一种猪伪狂犬病病毒亚单位的疫苗组合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于兽用生物制品领域，具体地说，涉及猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗及其制备方法，以及该疫苗的应用。

背景技术：

1、猪伪狂犬病(pseudorabies，pr)由伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，prv)感染引起的猪急性传染病，是目前我国流行的主要猪病之一。我国于上世纪70年代引进了bartha-k61疫苗，使得该病在1990年～2010年间得到了较好的控制。然而自2011年以来，许多使用猪伪狂犬病活疫苗bartha-k61免疫的规模化猪场发生了由猪伪狂犬病病毒变异毒株引起的猪伪狂犬病。目前，猪伪狂犬病病毒变异毒株已经遍布我国主要养猪地区，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。

2、国内已上市利用变异毒株制备的灭活疫苗或变异弱毒制备的活疫苗，对我国猪伪狂犬病的防控起到重要作用。但活疫苗的使用仍存在病毒重组，毒力返强的风险，灭活疫苗在生产过程中存在散毒的风险。因此，研制出能够抵御猪伪狂犬病病毒变异毒株且安全有效的基因工程亚单位疫苗，并能通过血清学方法对猪伪狂犬病病毒野毒感染猪和疫苗接种猪进行鉴别诊断对我国实现猪伪狂犬病的净化具有重要的意义。

3、猪伪狂犬病毒表面糖蛋白gb和gd都能在体内外产生中和抗体。是研发和制作prv亚单位疫苗的首选糖蛋白。

4、gd蛋白又称gp50或gvi蛋白，是由病毒us6基因编码的一种i型跨膜糖蛋白。gd是细胞外病毒穿透细胞所必需的受体结合蛋白，缺失了gd的prv病毒虽然能产生噬斑，但子代病毒并不具有感染性，再次进入宿主的效率非常低，只能以细胞间直接转移方式侵染邻近细胞。gd蛋白是重要的保护性抗原，能够刺激机体产生保护性中和抗体。marchioli(marchioli cc,yancey rj,petrovskis ea,timmins jg,post le.evaluation ofpseudorabies virus glycoprotein gp50 as a vaccine for aujeszky’s disease inmice and swine:expression by vaccinia virus and chinese hamster ovary cells.)等利用cho表达系统表达gd蛋白，用20ld50的rice毒株对小鼠进行攻毒，免疫后的小鼠存活率为80～100％，而用40ld50的rice毒株对猪进行接种攻毒，免疫后的猪存活率为100％，但攻毒后3～7日部分猪的鼻拭子存在散毒。zhang(zhang t,liu y,chen y,wang a,feng h,wei q,et al.a single dose glycoprotein d-based subunit vaccine againstpseudorabies virus infection.vaccine 2020；38:6153–61.)等用杆状病毒表达纯化gd蛋白并免疫小鼠，5ld50剂量的prv-hnlh进行攻毒，小鼠存活率87.5％。因此，gd蛋白能有效抵御prv病毒的攻击，但由于gd蛋白较容易产生变异，单独免疫gd蛋白产生的保护力不能完全满足临床上的需求，这与我们利用cho系统表达纯化后的gd蛋白免疫猪攻毒后的结果一致。

5、gb蛋白又称gii蛋白，也是病毒的主要免疫原性蛋白。gb蛋白是病毒融合进入细胞必需的糖蛋白，缺失了gb蛋白的病毒既不能进入细胞也不能在细胞间传递。此外，gb蛋白不仅可以诱导宿主细胞产生补体依赖性的中和抗体，而且还可诱导一个不依赖于补体的中和抗体1h1。该中和抗体表位可广泛中和不同的经典毒株和变异毒株(如bartha、hb98、ra、su、hn、hn1201和bh1等毒株)，且表位的序列在不同的毒株中完全相同(li x,yang f,hu x,tanf,qi j,peng r,et al.two classes of protective antibodies against pseudorabiesvirus variant glycoprotein b:implications for vaccine design.plos pathog2017；13:e1006777.)。gb真核表达质粒免疫猪后，能够显著降低攻毒后排毒量，然而gc或gd真核表达质粒免疫猪后仍存在较明显排毒。tsuchida(tsuchida ma,katayama s,okada n,okabe t,sasaki n.protection from pseudorabies virus challenge in mice by acombination of purified gii,giii and gvi antigens.j vet med sci1992；54:447–52.)等用纯化后的gb蛋白免疫小鼠，用8.5×103pfu的剂量攻毒，小鼠的存活率为82％。wang(wang y,wang t,yan h,yang f,guo l,yang q,et al.research and developmentof a novel subunit vaccine for the currently circulating pseudorabies virusvariant in china.front agric sci eng 2015；2:216.)等用杆状病毒表达gb蛋白(200μg)免疫猪，28日后用2×107.0tcid50的hn1201变异毒株攻毒，结果显示，所有免疫猪均存活，有两头免疫猪体温超过40℃，5日后恢复，未出现临床症状。而对照组猪，体温超过41℃，出现典型的猪伪狂犬症状，5～7日后全部死亡。因此，gb蛋白是重要的保护性抗原，能有效抵御prv病毒攻击，但单独的gb单独蛋白产生的保护力也不能完全满足临床上的需求。

6、专利cn106267182a，2017.1.4公开了采用杆状病毒表达系统表达gd和gb亚单位蛋白，得到的亚单位疫苗，在攻毒实验中，样本表现出不同程度的临床症状，因此为非安全良好的亚单位疫苗。

7、专利cn110327461a，2019.10.15公开了一种由gb、gd、gc、gh和gl组成的免疫疫苗组合物，组成复杂，不利用工业化生产。

8、研究表明当前流行的prv的遗传背景和经典毒株存在显著差异，而且致病力显著增强，导致现有的猪伪狂犬病弱毒疫苗的免疫效果显著下降，不能有效控制当前prv变异毒株的流行。

9、因此，有必要研制一种生产成本低、安全有效、生产效率高以及疫苗免疫效果好的猪伪狂犬病病毒疫苗，具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗，及其制备方法和应用，其优点是免疫效力良好、安全性高、副反应小、生产成本低，并且安全、有效、质量可控。

2、根据本发明的第一方面，本发明提供了一种猪伪狂犬病病毒亚单位的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb、以及药学上可以接受的佐剂；其中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb均为哺乳动物细胞表达系统表达的糖基化蛋白，并且，所述疫苗组合物中的抗原仅含有所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb。

3、在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述哺乳动物细胞表达系统为cho表达系统。

4、在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb按照1-2:2-1质量比混合。

5、在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb按照等质量比混合。

6、在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb的蛋白浓度均为25μg/头份～100μg/头份。

7、在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb的蛋白浓度均为50μg/头份～100μg/头份

8、在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述药学上可以接受的佐剂为水包油包水双相乳化佐剂。

9、在本发明的疫苗组合物的优选技术方案中，优选地，所述药学上可以接受的佐剂为isa 201vg。

10、根据本发明的第一方面，本发明提供了一种制备所述疫苗组合物的方法，包括以下步骤：1)制备猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb；其中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb为哺乳动物细胞表达系统表达的糖基化蛋白；2)将步骤1)中制备的所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb用无菌pbs稀释，以得到符合抗原蛋白含量要求的水相；3)将水包油包水双相乳化佐剂进行灭菌，以得到油相；4)将步骤2)的所述水相与步骤3)的所述油相进行预热，再将所述水相和所述油相进行混合乳化，以得到乳化后液体；其中，所述水相与所述油相的重量比为1：1，或者所述水相与所述油相的体积比为46:54；以及5)将步骤4)的所述乳化后液体进行定量分装。

11、在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，步骤2)中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb按照1-2:2-1质量比混合。

12、在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，步骤2)中，所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gd和所述猪伪狂犬病病毒结构蛋白gb按照等质量比混合。

13、在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，步骤3)中，所述水包油油包水两相乳化佐剂为isa 201vg。

14、根据本发明的第一方面，本发明提供了一种所述疫苗组合物在制备用于预防猪伪狂犬病毒感染的疫苗中的应用。

15、本发明选用了相对较保守的gb蛋白和相对较容易变异的gd蛋白作为亚单位疫苗的保护性抗原，制备成双组份基因工程亚单位疫苗，使两种抗原相辅相成，能更加满足国内猪场经典毒株和变异毒株共存的形势，更好地发挥免疫保护作用，保护猪免受prv病毒的攻击。