重组tPA阿替普酶在制备治疗鼻息肉药物中的应用

重组tpa阿替普酶在制备治疗鼻息肉药物中的应用
技术领域
1.本发明属于鼻息肉治疗领域，更特别地，涉及组织型纤溶酶原激活剂重组人tpa阿替普酶在制备治疗鼻息肉药物中的应用。


背景技术：

2.鼻息肉是以大量炎症细胞浸润和炎性组织水肿为特征的异质性疾病。尽管目前以糖皮质激素和手术为一线治疗方法，但研究报道有部分患者存在激素抵抗，也有相当一部分患者对激素治疗不耐受，那么手术就成了这部分患者主要的治疗鼻息肉的方法。不同的研究报道鼻息肉手术后，5年内有20-50％的患者出现复发。对于鼻息肉的治疗，急需开发新的药物。
3.组织型纤溶酶原激活剂(tpa)是一种丝氨酸蛋白酶，能特异地作用于与纤维蛋白结合的纤溶酶原使其转化为纤溶酶，激活其降解蛋白纤维的活性。因此，在医药领域，tpa被用作抗凝血药。尚无研究报道tpa对鼻息肉具有缓解和治疗作用。


技术实现要素：

4.本团队在研究中发现，鼻息肉中存在大量的纤维蛋白网，使得组织胶体渗透压的增高，导致组织水肿，这可能会导致息肉的形成。进一步研究发现，纤溶系统中的组织型纤溶酶激活物(tpa)在鼻息肉中明显降低。鼻息肉中低水平的tpa可能导致纤维蛋白网降解不足，导致纤维蛋白网积聚，引起了组织水肿。我们推测用tpa可以消除纤维蛋白网，以达到消除鼻息肉的目的。tpa有强特异性，与纤维蛋白网的纤溶酶原结合，使得纤溶酶原激活为纤溶酶，纤溶酶发挥降解纤维蛋白网的作用。重组人tpa阿替普酶因其高特异性而对人体安全性高。
5.基于以上发现，本发明提供了组织型纤溶酶原激活剂在制备治疗鼻息肉药物中的应用。
6.在一个具体实施方案中，所述组织型纤溶酶原激活剂为重组组织型纤溶酶原激活剂。
7.在一个具体实施方案中，所述重组组织型纤溶酶原激活剂为阿替普酶。
8.本发明还提供了一种体外缩小鼻息肉组织块的方法，包括使用组织型纤溶酶原激活剂孵育所述鼻息肉组织块的步骤。
9.在一个具体实施方案中，所述组织型纤溶酶原激活剂为重组组织型纤溶酶原激活剂。
10.在一个具体实施方案中，所述重组组织型纤溶酶原激活剂为阿替普酶。
11.在一个具体实施方案中，孵育时所述阿替普酶的浓度1-1000μg/ml。
12.在一个具体实施方案中，孵育温度为37℃。
13.本发明通过用重组tpa(阿替普酶)对患者进行鼻息肉局部注射，即可治疗鼻息肉，适用于在门诊进行操作，方法简单，易于掌握，无需较高级别的教授进行操作。并且，该方法
安全性高，可行性强，整体成本较低。此外，对于激素抵抗的患者，或经济水平较低，或不耐受手术的患者，本发明提供了一种治疗鼻息肉的可能。
附图说明
14.图1为不同浓度的阿替普酶处理不同时间后的鼻息肉组织块的外观照片。
15.图2为不同浓度的阿替普酶处理24h后，组织中的fibrin含量和d-dimer含量的检测实验结果及统计，其中，a为免疫荧光照片，b为根据免疫荧光照片统计的fibrin含量，c为免疫印迹照片，d为根据免疫印迹照片统计的fibrin含量，e为elisa法检测得到d-dimer含量统计图。
16.图3为100μg/ml的阿替普酶处理不同时间后，组织中的fibrin含量和d-dimer含量的检测实验结果及统计，其中，a为免疫荧光照片，b为根据免疫荧光照片统计的fibrin含量，c为免疫印迹照片，d为根据免疫印迹照片统计的fibrin含量，e为elisa法检测得到d-dimer含量统计图。
具体实施方式
17.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
18.将阿替普酶配制成1mg/ml的标准溶液。从志愿者获取鼻息肉组织，用含3％青链霉素的pbs清洗3次，用眼科剪刀把鼻息肉组织分割成长宽约5毫米大小的组织块，且保留上皮。
19.将组织块转移到12孔板的transwell板上室中，下室加入1ml无酚红的dmemf12培养基，将transwell板放入含5％co237℃的培养箱进行培养。分为5个处理组，每个处理组中的阿替普酶浓度分别为0μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml、1000μg/ml。
20.1、组织块的外观变化
21.处理3h、6h、12h、24h后观察组织块的变化。
22.2、免疫荧光法检测处理后的组织块中纤维蛋白网(fibrin)的含量
23.将组织块放于含4％的多聚甲醛中固定24h，然后用石蜡包埋。将包埋的石蜡组织切成4μm厚的组织切片。组织切片用二甲苯处理40min，无水乙醇10min，95％乙醇5min，85％乙醇5min，75％乙醇5min。然后将组织切片用流水冲洗5min，用edta修复液进行抗原热修复30min。待组织切片冷却后用pbs液体洗3次，每次5min。后用5％的驴血清进行封闭非特异位点1h，再加入1:100稀释的小鼠抗人fibrin抗体，放于4℃冰箱孵育过夜。第二天，取出组织切片放于室温进行复温1h，然后用pbs液洗3次，每次7min。加入带绿色荧光的兔抗小鼠的二抗于组织切片上，室温放置50min。后用pbs液洗3次，每次7min。加入dapi后，室温放置5min，用pbs液洗3次，每次7min。封片后在荧光显微镜下拍片，然后用imagej软件进行统计分析。
24.3、免疫印迹法检测组织块中fibrin的含量
25.将组织块称量后，取25mg组织，加入250μl的组织裂解液后，放于匀浆仪后进行碾磨。然后取出放于冰上裂解10min，以5000rpm/min4℃离心10min，吸取上清于新的ep管中。用bca法检测每个样本中总的蛋白含量。
26.取一部分样本进行western blotting实验，检测组织块培养中的fibrin含量。以
25μg的上样量计算出每份样本的上样体积。用10％十二烷基硫酸钠(sds)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离含蛋白质的样品，并转移到pvdf膜。pvdf膜置于5％的脱脂奶粉中进行封闭非特异性位点1小时，后加入1:500的小鼠抗人的fibrin抗体，4℃孵育过夜。第二天取出于室温下复温1小时，然后tbst洗3次，每次10min。加入1:5000的兔抗小鼠的二抗，室温孵育1h，后tbst洗3次，每次10min。然后用发光液进行曝光，imagej软件进行灰度的计算。
27.4、elisa检测组织块中d-dimer的含量
28.取出试剂盒中elisa检测板及试剂并置于室温平衡至少30分钟；用超纯水制备1
×
洗液缓冲液，充分震荡混匀后备用。蛋白标准品及检测样品的制备：蛋白标准品用样本稀释液进行梯度稀释，浓度分别为2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml；待测样本用样本稀释液稀释10倍并充分混匀。分别设置标准品孔、待测样本孔及空白孔(空白孔加样本稀释液，其余步骤都相同)。将待测样本及对照小心加至各反应孔中，避免接触孔底部，每孔加入100μl，轻轻晃动混匀并尽量避免有气泡。用封板膜封板后于37℃反应90分钟；反应后甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，不洗；讲准备好的生物素抗人d-dimer抗体工作液每孔按每孔100μl加入(tmb空白显色孔除外)；酶标板加上封板膜，37℃反应60分钟；1
×
洗液缓冲液洗涤3次，每次浸泡1分钟左右(每孔洗液至少300μl)；按每孔90μl依次加入tmb显色液，37℃避光反3-10分钟；按每孔100μl依次加入终止液，此时蓝色立转为黄色。用酶标仪在450nm测定od值。根据标准品绘制标准曲线并计算出样品浓度。
29.实验结果如下：
30.1)如图1所示，阿替普酶浓度越高，处理时间越长，组织块缩小越明显。
31.2)如图2所示，随着阿替普酶浓度的增加，fibrin的免疫荧光染色信号逐渐减弱(图2a和b)，免疫印迹实验也得出了相似的结果(图2c和d)，检测纤维蛋白网的降解产物d-dimer，结果显示，随着阿替普酶浓度的增加，d-dimer含量升高(图2e)。
32.3)如图3所示，在100μg/ml阿替普酶的处理下，随着处理时间的延长，fibrin的免疫荧光染色信号逐渐减弱(图3a和b)，免疫印迹实验也得出了相似的结果(图3c和d)，检测纤维蛋白网的降解产物d-dimer，结果显示，随着阿替普酶浓度的增加，d-dimer含量升高(图3e)。
33.以上实验结果说明，由于阿替普酶激活了息肉组织中的纤维蛋白酶，使其溶解纤维蛋白网，因此，随着阿替普酶的浓度升高和处理时间的延长，息肉组织中的fibrin含量减少，分解产物d-dimer的含量升高，组织块体积缩小。
34.根据上述实验的启发，我们对息肉患者用阿替普酶进行鼻息肉局部注射治疗，结果显示，阿替普酶对鼻息肉的治疗有着显著的效果。由于该方法十分简单，适用于在门诊直接进行治疗。
35.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。