一种具有骨细胞脱落功能的PNIPAAm-g-PDA修饰PCL骨支架及其制备方法与流程

一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架及其制备方法
技术领域
1.本发明属于骨组织修复再生医学领域，具体涉及一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架及其制备方法。


背景技术：

2.临床上，细胞增殖、吸附、剥离和批量生产已经成为再生医学领域中的科学难题，骨组织修复已成为临床治疗骨疾病的常用方法，细胞的批量生产已经成为限制骨组织修复的主要瓶颈。目前3d打印支架包括pcl、pla、hap和金属支架等复合支架，三维打印支架在体外提供了一种人工骨组织的构建方法，细胞培养已经与先进打印支架的界面特性密切相关。理想的组织工程支架应具有良好的生物相容性和均匀稳定的降解速度，能够刺激成骨细胞或干细胞的分化，并维持和促进成骨细胞的增殖，从而修复骨组织缺损。支架还可以帮助促进人间充质干细胞(hmscs)等的增殖和扩增，但是通过易操作的方法定期收获细胞仍存在巨大的挑战。
3.导致骨组织修复问题的因素有，例如年龄因素，感染与异物，局部血液循环等，这些因素能破坏细胞、损伤血管、抑制组织再生，并抑制骨细胞形成。打印支架上的细胞培养技术有着广泛的应用，包括组织再生、肿瘤研究、糖尿病伤口愈合和药物发现等，在3d支架上生长的细胞状态接近于自然生长状态。细胞可以在3d打印支架基质中自然生长和增殖，比传统的2d细胞培养更能调节生物学功能，同时支架与细胞之间的相互作用也引起了组织工程领域的广泛关注。3d打印支架与其他方法相比，具有优良的生物相容性、打印柔韧性、较好的机械强度和较高的比表面积等优点。因此，3d打印支架解决细胞再生及骨缺损修复难题成为国内外研究的热点。


技术实现要素：

4.近年来，一种新型的pcl支架已经成为很有前途的细胞再生材料。熔融静电纺丝法(mew)是目前最常用的3d打印支架方法之一，热熔融溶液连续书写成固体纤维材料时，聚合物暴露在静电场中，并可以促进支架几何结构和组成的设计，并将高粘度、低电导率的pcl溶液从打印仪器中挤出成泰勒锥流。pcl格子在其他细胞领域也同样得到了广泛的应用，比如干细胞和t细胞治疗等，使用熔融电纺写入装置作为pcl热熔融流体激活和扩展平台。pcl支架涂层包括复合纳米涂层、生物分子功能化因子、药物和维生素等，这些涂层已经成为较具前景的涂层。热敏性材料涂层的有效包覆能够促进细胞的快速分离，并解决细胞从支架表面剥落再生的问题。
5.da具有良好的粘附性、亲水性以及可后续功能化等，所以da成为了细胞增殖吸附包被的首选物质之一；pnipaam含有酰胺基、易形成氢键、使其具有良好的水溶性和很高的温敏活性，它易于通过接枝得到支链或网状结构的多种修饰物。为实现在3d支架上种植细胞和收获细胞单层提供了一种新的途径，细胞脱落效果将得到明显提升，细胞再生的批量
生产对临床骨组织修复具有更加现实的意义，同时也为再生医学领域中研究组织再生提供了思路。
6.本发明的第一个目的在于公开了一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架。
7.本发明的第二个目的在于公开了上述具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的制备方法。
8.本发明采用熔融静电纺丝法(mew)制备pcl骨支架，以pcl为骨支架材料，对pnipaam-g-pda进行表面修饰，为细胞大规模生产提供了新的途径。本发明通过自由自由基聚合反应在pda表面包覆pnipaam膜，pnipaam-g-pda在相转变温度下，促使细胞脱离pcl骨支架，因此，温度响应表面有效解决了细胞培养的批量生产目的和有限的收获细胞问题。将骨细胞培养在pnipaam-g-pda表面包被的pcl支架上，通过改变温度，将可收获细胞分离。一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的制备方法包括：扫描电子显微镜观察、x射线光电子能谱分析、核磁共振波谱分析、水接触角测量和细胞剥落观察等手段。当温度改变时，骨细胞在一定时间内脱离包被热敏聚合物界面的pcl支架。将收获的骨细胞重新种植在改良的pcl支架表面可进一步增殖，以备收集。
9.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
10.一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的制备方法，包括下述步骤：
11.(1)、采用熔融静电纺丝法制备pcl骨支架；
12.(2)、将温敏型材料pnipaam和pda合成新的聚合物pnipaam-g-pda溶液，具体过程为：首先，取0.02-0.08g da和0.02-0.08g ita溶于10-20ml去离子水中，搅拌离散使da完全溶解，加入tris碱调节多巴胺溶液ph值至7.0-9.5，形成黑色烯丙基功能化pda；其次，按0.5：1～5：1的物质质量比将促进细胞吸附增殖的烯丙基功能化pda加入到物质的量浓度为0.25-1.0m pnipaam溶液中，并搅拌加入0.15-0.6g aps和5-20μl temed，并伴随持续搅拌，于常温下振荡器中匀速孵育12～48h；按照上述过程和条件进行聚合物溶液的合成得到聚合物pnipaam-g-pda溶液；
13.(3)、将步骤(1)中得到的pcl骨支架进行涂层，得到具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架，具体过程为：将步骤(1)制备的pcl骨支架放入步骤(2)的聚合物pnipaam-g-pda溶液内采用搅拌混匀法制备具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架。
14.上述技术方案所述的制备方法，其中，所述步骤(1)的具体操作过程为：在热熔静电纺丝仪软件中，利用mach3运动控制模块编辑g-code，并制备pcl支架：3d pcl支架被有序组织在一个x-y-z三轴移动平台上，经热熔融挤出沉积在收集器板上；将pcl丸状颗粒装入不锈钢注射器中，并将黄铜喷嘴加热至60-85℃，0.5-1h，使熔融pcl均匀流动，pcl流从直径为0.1-0.5mm的喷嘴中挤出，制备pcl骨支架；所述打印参数为：喷丝头直径为0.1-0.5mm，集电极距离为5-30mm，高压为4.0-18.0kv，集电极移动速度为2-10m/min，进料气压为0.3-1.8bar，加热温度为60-85℃，热熔注射器物料筒最大熔体容量为10ml。
15.上述技术方案所述的制备方法，其中，所述步骤(1)的pcl采用分子量为30000-80000。
16.上述技术方案所述的制备方法，其中，所述步骤(2)的pda采用分子量为10000-90000，pnipaam的分子量为10000-80000。
17.上述技术方案所述的制备方法，其中，所述步骤(2)搅拌是在20-40℃持续搅拌1-5h，并于常温下振荡器中匀速孵育12～48h，使得聚合物pnipaam-g-pda的合成得到充分的反应。
18.上述技术方案所述的制备方法，其中，所述步骤(3)的搅拌温度为20-55℃，搅拌时间为12～96h。
19.上述技术方案所述制备方法制备所得的具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架。
20.本发明一种pcl骨支架修饰pnipaam-g-pda表面具有足够温敏智能调控功能用以维持细胞稳定脱落，又能够通过其内部包覆的pda薄膜的促进细胞吸附，诱导骨细胞长入pcl支架材料内部，形成良好骨细胞增殖和收获的具有温敏智能调控功能的多孔pcl骨支架及其制备方法。
21.本发明所提供的一种3d打印pcl骨组织工程支架是以pcl材料为原料，通过mew3d打印技术制造具有规则、多孔、孔隙贯通、有边框pcl骨组织工程支架，同时为骨细胞的爬行植入，提供了一种类似自然骨的pcl人工骨支架的空间环境。
22.本发明的pcl支架纤维直径具有大小可调，形貌可控的特点，制备方法设备简单，操作方便，且能够实现批量生产。
23.本发明提供一种温度变化对支架涂层界面的润湿性的影响，随着温度的升高，在pcl骨支架表面修饰pnipaam-g-pda界面接触角逐渐增大，支架覆盖表面表现出疏水性能的变化趋势。对于pnipaam-g-pda涂层，该界面在相转换温度下仍具有一定的润湿性。烯丙基pda促进了pnipaam亲水界面的形成。未经过等离子体处理的支架的拓扑结构并没有改善涂层的颜色和均匀性。支架涂层覆盖前应经等离子体处理后，此时裸露的pcl支架接触角具有较好的润湿性能，同时涂层后的裸露支架表面也表现为亲水性能。
24.所述的pcl骨支架在3d打印中可选用的分子量为30000-80000的pcl颗粒物料。
25.所述的pcl骨支架，其纤维直径、孔的形状、孔径、孔隙率可以根据打印时不同参数以及编码的支架组织结构程序进行设计和在热熔融条件下3d打印形成。
26.本发明提供的3d打印pcl骨支架以及具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的制备方法包括如下步骤：
27.(1)设计形状规整的长方体样件，将其编程的样件规格大小参数文件导入运动控制软件，并设置3d pcl支架打印路径参数；选择适合打印支架的分子量大小的pcl颗粒材料，通过热熔融沉积方式，选择合适的3d打印参数，打印多孔有序纤维且具有一定边框结构的长方体样件，测量样件的实际纤维直径和孔径大小。
28.(2)mew为熔融聚合物流体提供了一种可以规则沉积的电场环境，pcl流体在电场的牵引下形成较细的微纳米级纤维，pcl支架孔径可以满足细胞外基质的空间尺寸要求。pcl颗粒被装入不锈钢料筒中，本发明在不锈钢料筒中将串珠状或片状的pcl加热到(或以上)超过其熔化温度，并通过位于高压电场中心的黄铜静电纺丝喷嘴挤出。一个不锈钢喷嘴被连接到pcl装料筒上，用作熔体静电纺丝的通道，融化了的pcl熔融体从喷嘴中挤压出泰勒流锥体，打印驱动系统在相应高压驱动下控制打印程序的进行。融化电纺的pcl支架的轨
迹是经过泰勒锥以相应角度互层沉积转换优化沉积形成的。
29.(3)将步骤(2)中调整打印支架形状及其大小，选择合适打印的参数和支架规格，选择最优的支架后，对其形貌进行观察，对整个支架的纤维直径进行测定选取长方形的、纤维有序且直径均匀稳定的、结构平整的支架，以满足支架涂层的均一性需求。按照步骤(2)中的3d打印pcl骨支架打印参数条件，以保证编程的选定打印区域的路径与实际支架打印时的打印路径相符，按照上述条件进行3d打印。
30.(4)将步骤(3)中3d打印选择的4个打印参数分别进行调整，并对其纤维直径的影响进行对比，选择合适最优的打印参数。
31.(5))将步骤(4)中3d打印的支架放入预先合成好的聚合物pnipaam-g-pda溶液中，持续搅拌，使其充分混匀，形成稳定的涂层薄膜，对涂层薄膜进行形貌分析和鉴定。选择合适的涂层浓度和涂层时间，选择最优的涂层条件。
32.(6)将步骤(5)中经修饰pnipaam-g-pda的3d打印pcl骨支架进行干燥处理，以及等离子体和杀菌处理后，在pcl骨支架表面种植骨细胞，孵育培养，通过改变温度，使骨细胞从修饰的支架表面上定期剥落，并对剥落到培养液中的细胞数目进行计数和观察。
33.本发明具有以下有益效果：
34.1、本发明3d打印的pcl骨支架所选用的材料为分子量适合3d打印pcl颗粒材料打印而成，支架具有较好的生物降解性和相容性。
35.2、本发明3d打印的pcl骨支架不仅具有规则的纤维形貌，而且具有符合细胞生长的纤维直径尺寸，该纤维规格不仅降解均匀且持久，而且为细胞爬行植入提供适宜的空间环境，同时为多孔有边框且孔隙贯通的三维结构。
36.3、本发明所述的pnipaam-g-pda修饰涂层，在相转变温度以上时，该涂层处于折叠的疏水界面状态，当温度下降到相转变温度时，界面即可处于未折叠的亲水舒展状态，可以快速实现涂层亲疏水性能的自由转换。
37.4、本发明所述的3d打印的pcl骨支架上修饰pnipaam-g-pda涂层，pnipaam-g-pda界面具有较好的润湿性，界面表层上较小的接触角，为骨细胞的吸附增殖和剥落提供了环境。
38.5、本发明的3d打印的pcl骨支架表面的修饰，是在调整pnipaam-g-pda薄膜的涂层浓度和时间后而形成的最优涂层，通过改变温度，可以保证细胞吸附增殖速度最快，细胞脱落程度最大，提升细胞收获的效率，节省细胞再生成本。
39.6、本发明的一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架，是选择相转变温度、细胞剥落温度和时间时而获得最大收获细胞效率时而形成的，可以保证收获细胞的质量和数量，使细胞在支架上均匀稳定生长。
40.7、本发明所述的3d打印的pcl骨支架，是选择了4种不同的打印参数条件，分析了打印条件对支架纤维直径的影响，选出最优的打印参数，保证了所选参数与实际打印支架时的打印规格相一致，可以更为真实的反应3d打印的pcl骨支架纤维的有序排列和形貌。
41.8、本发明所述的3d打印的pcl骨支架打印参数优化之后，纤维直径在合适的尺寸时，细胞生长率有明显的提升。
42.9、本发明所述的3d打印的pcl骨支架，具有多孔的精细纤维结构，其纤维结构为长方体，具有较大的比表面积，长度边框和宽度边框尺寸相同，支架高度较小，符合骨组织工
程支架的空间要求，可根据骨组织结构特点而调整支架的高度，满足骨组织修复工程支架个性化需求。
43.10、本发明所述的3d打印的pcl骨支架，为多孔有边框且孔隙贯通的三维结构，孔径的规格可根据材料及其打印程序进行调整和设计，可以为骨细胞的粘附、增殖、脱落提供良好的空间，同时为营养运输和代谢物排出提供通道。
附图说明：
44.1、图1为扫描电子显微镜观察裸露pcl骨支架的界面形貌。
45.2、图2为扫描电子显微镜观察经过修饰的pcl骨支架界面形貌。
46.3、图3为经过修饰的pcl骨支架的x射线光电子能谱图。
47.4、图4为经过修饰的pcl骨支架的核磁共振波谱图。
48.5、图5为经过修饰的pcl骨支架在不同温度下的水接触角图。
49.6、图6为裸露pcl骨支架和经过修饰的pcl骨支架的骨细胞剥落观察结果。
具体实施方式：
50.为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施例对一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架及其制备方法作进一步的说明。
51.本发明结合附图对支架制备方法作进一步详细说明。但是本发明不仅限于此。
52.实施例1:pcl骨支架的制备：
53.1.采用g-code编码程序设计出24mm
×
24mm
×
1mm的长方体模型，选择纯的pcl颗粒为原材料，通过热熔融挤出沉积方法打印pcl骨支架，通过台式3d打印机在60-85℃，打印速度2-10m/min，打印高度为5-30mm，应用高压为4.0-18.0kv，进料气压为0.3-1.8bar条件下打印，制造出多孔有边框结构的长方体支架。将打印好的3d pcl骨支架(又称：裸露pcl骨支架)放置于导电胶上，在样品上层喷一层金以便导电，喷金30min后，扫描电子显微镜观察。
54.结果如图1所示，裸露pcl骨支架形貌含有均匀的纤维，纤维规则排列交错，纤维上面有均匀排列的天然空洞，空洞为无规则形状。该骨支架具有纤维直径适宜，支架架构规则，支架表面充满空洞结构，适宜pnipaam-g-pda薄膜的附着和细胞的进一步在涂层界面上的黏附。
55.2.使用预先编写的g-code脚本或输入g-code命令来定位坐标轴，并进入软件的mdi命令行。g-code脚本可以在任何文本编辑器中编写，但必须保存为.txt文件，输出为3d打印stl格式的文件，将预先编写好的g-code脚本加载并运行到软件中。根据步骤1)中在软件中获得的x、y和z三轴上的位置结果进行调整，对骨支架数字模型接受板进行适当调整后，按上述打印参数进行多孔有边框结构的pcl骨支架的3d打印。
56.3.在台式3d打印机上分别设置4个不同参数的3个梯度进行支架结构的优化，按上述4个打印参数进行优化，通过改变其中一个参数，保持其他参数不变，对3d打印支架进行结构的优化，并对生成出的各个纤维直径的支架进行细胞增殖测试，在20-45℃温度下，对培养液中活/死的细胞悬浮液进行染色，采用血球计数板进行计数，制造出适合细胞快速增殖的较细且规则的支架纤维。
57.通过改变打印速度(收集板移动速度)2-10m/min，打印高度(喷嘴与收集板之间的
距离)为5-30mm，应用高压为4.0-18.0kv，进料气压(压力)为0.3-1.8bar条件下打印，采用扫描电子显微镜观察支架纤维的平均直径，并分别在这些支架上种植gfp-成纤维细胞，并加入dmem细胞培养液(含有1-20％fbs,1-20％sf)，使其总体积达到200-400μl，并将其培养板放入含有5％co2培养箱中37℃孵育，在培养0-10d后，1-2d换一次细胞液，在培养1d后，采用血球计数板对放有不同纤维直径支架的细胞悬浮液进行计数，统计拥有不同纤维直径范围内支架的细胞增殖提升率。
58.表1 3d打印的pcl骨支架打印参数优化后的细胞增殖提升率
[0059][0060][0061]
结果如表1所示，3d打印pcl骨支架的打印参数对支架纤维的平均直径具有较大影响，细胞增殖提升率随着纤维直径的降低而提升，说明支架的纤维直径对细胞的增殖具有较大的影响，支架纤维越细，细胞越易吸附在纤维支架的表面。
[0062]
实施例2：具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的制备:
[0063]
1.将温敏型材料pnipaam和pda合成新的聚合物pnipaam-g-pda薄膜：
[0064]
首先，取0.02-0.08g da和0.02-0.08g ita溶于10-20ml去离子水中，搅拌离散使da完全溶解，加入tris碱调节多巴胺溶液ph值至7.0-9.5，形成黑色烯丙基功能化pda；其次，按0.5：1～5：1的物质质量比将促进细胞吸附增殖的烯丙基功能化pda加入到物质的量浓度为0.25-1.0m pnipaam溶液中，并搅拌加入0.15-0.6g aps和5-20μl temed，并伴随持续搅拌，于常温下振荡器中匀速孵育12～48h，合成得到浓度为0.5-0.75的聚合物pnipaam-g-pda溶液。
[0065]
2.将实施例1步骤1中3d打印得到的pcl骨支架进行涂层：将pcl骨支架放入实施例2步骤1的pnipaam-g-pda溶液内采用搅拌混匀法制备具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架，搅拌温度为20-55℃，搅拌时间为12～96h，冻干，收集经过修饰pnipaam-g-pda涂层界面的pcl骨支架，即得具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰的多孔pcl骨支架(又称：经过修饰的pcl骨支架)。
[0066]
3.将上述制备好的经过修饰的pcl骨支架的形貌用扫描电子显微镜进行分析：
[0067]
首先，对经过修饰的pcl骨支架样品进行切割，样品面积为8mm
×
8mm，在切割时不要损伤样品，采用冷冻割断法，以保护支架内部结构；
[0068]
然后，把经过修饰的pcl骨支架放置于黑色导电胶上，在样品上进行喷金处理，喷30min后，放入扫描电子显微镜设备中进行形貌扫描。
[0069]
结果如图2所示，经过修饰的pcl骨支架形貌均匀，涂层较薄，涂层能够进入到支架纤维的空洞内部，支架纤维表面也含有一层较为均匀的薄膜涂层。
[0070]
实施例3:具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的x射线光电子能谱(又称：xps)分析：
[0071]
1.将实施例2中步骤2中制备好的经过修饰的pcl骨支架进行x射线光电子能谱分析，对支架修饰表面成分进行分析。样品在测试前应经过真空冷冻干燥处理12～96h，冷冻
温度为-20
‑‑
55℃，该方法是利用一束x射线照射经过pnipaam-g-pda界面修饰的pcl骨支架固体表面，并测量从材料表面1-10nm发射的电子动能来获取pnipaam-g-pda界面成分的xps谱图。本发明通过x射线光电子能谱对一定动能范围中出射的电子进行计数，通过光电子峰的能量和强度实现对修饰的pcl骨支架样品表面元素的鉴定，并记录光电子谱图，并采用origin 8.6软件进行作图分析。
[0072]
具体步骤为：将制备得到的经过修饰的pcl骨支架进行干燥处理12-96h，支架的长宽高应保持在10
×
10
×
5mm3大小范围内，采用x射线光电子能谱仪分析支架表面涂层的成键能量，并采用origin 8.6软件分析c1s，n 1s，o 1s能谱。
[0073]
结果如图3所示，其中图a为c1s能谱，说明了o＝c-o，c-o，c-c键的合成，pnipaam和pda碳链的结合；图b为n1s能谱，说明了c-n，o＝c-n-c键的合成；图c是指o1s能谱，说明了o＝c-o，c-o键的形成。x射线光电子能谱结果说明了pnipaam和pda成功接枝，并形成pnipaam-g-pda。
[0074]
实施例4：具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的核磁共振波谱分析：
[0075]
将上述实施例2步骤2中制备好的pnipaam-g-pda聚合物溶液，进行冻干，溶解0-12h，搅拌0-24h，添加氘代试剂，并利用核磁共振方法去解析pnipaam-g-pda聚合物分子结构及成分分析。将pnipaam-g-pda冻干粉溶解在碱性溶液20-100μl 2-10％(w/w)naoh(0.01-0.9n,ph》8)中，并加入dmso-d6溶液，配置成400-700μl的聚合物溶液，样品放置在核磁管中，并采用400-600mhz布鲁克nmr光谱仪进行测定，获得2d核磁谱图。
[0076]
具体步骤为：将经过修饰的pcl骨支架进行干燥处理12-96h，从支架涂层上取少量的涂层薄膜，溶解在naoh(0.01-0.9n,ph》8)中，加入氘代试剂，采用布鲁克nmr光谱仪进行谱图分析，将获得的2d谱图在nmr软件中打开，重新作图。
[0077]
结果如图4所示，峰值在1ppm处是由于甲基上的质子的形成。对于pnipaam-g-pda界面光谱，苯环和吡咯环上质子的化学位移分别在6.2,5.5,3.5～3.9ppm处出现峰值。
[0078]
实施例5：具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的水接触角测量：
[0079]
将实施例2步骤2中制备得到的经过修饰的pcl骨支架进行润湿性测试，通过温度的变化对经过修饰的pcl骨支架的润湿性进行分析。温度的调整是根据热敏性材料pnipaam的相变转换温度进行选择的，在两个不同的温度下，对支架进行水接触角度的测量，由于上述涂层是均匀涂覆的，所以接触角测量的位置选择可以是骨支架上的任意位置，pnipaam-g-pda界面的接触角随着温度的变大，接触角逐渐变大，能更好的满足组织工程骨支架作为一种理想支架的骨细胞吸附脱落的要求。
[0080]
具体的操作步骤为：将经过修饰的pcl骨支架进行干燥处理12-96h，将涂覆的支架置于可调节温度的台面上，在支架上方均匀地滴加水滴，使水滴缓慢的接触到界面上，从20-40℃中选择两个润湿温度进行接触角测试，待水滴在涂层界面上稳定之后，拍照，并通过fiji软件进行接触角分析。
[0081]
结果如图5所示，图a为20-30℃温度下的水接触角，b图为30-40℃温度下的水接触角；在30-40℃下，经过修饰的pcl骨支架的水接触角大于20-30℃下经过修饰的pcl骨支架的水接触角，在30-40℃下经过修饰的pcl骨支架能更好的满足组织工程骨支架作为一种理想支架的骨细胞吸附脱落的要求。
[0082]
实施例6：具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的细胞剥落观察：
[0083]
将实施例2步骤2中制备好的经过修饰的pcl骨支架，进行等离子体和灭菌处理。将灭菌过的骨支架放入pbs中进行润湿5-30min，然后转移到细胞培养液中润湿5-30min，同时，96孔板预先经过琼脂润湿和铺平，自然干燥后，把润湿过的骨支架放入琼脂处理过的96孔板中，在支架上种植gfp-成纤维细胞，并加入dmem细胞培养液(含有1-20％fbs,1-20％sf)，使其总体积达到200-400μl，并将其培养板放入含有5％co2培养箱中37℃孵育，在培养0-10d后，1-2d换一次细胞液，通过改变热缩型材料pnipaam-g-pda的相转变温度。细胞在一定时间内从骨支架上剥离，进入细胞培养液中，并对细胞培养液中细胞剥离情况进行观察，细胞从修饰好的支架上实现快速的剥落，新收获的细胞将用于进一步的细胞再生。
[0084]
具体步骤为：将经过修饰的pcl骨支架进行干燥处理12-96h，灭菌，在37℃下培养，培养0-10d后，对活/死细胞进行蓝色染液染色，在血球计数板上分别对从裸露pcl骨支架以及经过修饰的pcl骨支架上剥离至细胞液中的细胞进行计数，采用相机分别从0-360min剥落时间中选择四个时间点进行拍照。
[0085]
结果如图6所示，a-d图为裸露pcl骨支架在四个不同时间点的剥离情况，e-h为经过修饰的pcl骨支架的剥离情况，两种支架的剥离时间分别为0-90、90-180、180-270、270-360min。通过两个图的对比，说明了经过pnipaam-g-pda修饰的pcl骨支架具有较好的剥离效果，在0-90、90-180min内，细胞可以实现快速剥离，随着剥离时间的延长而逐渐剥离完毕。
[0086]
实施例7:具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的涂层优化分析：
[0087]
1.将实施例2中步骤2中制备好的修饰pcl骨支架进行涂层优化分析。分别进行涂层浓度与时间的优化试验，通过调节0.02-0.08g da和0.02-0.08g ita在水中的质量，搅拌12～96h促使其溶解，随后，把pda溶液加入到0.25-1.0m pnipaam溶液中，并搅拌加入0.15-0.6g aps和5-20μl temed，并伴随持续搅拌，于常温下振荡器中匀速孵育12～48h，按照上述过程和条件进行聚合物溶液的合成得到聚合物pnipaam-g-pda溶液；涂层浓度优化试验：从上述合成的0.25-1.0m pnipaam-g-pda溶液中选择3个浓度，保持相同的涂层时间0～96h，进行细胞增殖测试；涂层时间优化试验：按上述最优的涂层浓度，从涂层时间为0～96h中，选择3个涂层时间，进行细胞增殖测试，选择出优化后的细胞吸附增殖的速度最快的涂层参数，涂层参数优化后，细胞脱落程度达到最大，提升细胞收获的效率，节省细胞再生成本，对细胞增殖及释放数据进行对比分析。
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通过改变涂层浓度和涂层时间，当改变其中一个参数时，保持其他涂层参数相同，对细胞进行蓝色染液染色，利用血球计数板对培养0-10d后的细胞的增殖进行统计，对剥落到细胞液中的细胞进行脱落速率提升进行统计。
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表2 pnipaam-g-pda涂层浓度和涂层时间优化前后细胞增殖提升速率及细胞剥落提升速率对比
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结果如表2所示，随着涂层浓度的增加，细胞增殖提升率和细胞脱落提升率呈现先增加后减小的趋势，涂层浓度的增加不一定促进细胞增殖和细胞脱落，当涂层时间达到32-64h时，支架涂层表面达到饱和，涂层的细胞吸附就会达到饱和，所以有效的涂层浓度和时间对于细胞的增殖和脱落有着十分重要的作用。当涂层浓度为0.5-0.75m，涂层时间为32-64h，细胞吸附增殖提升速率60.2％，细胞脱落提升速率达到了58.6％，说明该条件下浓度和时间促进了细胞增殖和脱落。
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本发明提供了一种具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的制备方法，提出温敏智能调控热缩型材料相转变，pnipaam-g-pda界面由疏水变为亲水界面，促进骨细胞定期从骨支架上脱落的系统。温度易于调控，操作过程简单，能更好的满足骨细胞批量生产的要求。
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本发明以上述的几项实施例为启示，根据上述的说明内容，相关工作人员可在不偏离，本发明技术思想范围内，进行多样变更及修改。本发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。实施例3为具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架的表征及其细胞剥离，采用细胞剥落观察方法实施；实施例2为pnipaam-g-pda涂层合成的过程方法，根据以前文献报道进行合成；本实施例针对实施例1制备的具有骨细胞脱落功能的pnipaam-g-pda修饰pcl骨支架。本发明对熔融静电纺丝法制备用于生物医学应用的3d打印支架及其涂层进行扫描式电子显微镜、x射线光电子能谱、核磁共振、水接触角、细胞脱落观察等方法分析其涂层形貌、亲疏水特征及其细胞剥离成功与否。
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以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。