枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用

1.本发明涉及动物医药领域，具体涉及枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。


背景技术：

2.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)于1971年首次在英国报道，其病原体被命名为“猪流行性腹泻病毒”，中国在1976年第一次报道了此病。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，pedv)引起的一种急性、高度接触性猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状，各年龄阶段的猪均易感。哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪的发病率可达100％，哺乳仔猪群受害最为严重，病死率平均50％左右。已经成为包括中国，日本，韩国，泰国以及菲律宾等亚洲国家养猪业中严重的传染性疾病，造成了巨大的经济损失。
3.猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒，基因组全长约为28kb，为有囊膜、不分节段的单股正链rna病毒。包含5’帽子结构和3’腺苷尾巴结构，包括7个开放阅读框(orf)，编码3个非结构蛋白(复制酶1a、1b以及orf3)和4个结构蛋白分别为:150-220kda糖基化的刺突(s)蛋白、20-30kda膜(m)蛋白、7kda包膜(e)蛋白和58kda核衣壳(n)蛋白。目前，对该病的防控以疫苗免疫防控为主。然而，对于新生仔猪和哺乳期仔猪而言，疫苗免疫效果并不理想。因此，寻找具有毒性低、无残留和不产生抗药性等特点的抗病毒药物及其应用技术意义重大。
4.枳实(aurantii frutus immaturus)为芸香科植物酸橙(citrus aurantium l.)、栽培变种或甜橙(citrus sinensis osbeck)的干燥幼果。主产于四川、江西、湖南等地，具有破气消积，化痰散痞的功效，黄酮类化合物为其提取物主要成分，主要有调节胃肠道功能、抗氧化和抗肿瘤等功能。目前还没有关于枳实在制备抗猪流行性腹泻病毒药物的研究报道。现有技术中，缺乏高效的抗猪流行性腹泻病毒的药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。
6.本发明的目的采用如下技术方案实现：
7.本发明提供枳实提取物在制备抗猪流行性腹泻病毒的药物中的应用，所述枳实提取物为枳实的黄酮提取物。
8.在本发明中，所述枳实提取物采用如下方法制备：取枳实破碎，采用乙醇水溶液回流提取，除去乙醇，冷冻干燥，得提取物浸膏；将所述提取物浸膏分散于水中，离心，取沉淀冷冻干燥，将上清液采用ab-8大孔吸附树脂柱(购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司)分离，收集35-45％乙醇水溶液的洗脱液，冷冻干燥后与冷冻干燥后的沉淀合并。
9.在本发明中，回流提取中乙醇水溶液的浓度为60-80％，回流提取中的乙醇水溶液加入的量为枳实质量8-12倍，回流次数为两次，每次提取时间为1-2小时。
10.本发明还提供一种抗猪流行性腹泻病毒的药物，包括枳实提取物。
11.在本发明中，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料，制成片剂、喷雾剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液、针剂、混悬剂的任一种剂型。
12.优选的，上述抗猪流行性腹泻病毒药物中，所述枳实提取物的质量百分比含量》90％,其应用剂量为0.2-1mg/ml。
13.有益效果：
14.(1)首次研究发现，枳实提取物具有显著的抗猪流行性腹泻病毒的功效，具体地本发明通过qrt-pcr技术证明了，枳实提取物在细胞实验中展现出显著的抗病毒活性，在1mg/ml的浓度下即可展现出极强的抗猪流行性腹泻病毒(moi＝0.01)感染作用。同时，发现治疗腹泻的药物氧化苦参碱、防风并不具备抗猪流行性腹泻病毒的效果。
15.(2)枳实提取物用于抗猪流行性腹泻病毒安全、毒副作用少；枳实提取物来源于枳实，不同于激素、抗生素、化学合成药物等，对机体无明显毒副作用。
16.(3)枳实提取物用于抗猪流行性腹泻病毒，药物残留低、无污染；枳实提取物属于有机分子化合物，容易被动物机体吸收，生物代谢率高，且排泄无污染。
附图说明
17.图1是枳实提取物对vero ccl-81细胞的影响，横坐标为枳实提取物的浓度，纵坐标为细胞活力(枳实提取物干预后细胞的浓度与阴性对照细胞浓度的比值)。
18.图2是氧化苦参碱(oxymatrine，缩写为om)对vero ccl-81细胞的影响，横坐标为氧化苦参碱的浓度，纵坐标为细胞活力(氧化苦参碱干预后细胞的浓度与阴性对照细胞浓度的比值)。
19.图3是防风提取物对vero ccl-81细胞的影响，横坐标为防风提取物的浓度，纵坐标为细胞活力(防风提取物干预后细胞的浓度与阴性对照细胞浓度的比值)。
20.图4荧光定量检测枳实提取物在vero ccl-81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性，横坐标为枳实提取物的浓度或者阴性对照(control)，纵坐标为pedv的m蛋白的mrna相对水平(枳实提取物干预条件下pedv的m蛋白的mrna水平与阴性对照中pedv的m蛋白的mrna水平的比值)。****表示p《0.0001,差异极显著，***表示p《0.001，差异极显著，ns表示差异不显著,下同。
21.图5western blot测定枳实提取物在vero ccl-81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性。其中，control是阴性对照。1、0.5、0.2mg/ml分别是各泳道上样品对应的枳实提取物干预浓度。
22.图6荧光定量检测氧化苦参碱在vero ccl-81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性，横坐标为氧化苦参碱的浓度或阴性对照(control)，纵坐标为pedv的m蛋白的mrna相对水平(氧化苦参碱干预条件下pedv的m蛋白的mrna水平与阴性对照中pedv的m蛋白的mrna水平的比值)。
23.图7荧光定量检测防风提取物在vero ccl-81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性，横坐标为防风提取物的浓度或阴性对照(control)，纵坐标为pedv的m蛋白的mrna相对水平(防风提取物干预条件下pedv的m蛋白的mrna水平与阴性对照中pedv的m蛋白的mrna水平的比值)。
具体实施方式
24.枳实提取物的制备：取枳实于60℃下烘干，粉碎后过80目筛，取筛下部分，得到枳实粉。在枳实粉中加入溶剂，在80℃回流提取2次。每次回流提取中，加入枳实粉质量10倍的体积百分浓度为70％的乙醇水溶液，每次提取时间为1.5h。合并两次提取液，在0.1mpa、55℃下减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，即得提取物浸膏。在提取物浸膏中加入其质量10倍的水，超声(功率100w，频率40khz)分散30min，3000r/min离心30min，取沉淀冷冻干燥，将上清液以0.5bv/h吸附流速通过ab-8大孔吸附树脂柱(购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司)，以1bv/h洗脱流速，依次用水洗脱5bv、40％(体积百分浓度)的乙醇水溶液洗脱4bv，收集40％乙醇水溶液的洗脱液，在0.1mpa、55℃下减压浓缩以去除乙醇，冷冻干燥，即得40％乙醇洗脱部位。将冷冻干燥后的沉淀与40％乙醇洗脱部位合并，即得枳实黄酮提取物，缩写为枳实提取物。
25.氧化苦参碱(oxymatrine，om)购自陕西昊辰生物科技有限公司。
26.防风提取物(saposhnikovia divaricate)制备：取防风生药饮片，粉碎成细粉后加入蒸馏水，在100℃回流提取三次；每次蒸馏水加入的量为防风细粉体积的8倍，每次提取时间为0.5h。合并三次的提取液，在70℃烘干，粉碎，即得防风提取物。
27.cck-8检测试剂盒(包括cck-8溶液)购自碧云天公司；实时定量pcr(real time pcr)aceq qpcr sybr green master mix试剂盒购自诺唯赞公司；引物订自生工公司。
28.实施例1在vero ccl-81细胞上细胞毒性的测定
29.将枳实提取物采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基配制成1mg/ml、500μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、10μg/ml，得到各浓度的枳实提取物。将氧化苦参碱采用含10％(体积百分浓度)血清的dmem培养基配制成800μm、500μm、400μm、200μm、100μm、50μm、10μm的浓度，得到各浓度的氧化苦参碱。将防风提取物采用含10％(体积百分浓度)血清的dmem培养基配制成100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml，得到各浓度的防风提取物。
30.96孔板中，vero ccl-81细胞采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基培养至细胞汇合度约80％，弃去培养液，每孔中分别加入100μl各浓度的枳实提取物，每个浓度设置3组重复，考察各浓度的枳实提取物对vero ccl-81细胞的影响。在枳实提取物对vero ccl-81细胞干预48h后，每孔加入10μl cck-8溶液，继续培养1h；在多功能酶标仪中波长450nm下，测量各孔的吸光值。阴性对照中以含10％(体积百分浓度)血清的dmem培养基替代枳实提取物，其他不变。
31.另外，按照枳实提取物干预vero ccl-81细胞的方法，考察各浓度氧化苦参碱和防风提取物对vero ccl-81细胞的影响，不同之处仅在于将各浓度枳实提取物分别替换为800μm、500μm、400μm、200μm、100μm、50μm、10μm的氧化苦参碱，100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2μg/ml、1μg/ml的防风提取物。
32.结果如图1-3所示。经不同浓度枳实提取物、氧化苦参碱和防风提取物处理后的细胞与未经处理的细胞(阴性对照)相比，细胞活力并无明显差别，说明该浓度枳实提取物、氧化苦参碱和防风提取物在vero ccl-81细胞上不具有明显细胞毒性。因此，后续抗病毒试验中，枳实提取物选取0.2mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml三个浓度，氧化苦参碱选择800μm、500μm、200μm三个浓度，防风提取物选择100μg/ml、50μg/ml、20μg/ml三个浓度。
33.实施例2荧光定量检测枳实提取物在vero ccl-81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性
34.将枳实提取物采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基配制成1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml三个浓度，用于细胞的预先处理。
35.将枳实提取物采用含2％(体积百分浓度)胎牛血清(fbs)的dmem培养基配制成1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml三个浓度，作为细胞的维持液。
36.病毒感染液：含有3μg/ml胰酶、3g/l的tpb、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的dmem。其中，tpb为胰蛋白示磷酸盐肉汤(tryptose phosphate broth，tpb)，购自sigma公司。
37.含有各浓度枳实提取物的病毒感染液:将枳实提取物溶解在病毒感染液后所得。
38.24孔板中，采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基培养vero ccl-81细胞至细胞汇合度约80％，弃去培养基，pbs洗3次。采用1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml的枳实提取物(溶剂为含10％胎牛血清的dmem培养基)、含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基(阴性对照)分别于37℃预先处理vero细胞1h，弃掉原培养基，pbs洗2次，换上含有各浓度枳实提取物的病毒感染液(各孔中枳实提取物的浓度与预先处理时一致)或病毒感染液(阴性对照)，然后按照感染复数moi＝0.01接猪流行性腹泻病毒cv777毒株，置于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，用pbs洗三遍，分别加入含有各浓度枳实提取物的细胞的维持液(各孔中枳实提取物浓度与预先处理时一致)或含2％胎牛血清(fbs)的dmem培养基(阴性对照)，置于37℃、5％co2培养箱中培养12h后，收集细胞样品，用trizol提取rna，采用实时荧光定量pcr检测pedv的m蛋白在mrna水平上的变化。
39.本实验通过2-δδct
法进行pedv的m基因的相对定量，结果如图4所示，当枳实提取物浓度为0.2mg/ml及以上时，对moi＝0.01的pedv均具有强烈的抑制作用，且该抑制作用呈现剂量依赖性。当枳实提取物浓度为1mg/ml时，pedv几乎完全被抑制(抑制率达到99％)，说明枳实提取物具有显著的抗猪流行性腹泻病毒的作用。
40.实施例3western blot测定枳实提取物在vero ccl-81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性
41.将枳实提取物采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基配制成1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml三个浓度，用于细胞的预先处理。
42.将枳实提取物采用含2％胎牛血清(fbs)的dmem培养基配制成1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml三个浓度，作为细胞的维持液。
43.病毒感染液：含有3μg/ml胰酶、3g/l的tpb、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的dmem。其中，tpb为胰蛋白示磷酸盐肉汤(tryptose phosphate broth，tpb)，购自sigma公司。
44.含有各浓度枳实提取物的病毒感染液:将枳实提取物溶解在病毒感染液后所得。
45.6孔板中，采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基培养vero ccl-81细胞至细胞汇合度约80％，弃去培养基，pbs洗3次。采用1mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml的枳实提取物(溶剂为含10％胎牛血清的dmem培养基)、含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基(阴性对照)分别于37℃预先处理vero细胞1h，弃掉原培养基，pbs洗2次，换上含有各浓度枳实提取物的病毒感染液(各孔中枳实提取物的浓度与预先处理时的浓度一致)或病毒感
染液(阴性对照)，然后按照感染复数moi＝0.01接猪流行性腹泻病毒cv777毒株，置于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，用pbs洗三遍，分别加入含有各浓度枳实提取物的细胞的维持液(各孔中枳实提取物浓度与预先处理时一致)或含2％胎牛血清(fbs)的dmem培养基(阴性对照)，置于37℃、5％co2培养箱中培养11h后，用ripa裂解液(购自康为世纪)收取细胞样品，沸水煮10min后，以β-actin蛋白为内参进行western blot检测，考察枳实植物提取物对猪流行性腹泻病毒n蛋白表达情况的影响。
46.结果如附图5所示，不同浓度的枳实植物提取物能够显著抑制猪流行性腹泻病毒的感染，并具有明显的剂量依赖性。
47.实施例4荧光定量检测氧化苦参碱、防风提取物在vero ccl-81细胞上抑制猪流行性腹泻病毒感染的活性
48.将氧化苦参碱采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基配制成800μm、500μm、200μm三个浓度，将防风提取物采用含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基配制成100、50、20μg/ml三个浓度，用于细胞的预先处理。
49.将氧化苦参碱采用含2％胎牛血清(fbs)的dmem培养基配制成800μm、500μm、200μm三个浓度，将防风提取物采用含2％胎牛血清(fbs)的dmem培养基配制成100、50、20μg/ml三个浓度，用于细胞的维持液。
50.病毒感染液：含有3μg/ml胰酶、3g/l的tpb、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素的dmem。其中，tpb为胰蛋白示磷酸盐肉汤(tryptose phosphate broth，tpb)，购自sigma公司。
51.含有各浓度氧化苦参碱或防风提取物的病毒感染液:将氧化苦参碱或防风提取物溶解在病毒感染液后所得。
52.24孔板中，采用含10％胎牛血清的dmem培养基培养vero ccl-81细胞至细胞汇合度约80％，弃去培养基，pbs洗3次。用浓度为800μm、500μm、200μm的氧化苦参碱，浓度为100、50、20μg/ml的防风提取物(溶剂为含10％胎牛血清的dmem培养基)和含10％(体积百分浓度)胎牛血清的dmem培养基(阴性对照)分别在37℃预先处理vero细胞1h，弃掉原培养基，pbs洗2次，换上含有各浓度氧化苦参碱或防风提取物的病毒感染液(各孔中氧化苦参碱或防风提取物的浓度与预先处理时一致)或病毒感染液(阴性对照)，然后接猪流行性腹泻病毒cv777毒株(moi＝0.01)感染，置于37℃、5％co2培养箱中孵育1h，用pbs洗三遍，加入0.5ml含有不同浓度氧化苦参碱或防风提取物的维持液(各孔中氧化苦参碱或防风提取物浓度与预先处理时一致)或含2％胎牛血清(fbs)的dmem培养基(阴性对照)，置于37℃、5％co2培养箱中培养12h后，收集细胞样品，用trizol提取rna，采用实时荧光定量pcr检测pedv的m蛋白在mrna水平上的变化。
53.本实验通过2-δδct
法进行pedv的m基因的相对定量，结果如图6和图7所示，当氧化苦参碱浓度在800μm、500μm、200μm，防风提取物浓度在100、50、20μg/ml时，对moi＝0.01的pedv均不具有抑制作用，说明氧化苦参碱和防风提取物无抗猪流行性腹泻病毒作用。