GGC在制备用于预防和/或治疗类风湿性关节炎药物中的应用

ggc在制备用于预防和/或治疗类风湿性关节炎药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，主要涉及一种ggc在制备用于预防和/或治疗类风湿性关节炎药物中的应用。


背景技术：

2.类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是一种累及周围关节为主的多系统性炎症性自身免疫性疾病，病因未明。类风湿性关节炎是临床上最常见的炎症性关节疾病，严重影响患者的功能状况、生活质量与预期寿命，因其慢性特点、相关并发症和长期功能障碍，对社会和经济造成巨大的影响。目前对类风湿性关节炎的治疗以药物治疗为主(常用药为非甾体抗炎药，新上市生物制剂如tnf-a抑制剂)，但毒副作用明显，因此亟待研发新型抗类风湿性关节炎药物。
3.γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-glutamylcysteine，ggc)是谷胱甘肽(gsh)生物合成的直接前体和限制底物，为去甘氨酸-谷胱甘肽的还原形式。由于ggc可以被多种细胞直接吸收，可有效解除gsh生物合成过程的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gshⅰ)的底物抑制，提高谷胱甘肽合成酶(gshⅱ)催化反应的底物浓度，因此与直接供给谷胱甘肽和半胱氨酸相比可以更有效的提高细胞内的谷胱甘肽浓度。近年来ggc的生产方式主要为酵母菌发酵法、化学合成法和cct催化合成法3种。目前，ggc在医药、食品和饲料添加剂以及化妆品等行业具有重要的应用前景。ggc的纯品为黄色/白色粉末，极易吸水，在水中溶解度能达到70％w/v，1g粉末溶于10ml水中得到ph为3的溶液，在ph 3-8的溶液中性状稳定，分子量为250.27，化学结构式如式ⅰ所示：
[0004][0005]
ggc作为一种已知单体化合物，尽管有确切的分子式和结构式，但其研究的活跃性不高，目前关于ggc的药理作用报道非常少，其药理学研究报道主要为抗氧化、增加gsh水平、治疗结肠炎以及改善阿尔茨海默病等方面。至今，ggc作为单体在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用还未见研究报道，本发明由此而来。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的在于发明一种新的用于制备治疗类风湿性关节炎药物的化合物。
[0007]
具体的，本发明的技术方案如下：
[0008]
本发明第一个方面公开了ggc或其几何异构体、药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、
水合物在制备用于预防和/或治疗ra药物中的用途，所述ggc的结构式如式ⅰ所示：
[0009][0010]
本发明第二个方面公开了一种药物组合物，所述药物组合物包括ggc或其几何异构体、药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物。
[0011]
优选的，所述药物组合物活性成分包括ggc或其几何异构体、药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物。
[0012]
更优选的，所述药物组合物中的唯一活性成分为ggc或其几何异构体、药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、水合物。
[0013]
优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的一种或多种惰性的、无毒的赋形剂。
[0014]
更优选的，所述赋形剂为载体、溶剂、乳化剂、分散剂、湿润剂、粘合剂、稳定剂、着色剂或香料。
[0015]
优选的，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂、软膏剂或针剂。
[0016]
优选的，所述药物组合物的制备方法包括：在ggc中添加药用辅助成分制成片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂、软膏剂或针剂。
[0017]
更优选的，所述药物组合物中ggc的质量分数至少为95％；所述药用辅助成分为赋形剂。
[0018]
本发明第三个方面公开了上述的药物组合物在用于预防和/或治疗ra药物中的用途。
[0019]
在本发明的一些优选实施例中，所述治疗类风湿性关节炎药物组合物可通过纯度95％(质量百分数)以上的ggc添加通用的药用辅助成分，制成片剂、胶囊剂、冲剂、滴剂、冻干物、颗粒剂、软膏剂或针剂。
[0020]
根据本发明的药物组合物可以全身和/或局部地起作用，为此，可以以合适的方式，例如通过口、肠胃外、肺或者鼻的途径服用，根据本发明的组合物可以适合于这些给药途径的服用形式服用。
[0021]
适于口服的是根据现有技术水平起作用和迅速地和/或以改进方式释放本发明的药物组合物的给药形式，并且包含以结晶和/或无定形的和/或溶解形式，例如片剂(无涂层或有涂层的片剂，其例如具有抵制胃液或者延迟溶解或不溶解的涂层，根据本发明的组合物释放)，在口中迅速破碎的片剂，或膜片，膜/冻干物，胶囊(例如硬或软胶囊)，糖衣片，颗粒，小丸，粉末，乳剂，悬浮液，烟雾剂或者溶液的根据本发明的药物组合物。
[0022]
肠胃外投药可以避免吸收步骤(例如静脉内，动脉内，心内，脊柱内或者腰内或者
关节内)或者同时包括吸收(例如肌肉内，皮下，皮内，经皮或者腹膜内)进行。适合于肠胃外投药法的合适的服用形式特别地是用于注射和注入以溶液，悬浮液，乳剂，冻干物或者无菌粉末形式的制剂。
[0023]
适合于另一个给药途径的是例如用于吸入的药物形式，例如粉末吸入器或者雾化器，或者可以鼻服用的药物形式，录入滴剂，溶液或者喷雾剂。
[0024]
根据本发明的药物组合物可以转化为所述的服用形式。这可以以本身已知的方式通过与惰性的、无毒的、药理学合适的赋形剂混合进行。这些赋形剂特别地包括载体(例如微晶纤维素、乳糖、甘露糖醇，淀粉)，溶剂(例如液体聚乙二醇)，乳化剂和分散剂或者湿润剂(例如十二烷基硫酸钠，油酸聚氧失水山梨糖醇酯，丙二醇)，粘合剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)，合成和天然聚合物(例如白蛋白)，稳定剂(例如抗氧化剂，如抗坏血酸)，着色剂(例如无机颜料，如铁氧化物)和掩盖性香料和气味。
[0025]
ggc有效的剂量可以根据给药方式、病人的年龄体重、病情严重程度以及其它相关的因素而改变，口服给药时推荐剂量为50～200mg/次，每日2-3次；肠胃外给药推荐剂量为20～120mg/次，每日1次。
[0026]
本发明的技术方案是：通过胶原诱导方法建立关节炎小鼠(collagen-induced arthritis，cia)模型，首次选用ggc作为治疗药物，研究其对cia小鼠关节病理学改变的影响，观察ggc对胶原诱导关节炎的防治作用，从而为ggc防治类风湿关节炎提供实验依据。
[0027]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0028]
(1)提供ggc具有高效抗类风湿性关节炎的用途，其能够显著减轻关节炎严重程度，如关节肿胀、关节炎指数，且逆转关节病理损伤，无明显的毒副作用，具有巨大的临床应用价值。
[0029]
(2)本发明提供的ggc具有高效抗类风湿性关节炎的用途，该用途具有潜在的重大经济效应。ggc或其药学上可接受的载体制备的制剂具有治疗类风湿性关节炎药物的应用前景，按照国家创新药物审批办法开发研制，有望成为具有我国独立自主知识产权的国家1类高效低毒治疗类风湿性关节炎新药，产业化前景明确。
附图说明
[0030]
图1为cia小鼠初次免疫后第51天小鼠的代表性图片；
[0031]
图2为ggc对cia小鼠关节炎症评分及足部厚度的影响；
[0032]
图3为各组小鼠后爪的代表性micro-ct重建图像；
[0033]
图4为ggc对cia小鼠相关骨质评分的影响；
[0034]
图5为各组小鼠关节部位病理组织改变图片；
[0035]
图6为各组小鼠关节组织免疫组化图及免疫组化中(caspase-1和il-1β)的定量图；
[0036]
其中，healthy组为健康对照组，cia组为模型组，ggc组为γ-谷氨酰半胱氨酸给药组，给药剂量为100mg/kg/day。
具体实施方式
[0037]
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明
限制在所述的实施例范围之中。
[0038]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0039]
一、材料
[0040]
1.实验动物
[0041]
dba/1小鼠，18只，雄性，8周龄，体重18～25g，spf级，由北京维通利华公司提供。试验期间饲养室温度20
±
3.2℃，相对湿度为65～75％，自由摄食和饮水。所有动物实验均经苏州大学实验动物福利伦理委员会许可进行。
[0042]
2.药品和试剂：
[0043]
2.1主要药品及试剂
[0044]
ggc，白色粉末，含量为≥95％，由上海源叶生物科技有限公司(shanghai yuanye bio-technology co.,ltd)提供，药品放置-20℃冰箱保存。临用时溶剂为纯水，现用现配。
[0045]
牛ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂(美国chondrex公司)；多聚甲醛、edta、dab显色剂(中国solarbio公司)；he、番红-o固绿染色试剂盒(sigma公司)；caspase-1抗体(sc-56036，santa cruz biotechnology)、il-1β抗体(sc-52012，santa cruz biotechnology)。
[0046]
2.2仪器
[0047]
电子天平秤，el104型，上海越平科学仪器有限公司生产；游标卡尺；小动物micro-ct(skyscan 1176，aartselaar，比利时)，石蜡包埋机(leica，德国)，石蜡切片机(leica，德国)，lsm 800激光共聚焦显微镜(zeiss，德国)，手术器械一套等。
[0048]
二、实验方法
[0049]
1.造模及给药
[0050]
dba/1小鼠18只，雄性，称重，编号，随机分为3组，即healthy健康组、cia模型组以及ggc给药组，每组6只小鼠。cia组与ggc组小鼠均通过二次免疫接种建立了胶原诱导关节炎小鼠模型。在第一次免疫中，小鼠在尾部皮下注射等体积牛ⅱ型胶原溶液(2mg/ml)和完全弗氏佐剂(4mg/ml)的混合乳液。第一次免疫21天后，用不完全弗氏佐剂乳化的牛ⅱ型胶原溶液对小鼠进行加强免疫。ggc给药组按100mg/kg(体重)的剂量每天口服给予ggc，其余2组给予相同量的空白溶剂纯水。
[0051]
2.关节评分与后爪肿胀度的测量
[0052]
第二次免疫后每三天对小鼠进行一次评分。每个后爪给予0-4分：0，正常；1，脚趾肿胀；2，踝关节和/或跗骨肿胀；3，踝关节和/或跗骨中度肿胀或两者轻度肿胀，4，整只爪子严重肿胀。在初级免疫前(第0天)和初级免疫后的第51天(第51天)，使用游标卡尺测量小鼠爪子的厚度。爪厚度增加定义为(厚度51-厚度0)/厚度0
×
100(％)。
[0053]
3.标本采集
[0054]
关节的处理：实验结束时，取小鼠的后腿(包括后爪和膝关节部位)并置于10％的多聚甲醛中固定超过24小时。其中一只后腿用于组织病理学观察，另一只用于影像学观察(micro-ct)。
[0055]
4.组织病理学观察
[0056]
小鼠的后腿(后爪和膝关节部位)采用10％的多聚甲醛固定，再经10％的edta脱钙
液浸泡四周进行脱钙后，用石蜡包埋，组织切片6μm，后行he、番红-o固绿染色。根据组织微观的改变如炎症细胞浸润，血管翳增生，软骨退化及破坏和蛋白多糖的丢失进行评估。
[0057]
5.显微ct(micro-ct)的评估
[0058]
将用多聚甲醛固定好的小鼠后爪放置在micro-ct扫描床上进行扫描。x射线的参数设置为500μa的电流，电压为50kv，每层扫描量为9μm。应用ctan分析软件对图像进一步处理。
[0059]
6.免疫组化研究
[0060]
选取膝关节6μm切片，胰酶修复抗原后用caspase-1、il-1β抗体4℃孵育过夜。与一抗在4℃环境孵育过夜后，切片在室温下用二抗孵育1小时，并在100μl dab溶液中染色2-6min，显微镜下拍照观察。
[0061]
7.统计方法
[0062]
应用sigmaplot v12.5、prism v8.2.1和rprogramv4.1.1来进行统计分析。
[0063]
三、实施结果
[0064]
实施例1ggc对小鼠关节和足体积的影响
[0065]
实验小鼠用ggc进行口服治疗，统计其关节炎症评分和后爪厚度，结果显示：模型组小鼠后爪有明显的红肿和关节僵直，而ggc治疗组的小鼠病变程度明显降低，见图1。与模型组相比，ggc(100mg/kg)治疗组中小鼠关节炎症评分以及后爪肿胀的严重程度明显降低，见图2。
[0066]
实施例2ggc治疗对关节骨质破坏的影响
[0067]
对小鼠的后爪进行micro-ct检查，micro-ct对小鼠的后爪进行扫描，同样发现模型组小鼠有明显的关节破坏，ggc(100mg/kg)治疗组中小鼠关节和骨破坏程度明显降低，见图3。相应地，bv/tv和总孔隙率的定量分析、膝关节组织学滑膜炎评分(hss)、膝关节oarsi评分结果表明ggc可有效抑制骨侵蚀活性、软骨损伤及血管翳的形成，见图4。
[0068]
实施例3ggc对关节滑膜组织的影响
[0069]
实验结束时，取小鼠后爪和膝关节，经石蜡切片并行he、番红-o固绿染色，共聚焦显微镜下观察结果显示：cia模型组的小鼠滑膜中有明显的炎症细胞浸润、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀等症状。ggc(100mg/kg)治疗组中小鼠炎症细胞浸润程度减轻，血管翳数量明显降低，软骨破坏及骨侵蚀的程度也明显减轻，见图5。
[0070]
实施例4ggc对关节caspase-1和il-1β表达水平的影响
[0071]
采用免疫组化方法对各组小鼠关节标本中caspase-1和il-1β的表达水平进行检测。显微镜下观察结果显示：在ggc治疗组的小鼠中，caspase-1和il-1β的表达水平显著降低了80％以上，caspase-1、il-1β的代表性免疫组化染色见图6。
[0072]
总结：
[0073]
1.cia小鼠连续灌胃口服给予ggc治疗51天后，ggc(100mg/kg)可显著降低cia小鼠后爪肿胀的严重程度。
[0074]
2.micro-ct检查显示，连续给药51天后，ggc(100mg/kg)可显著改善关节破坏的程度。
[0075]
3.病理组织学观察结果显示，ggc治疗后小鼠关节部位炎症细胞浸润、血管翳形成、软骨破坏和骨侵蚀等症状明显减轻。
[0076]
4.免疫组化观察结果显示，ggc治疗后小鼠关节部位caspase-1和il-1β的表达水平显著降低。
[0077]
综上所述，ggc对cia小鼠关节炎中炎症细胞浸润、骨质破坏、关节软骨侵蚀具有一定的防治作用。
[0078]
本发明可通过下面的实验例进一步说明。
[0079]
制备药剂的实施例1：
[0080]
取ggc单体化合物20g，加入药用淀粉280g，二者充分混合，制成1000粒胶囊，每粒重0.3g，含ggc 20mg。
[0081]
制备药剂的实施例2：
[0082]
取ggc单体化合物100g，加入药用淀粉200g，二者充分混合，制成1000片，每片重0.3g，含ggc 100mg。
[0083]
制备药剂的实施例3：
[0084]
取ggc单体化合物20g，加入1,2-丙二醇100ml，充分溶解，加灭菌注射用水稀释至1000ml，混匀后分装到1000支安瓿瓶中，每支1ml，含ggc 20mg。
[0085]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。