间充质干细胞或其细胞萃取物联合免疫调节剂在制备预防或治疗复发性流产药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种间充质干细胞或其细胞萃取物联合免疫调节剂在制备预防或治疗复发性流产药物中的应用。


背景技术：

2.根据美国生殖医学协会的规定，复发性流产(recurrent spontaneous abortion， rsa)是指两次以及两次以上的连续的胚胎丢失。除了遗传因素、子宫解剖结构异常、感染等明确病因外，尚有原因不明造成的复发性流产。由于缺乏有效的临床治疗措施，目前rsa已成为不孕不育症的重要原因之一。
3.现有治疗复发性流产的治疗方法包括：孕激素、抗凝剂、甲状腺素、人绒毛膜促性腺激素等对因治疗、针对免疫因素导致的免疫疗法如免疫球蛋白疗法、免疫抑制剂，补肾安胎方等中药方剂和淋巴细胞免疫治疗等。
4.目前治疗方法存在以下几个问题：目前以免疫抑制剂为主的西药和补肾安胎方等中药方剂可能存在一定毒副作用。临床治疗指南推荐多以对因治疗，对于不明原因复发性流产没有普适性较高的治疗药物。细胞疗法主要以淋巴细胞免疫治疗为主，需要从对应父方获取一定数量来源的淋巴细胞进行治疗，具有一定局限性，无法实现量化生产和治疗。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种间充质干细胞或其细胞萃取物联合免疫调节剂在制备预防或治疗复发性流产药物中的应用。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
7.本发明提供一种间充质干细胞或其细胞萃取物联合免疫调节剂在制备预防或治疗复发性流产药物中的应用。
8.本技术的发明人经过大量研究及试验发现，间充质干细胞或其细胞萃取物联合免疫调节剂可以有效预防或治疗复发性流产。
9.经过免疫性流产小鼠模型评估疗效实验可知，使用间充质干细胞或其细胞萃取物干预，或者使用免疫调节剂(例如羟氯喹)干预，或者使用间充质干细胞或其细胞萃取物联合免疫调节剂(例如羟氯喹)干预时，可以降低胚胎的丢失率，提高妊娠成功率，有效治疗复发性流产。
10.经过免疫性流产小鼠模型评估疗效实验验证，将间充质干细胞注射至小鼠中，可以降低胚胎丢失率，有效治疗或预防复发性流产。
11.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞的来源包括脐带华通氏胶、脐带血、骨髓、牙龈、胎盘、羊膜、绒毛膜、外周血、脂肪和皮肤中的一种。
12.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞的免疫表型包括同时高表达cd73、cd90、cd105，同时不表达cd45、cd34、cd11b、cd79 α/cd19和hla-dr。
13.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞的制备方法包括以下步骤：使用组织块贴壁法进行原代培养分离提取间充质干细胞，然后经干细胞培养基传代培养得到。
14.具体步骤包括：
15.s1.组织处理：
16.用无菌直头剪将组织剪切成组织匀浆块，获取的组织切1-4mm3大小，用生理盐水将剪切后的组织匀浆块定容(40～45)ml，晃动离心管，使胶体组织悬浮在离心管中。以300g离心力，常温下离心5min。弃掉剩余上清。根据胶体组织数量，将离心管中胶体组织按每t75培养瓶0.5g接种，均匀的接种数个t75培养瓶，每瓶加入干细胞培养基，总体积约10ml，摇匀；
17.s2.原代细胞收集及细胞传代：
18.每5天换液一次，培养的第(14～17)天镜下观察细胞状态，待细胞融合达 (80-90)％时，开始进行原代细胞收集，取出t75瓶，将培养上清转移至50ml离心管，300g离心力，常温下离心5min，上清作为胰酶消化终止液备用。洗涤培养瓶底面，按每t75瓶3ml的量加入37℃复温后的胰酶替代物，计时(3～5) min。镜下观察细胞全部飘起或计时结束后，加入5-10m上清液终止酶解，适当摇匀吹打，悬液移入50ml离心管，获得细胞悬液。取适量生理盐水吹打清洗底面一遍，细胞悬液以300g离心力，常温下离心5min。用10ml培养基重悬细胞沉淀，取一个70-100μm细胞筛过滤细胞悬液，取10～20μl细胞悬液用于计数和活率。
19.根据计数结果，进行原代细胞后续处理，每瓶按140万个细胞接种t175培养瓶，每瓶加入细胞悬液和培养液，总体积18ml。轻轻摇晃均匀，镜下观察分布情况。
20.细胞传代培养至72h
±
24h，镜下观察细胞状态，待细胞融合达(85～90)％时，将培养液全部倒出，用生理盐水进行清洗，加入5ml消化液，终止消化后进行离心(300g，5min)，弃去上清；将细胞悬液转移至离心管，重悬并计数，调整浓度(6
×
105/ml)。在t175培养瓶中依次加入2ml细胞悬液和16ml培养基；于37℃、5％co2培养箱进行培养36-72h。
21.s3.目标细胞冻存、质检：
22.消化制备细胞悬液步骤同前描述，取样进行计数和流式检测，进行第二次洗涤离心，300g离心力，常温下离心5min。留取洗涤离心上清液用于细菌培养、内毒素、支原体检测以及留样。细胞沉淀加入一定量预冷的无血清冻存液定容，轻柔混匀，根据细胞的冻存需求，按每管(0.1～2.0)
×
107cells/ml的密度进行细胞冻存。
23.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述组织的来源包括脐带华通氏胶、脐带血、骨髓、牙龈、胎盘、羊膜、绒毛膜、外周血、脂肪和皮肤。
24.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞在干细胞培养基中传代3-5代。
25.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述细胞萃取物包括外泌体，所述外泌体的表达标记物为tsg101、cd9、cd63和cd81。
26.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述间充质干细胞或其细胞萃取物的剂型包括凝胶、注射液、脂质体、冻干粉或乳剂。
27.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述复发性流产包括自身免疫疾病、同种免疫异常、凝血功能异常、薄型子宫及其他未明病因导致的复发性流产。
28.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述免疫调节剂包括羟氯喹、手性羟氯喹及其类似物、硫唑嘌呤、他克莫司、生物制品、生物制剂、糖皮质激素以及其他生殖和妊娠期安全的免疫调节药物和药物组合物。
29.本发明还提供了一种间充质干细胞在制备预防或治疗复发性流产药物中的应用。
30.经过免疫性流产小鼠模型评估疗效实验验证，将间充质干细胞注射至小鼠中，可以降低胚胎丢失率，有效治疗或预防复发性流产。
31.此外，本发明还提供了一种药物组合物，包括间充质干细胞或其细胞萃取物和免疫调节剂，所述免疫调节剂包括羟氯喹、手性羟氯喹及其类似物、硫唑嘌呤、他克莫司、生物制品、生物制剂、糖皮质激素以及其他妊娠期安全的免疫调节药物和药物组合物；间充质干细胞或其细胞萃取物的剂型包括凝胶、注射液、脂质体、冻干粉或乳剂。
32.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
33.基于间充质干细胞的免疫调节作用和免疫调节剂如小分子药物羟氯喹具有一定抗血栓和免疫调节的双重效果，本发明提供了一种间充质干细胞或其细胞萃取物联合免疫调节剂在制备预防或治疗复发性流产药物中的应用，相比于以往疗法，间充质干细胞免疫源性低，是较理想的细胞治疗制剂，与免疫调节剂 (小分子药物羟氯喹)联合应用，相较于传统单纯免疫抑制剂和中药制剂，能有效降低胚胎丢失率，提高妊娠成功率，且妊娠期安全性高。
具体实施方式
34.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
35.在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
36.实施例1、间充质干细胞的提取与分离
37.取新鲜娩出的脐带组织，用生理盐水浸泡润洗，去除脐带表面血污，然后放入过滤后的75％酒精中，浸泡1min消毒；再用生理盐水清洗残余酒精。
38.用无菌剪刀减去脐带两头，再将剩余脐带剪成2～3cm小段，生理盐水洗涤；用无菌带齿镊子剥离脐静脉和脐动脉，再将华通氏胶撕下，转移到50ml离心管内，800g离心5min，弃去上清，称重。再用另一把无菌剪刀将华通氏胶剪成 1～4mm3的组织块，再用生理盐水洗涤离心，将剪切后的组织匀浆块定容(40～45) ml，晃动离心管，使胶体悬浮在离心管中。以300g离心力，常温下离心5min，弃去上清。
39.根据胶体组织数量，将离心管中胶体组织，按照每瓶接种0.5g，均匀接种到t75培养瓶中，培养基总体系为7ml，放入co2培养箱内培养，全程保持无菌条件。
40.每5天换液一次，培养的第(14～17)天镜下观察细胞状态。培养5天后，进行全换液；培养10天后，进行半换液。培养15天后，观察到细胞融合率达 85％以上，开始收集原代细胞。取出本批次需操作的t75瓶，将培养上清转移至50ml离心管，300g离心力，常温下离心5min，上清作为胰酶消化终止液备用。生理盐水洗涤培养瓶底面，每瓶t75培养瓶加入3ml胰酶消化5min，镜下观察细胞全部飘起或计时结束后，加入5-10m上清液终止酶解，适当摇匀吹打，悬液移入50ml离心管，制得细胞悬液。取适量生理盐水吹打清洗底面一遍，细胞悬液
以300g离心力，常温下离心5min。用10ml培养基重悬细胞沉淀，取一个100μm细胞筛过滤细胞悬液，取20μl细胞悬液用于计数，余下细胞悬液继续传代。
41.根据计数结果，进行原代细胞后续处理，每瓶按140万个细胞接种t175培养瓶，每瓶加入细胞悬液+培养液，总体积18ml。轻轻摇晃均匀，镜下观察分布情况。
42.实施例2、间充质干细胞表型鉴定
43.取待测细胞悬液到1.5mlep管，1000rpm离心5min清洗两次，弃去上清后，加入750μl生理盐水轻轻混匀，取7只ep管，加入100μl细胞悬液，分别加入cd90、cd105、cd34、cd45、cd73、hla-dr，吹打混匀，室温孵育至少30min。分别加1ml生理盐水，轻轻吹打洗涤细胞，放入离心机，1000rpm，5min，弃上清液；分别向各离心管中加入400μl生理盐水吹打混匀，按顺序依次上机检测。cd34、cd45、hla-dr、cd19、cd14阳性率应小于2％，cd73、cd90、 cd105阳性率应大于95％，即可认定该细胞悬液为脐带间充质干细胞。
44.实施例3、免疫性流产小鼠模型评估疗效
45.本发明提出免疫性流产小鼠模型，评估间充质干细胞联合羟氯喹在复发性流产的有效性。
46.脐带间充质干细胞注射液制备：将预定剂量的脐带间充质干细胞37℃水浴锅中摇动至细胞大部分溶解，洗涤后以100-200ml的0.9％氯化钠注射液、1-10％人血白蛋白稀释后，制备成脐带间充质干细胞注射液。
47.选择8-10周龄的雌性cba/j小鼠、雄性dba/2j小鼠和balb/c小鼠，分组为：
48.正常妊娠组(10只cba/j
♀
x 5只balb/c
♂
)、模型组(10只cba/j
♀
x 5 只dba/j
♂
)、干细胞治疗组(10只cba/j
♀
x 5只dba/j
♂
)、羟氯喹治疗组 (10只cba/j
♀
x 5只dba/j
♂
)、联合治疗组(10只cba/j
♀
x 5只dba/j
ꢀ♂
)。
49.给药方式：联合治疗组和干细胞治疗组于孕1d单次尾静脉注射干细胞制剂 1*106/0.5ml，正常妊娠组、模型组、羟氯喹治疗组于孕1d注射等体积生理盐水，另外联合治疗组和羟氯喹治疗组于孕第1-10d每天灌注羟氯喹10mg/kg。
50.观察指标：于孕11d处死所有雌性小鼠，收集胚胎、胎盘、蜕膜等组织，观察子宫和胚胎形态，比较组间的胚胎吸收率，结果如表1所示。
51.表1
[0052][0053]
结果提示：三组治疗组相较于造模组胚胎丢失率都有所降低(p＜0.05)，其中以联合治疗组胚胎丢失率相较于另外两组治疗组降低更为显著(p＜0.05)，说明了间充质干细
胞及其联合羟氯喹在复发性流产中的治疗有效性。相比于以往疗法，间充质干细胞来源免疫源性低，是较理想的细胞治疗制剂，与小分子药物羟氯喹联合应用，相较于单纯免疫抑制剂和中药制剂，能够降低胚胎丢失率，提高妊娠成功率妊娠期安全性高。
[0054]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。