总之，本发明发现了mtdna-cgas驱动的慢性炎症在肺癌发生发展过程中的关键作用，并且发现了黄芩素可以实现对mtdna释放及cgas活化的双重调控。本发明的研究为早期肺癌的干预提供了分子靶标和候选药物，相关发现也为cgas过度活化相关的疾病提供了重要的干预手段。