单磷酰脂质A在制备治疗成人弱视的药物中的应用的制作方法

单磷酰脂质a在制备治疗成人弱视的药物中的应用
技术领域
1.本发明属于化合物新的制药用途领域，具体地说，涉及一种单磷酰脂质a在制备治疗成人弱视的药物中的应用。


背景技术：

2.弱视是由于在视觉发育早期，因形觉剥夺和(或)双眼异常相互作用引起的单眼或双眼最佳矫正视力减退，而无明显器质性异常的视功能疾患。在临床上定义为眼部无明显器质性病变，以功能性为主所引起的最佳矫正视力低于正常且双眼最佳矫正视力相差两行者视为弱视。其中形觉剥夺是弱视主要成因之一，单眼形觉剥夺较双眼所造成的后果更为严重。
3.弱视的治疗效果与年龄密切相关，也与弱视程度、类型与注视性质密切相关，早起发现和坚持综合治疗是治疗弱视的关键。国际上一般公认为关键期或敏感期是指小儿自出生至6 岁，最迟平均为8.5岁，发病率为3～4％，而0～7岁为最佳治疗期，12岁以后的治疗效果极差。目前，弱视的治疗方法以物理疗法为主，其中传统的“遮盖疗法”虽已经历了200多年的延用，但仍然被认为是目前最主要和最有效的治疗方法。
4.相较于易早期干预的儿童弱视，由于各种原因错失年幼最佳弱视治愈时间而出现成年弱视成为成人视力不良的重要原因。弱视严重影响成年患者的工作选择与生活质量。此外，当所谓“健眼”患眼部疾病或受伤后，单眼弱视的患者视觉缺陷的风险将大幅增加。因而重视成年弱视群体防治，寻求有效治疗手段具有着深远的社会意义。
5.mpla(单磷酰脂质a，monophosphoryl lipid a)是沙门氏菌r595的突变体，是将lps (r)-3-羟基十四烷酰基和1-磷酸盐基团经过连续水解后得到的解毒化学衍生物，它的lipida部分可以与tlr4结合，mpla高效激活tlr4及其下游信号通路，诱导g-csf、il-2、 ifn等细胞因子表达。mpla作为tlr4靶向配体，不仅在前期基础毒理学分析中证明其毒性低，其毒性水平仅为脂多糖的约0.1％，但具有相当的免疫刺激活性，所以被广泛用作疫苗、过敏药物和免疫疗法的佐剂，用以增强免疫反应。
6.作为神经系统发育相关的视功能疾患，弱视尤其单眼形觉剥夺性弱视可导致严重视觉发育障碍。由于视觉发育关键期后视皮层神经可塑性的降低，成年弱视有效治疗仍是当前重大临床难题。目前，对于成人弱视的治疗药物也很少，寻求一种新的对成人弱视有治疗效果的药物是眼科界的追求热点。现有技术中未见有mpla对成人弱视有治疗作用的相关报道。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供mpla的新用途，即在制备治疗成人弱视的药物中的应用。
8.为实现上述目的，本发明提供单磷酰脂质a在制备治疗成人弱视的药物中的应用。
9.本发明通过构建由mpla诱导的小胶质细胞激活的成年小鼠单眼剥夺模型，探明激活的小胶质细胞对成年小鼠视皮层v1b区可塑性再激活及机制研究，发现在视觉发育关键
期和关键期后腹腔注射mpla激活大脑中的小胶质细胞，可延长小鼠视觉发育关键期，可将视皮层可塑性延续至成年时期；在成年时期注射mpla，可重启odp可塑性，在视皮层发育成熟后单眼剥夺可改变眼优势，实现视皮层可塑性重塑，可以治疗单眼剥夺弱视小鼠的弱视眼视力。
10.进一步地，本发明提供单磷酰脂质a在制备通过激活小胶质细胞来治疗成人弱视的药物中的应用。
11.本发明中，所述药物为单方制剂或复方制剂。
12.所述单方制剂或复方制剂的剂型为注射剂、鼻腔喷雾剂、口服混悬液、片剂或胶囊。
13.所述的单方制剂为单磷酰脂质a与药用辅料制成的；
14.所述的复方制剂为单磷酰脂质a与至少一种其他药物活性成分和药用辅料制成的。
15.当复方制剂中的其他药物活性成分为一种时，所述的单磷酰脂质a与其他药物活性成分的质量比为20～99：80～1。
16.所述其他药物活性成分为治疗眼部疾病的药物活性成分、抗抑郁药物活性成分以及改善肠道菌群的药物或膳食纤维。
17.进一步地，所述药物的给药剂量以单磷酰脂质a计为0.1～1.0mg/kg。
18.优选地，所述药物的给药剂量以单磷酰脂质a计为0.5mg/kg。
19.所述药物在视觉发育关键期和关键期后给药。
20.本发明所提供的mpla作为制备治疗成人弱视药物具有以下优点：
21.(1)毒副作用小，目前将mpla作为佐剂在疫苗研发领域得到了广泛应用，临床试验未发现明显毒副作用；
22.(2)疗效显著，在视觉发育关键期和关键期后腹腔注射mpla激活大脑中的小胶质细胞，可延长小鼠视觉发育关键期，可将视皮层可塑性延续至成年时期；在成年时期注射mpla，可重启odp可塑性，在视皮层发育成熟后单眼剥夺可改变眼优势，实现视皮层可塑性重塑，可以治疗单眼剥夺弱视小鼠的弱视眼视力。
附图说明
23.图1为建立的小鼠单眼剥夺弱视模型图；
24.图2为各组小鼠右眼pvep p100波幅比较；
25.图3为各组小鼠眼优势值(c/i)比较；
26.图4为v1b区小胶质细胞被激活后形态变化图；
27.图5为视皮层v1b区小胶质细胞激活后对神经元包裹并置换抑制性突触的形态图。
具体实施方式
28.以下为本发明的具体实施方式，所述的实施例是为了进一步描述本发明，而不是限制本发明。
29.实施例1、单磷酰脂质a注射液
30.组分：
[0031][0032]
制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。
[0033]
实施例2、单磷酰脂质a鼻腔喷雾剂
[0034]
组分：
[0035][0036]
制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。
[0037]
实施例3、单磷酰脂质a口服混悬液
[0038]
组分：
[0039][0040]
制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。
[0041]
实施例4、单磷酰脂质a片剂
[0042]
组分：
[0043][0044]
制备方法：采用药学领域常用的方法制备得到。
[0045]
实施例5、单磷酰脂质a胶囊
[0046]
组分：
[0047][0048]
制备方法：将上述组分按重量称取后，然后将原料按常规软胶囊生产工艺制成颗粒式胶囊，装瓶即得胶囊。
[0049]
试验例1
[0050]
1、实验方法
[0051]
1.1、单眼剥夺
[0052]
将麻醉后的小鼠右眼眼睑周围碘伏消毒，上下眼睑剪除，滴用可乐必妥滴眼液预防感染，用8-0缝线将眼睑单纯间断缝合，术后在伤口处涂抹典必殊眼膏，建立小鼠单眼剥夺弱视模型，如图1。
[0053]
1.2、mpla注射、lps注射
[0054]
生理盐水将mpla粉末溶解配为浓度为1mg/ml的储存液，分装储存于-20℃。注射前将 mpla储存液稀释为0.1mg/ml，按照0.5mg/kg剂量腹腔注射于小鼠。注射方法为连续注射四天，间隔6天，再进行下一循环。
[0055]
生理盐水将lps粉末溶解配为浓度为1mg/ml的储存液，分装储存于-20℃。注射前将 lps储存液稀释为0.1mg/ml，按照0.5mg/kg剂量腹腔注射于小鼠。注射方法为连续注射四天，间隔6天，再进行下一循环。
[0056]
1.3、电极植入手术
[0057]
将麻醉后的小鼠双眼涂抹修护膏，颅顶部皮毛剪除，露出颅骨。记号笔标记出左脑视皮层区域，位于后囟“人”字缝旁约3mm，电钻在标记处钻出直径约2.5mm颅窗，暴露硬脑膜，将自制电极(刺激电极)置于硬脑膜后覆盖圆形玻璃片，用强力胶将玻璃片固定于颅骨；用同样方法在对侧额叶部位开同样大小颅窗植入记录电极。最后利用牙科水泥将橡胶电极
保护管封闭固定于暴露的颅骨。
[0058]
1.4、pvep记录
[0059]
将麻醉后的小鼠置于鼠台，剪开缝合的右眼眼睑，使小鼠双眼正对距离15cm的视觉刺激显示屏。将小鼠头部预置的记录电极、参考电极与外接放大器连接，视觉刺激为有 matlab自编程序控制的翻转黑白棋盘格，空间频率为0.02周/度，时间频率为1hz，叠加 240次。两只眼分别记录，利用黑色胶布遮住记录眼的对侧眼，记录信号由ced1401系统、 spike2软件采集，后由matlab自编分析程序进行数据分析得出p100波形，包括峰时值和波幅。眼优势值(od值)c/i＝对侧眼p100波幅值/同侧眼p100波幅值。
[0060]
2、结果
[0061]
2.1、各组小鼠图形视觉诱发电位p100波的比较
[0062]
对照组：7只，常规饲养，无干预措施；
[0063]
md对照组：7只，p61～p80天龄进行右眼单眼剥夺(眼睑缝合)；
[0064]
实验组a：7只，p61～p80天龄间断lps注射(p61～p64，p71～p74)，同时进行右眼单眼剥夺；
[0065]
实验组b：7只，p61～p80天龄间断mpla注射(p61～p64，p71～p74)，同时进行右眼单眼剥夺。
[0066]
对照组、md对照组分别与实验组a、实验组b之间，右眼(剥夺眼)p100波波幅差异显著，且具有统计学意义(p＝0.0003，如图2)。对照组与md对照组双眼p100波波幅均无显著差异(p＝0.209)。对照组、md对照组分别与实验组a、实验组b之间，左眼(非剥夺眼)p100波波幅无显著差异(p＝0.948，如图2)。
[0067]
2.2、各组小鼠图形视觉诱发电位c/i的比较
[0068]
对照组：7只，常规饲养，无干预措施；
[0069]
md对照组：7只，p61～p80天龄进行右眼单眼剥夺(眼睑缝合)；
[0070]
实验组a：7只，p61～p80天龄间断lps注射(p61～p64，p71～p74)，同时进行右眼单眼剥夺；
[0071]
实验组b：7只，p61～p80天龄间断mpla注射(p61～p64，p71～p74)，同时进行右眼单眼剥夺。
[0072]
对照组、md对照组分别与实验组a、实验组b之间，眼优势值c/i差异具有统计学意义(p＝0.000，如图3)。对照组与md对照组眼优势值c/i差异无统计学意义(p＝0.072) 图3。
[0073]
2.3、mpla腹腔注射后激活视皮层小胶质细胞，置换抑制性神经元，重启视皮层可塑性
[0074]
对照组：7只，常规饲养，无干预措施；
[0075]
md对照组：7只，p61～p80天龄进行右眼单眼剥夺(眼睑缝合)；
[0076]
实验组(mpla组)：7只，p61～p80天龄间断mpla注射(p61～p64，p71～p74)，同时进行右眼单眼剥夺。
[0077]
实验组(mpla组)mpla连续注射四天后，全脑小胶质细胞激活，此时计数各组小鼠大脑初级视皮层v1b区2/3层每20倍镜下视野中小胶质细胞数量。实验组(mpla组)小胶质细胞数目显著高于对照组和md对照组(见图4)，对照组、md对照组、实验组mpla 注射后1天、mpla注射后7天在每20倍镜下视野中小胶质细胞数量均数分别为21.45
±ꢀ
4.44、20.30
±
4.67、33.72
±
3.79、31.44
±
4.00，在注射mpla1-7天后小胶质细胞均显著增多，具有统计学意义(p＝0.000)，且可以观察到小胶质细胞激活后不仅数目增多，细胞体积增大，分支增粗(见图4)。
[0078]
将小胶质细胞(iba1)、抑制性突触(vgat)、神经元(neun)共定位，可以观察到激活的小胶质细胞包裹在神经元周围，将抑制性突触置换(如图5)。计数包裹在神经元周围并置换抑制性突触的小胶质细胞的占比，实验组(mpla组)与对照组和md对照组相比显著升高(如图5)，对照组、md对照组、实验组(mpla组)分别为33.43
±
7.37％、30.86
ꢀ±
7.92％、56
±
8.50％，差异具有统计学意义(p＝0.000)。
[0079]
mpla可以在成年小鼠关键期后重新开启视皮层可塑性，为成年小鼠弱视治疗提供大脑皮层可塑性条件。
[0080]
2.3、mpla可以治疗成年弱视小鼠
[0081]
con成年(正常对照组)：6只，成年对照组小鼠；
[0082]
mdp21-60(md组)：8只，单眼剥夺右眼(p21-p60)；
[0083]
mdp21-60+反转剥夺左眼(p60-80)：5只，从p21-p60天单眼剥夺右眼后反转剥夺左眼(p60-p80)；
[0084]
mdp21-60+mpla治疗：5只，从p21-p60天单眼剥夺右眼后单纯腹腔注射mpla不加反转遮盖；
[0085]
mdp21-60+mpla治疗+反转剥夺左眼(p60-80)(md+mpla组)：7只，从p21-p60 天单眼剥夺右眼后腹腔注射mpla联合反转遮盖左眼(p60-p80)。
[0086]
对各组进行pvep记录，方法同上。结果见表1所示：
[0087]
表1
[0088][0089]
本发明人验证了mpla激活小胶质细胞后可以起到成年弱视小鼠的治疗作用，这一临床意义更为重要。本发明实验中，对小鼠进行了全关键期(p21-p60)的单眼剥夺，造成了弱视模型，后对小鼠进行mpla腹腔注射治疗联合反转剥夺左眼(缝合非剥夺眼)即 md+mpla组，根据实验结果本发明发现：
[0090]
①
先行右眼全关键期剥夺造成右眼弱视模型后，mpla腹腔注射联合反转剥夺左眼治疗后，弱视眼(右眼)的p100波振幅较md组的弱视眼有显著提升，但基本接近与con组的正常水平；
[0091]
②
根据双眼p100波幅值，计算测出的c/i值(提示眼优势可塑性)在mpla腹腔注射联合反转剥夺治疗后显著提高，达到与正常对照组相似的水平。
[0092]
③
先行右眼全关键期剥夺造成右眼弱视模型后，单独mpla腹腔注射，不联合反转剥夺左眼治疗，弱视眼(右眼)的p100波振幅较md组的弱视眼亦有显著提升，且c/i亦明显提高。