抑制miR-21表达量的物质在治疗CRSwNP鼻黏膜2型炎症中的应用的制作方法

抑制mir-21表达量的物质在治疗crswnp鼻黏膜2型炎症中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及抑制mir-21表达量的物质在治疗crswnp鼻黏膜2型炎症中的应用。


背景技术：

2.慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，crswnp)是一种常见的慢性鼻黏膜炎症性疾病。crswnp患者通常患有鼻塞、流涕、面部疼痛或头痛以及嗅觉受损，导致生活质量的下降。近几年研究表明，crswnp的鼻黏膜炎症主要表现为1型、2型和3型炎症，最主要的炎症特征为2型炎症。crswnp中的2型炎症与疾病严重程度、复发、伴发哮喘等均显著相关。因此，控制2型炎症是从根本上治疗crswnp的至关重要途径。
3.2型炎症的特征为鼻黏膜高度嗜酸性粒细胞(eosinophils，eos)浸润和免疫细胞产生高水平的il-4、il-5和il-13等细胞因子。黏膜上皮细胞来源的细胞因子il-33，是上游介导2型炎症的关键重要因子。il-33的表达增加，可显著促进免疫细胞如ilc2细胞、肥大细胞等产生大量的il-4、il-5和il-13等细胞因子，从而引起2型炎症。
4.micrornas(mirnas)是一类小的内源性非编码rna分子，可阻断翻译或诱导mrna的降解，从而控制基因表达。已有充分的证据表明，mirnas在免疫系统的调节中起关键作用，并且与炎症性疾病的病因和进展密切相关。


技术实现要素：

5.本发明的目的是治疗crswnp鼻黏膜2型炎症。
6.本发明首先保护抑制mir-21表达量和/或活性的物质在制备用于治疗crswnp鼻黏膜2型炎症的产品中的应用。
7.抑制mir-21表达量和/或活性的物质在制备用于预防crswnp鼻黏膜2型炎症的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
8.抑制mir-21表达量和/或活性的物质在制备用于减轻crswnp鼻黏膜2型炎症的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
9.上述应用中，所述减轻crswnp鼻黏膜2型炎症可表现为il-4、il-5和/或eotaxin的显著降低。
10.抑制mir-21表达量和/或活性的物质在制备用于减少crswnp鼻黏膜中嗜酸性粒细胞的浸润的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
11.抑制mir-21表达量和/或活性的物质在制备用于减轻crswnp鼻黏膜中炎症细胞的浸润的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
12.上述应用中，所述炎症细胞可为cd45
+
炎症细胞。
13.上述任一所述抑制mir-21表达量和/或活性的物质可为抑制mir-21-5p表达量和/或活性的物质。
14.所述抑制mir-21-5p表达量和/或活性的物质可为a1)或a2)：
15.a1)化学修饰或非修饰的特异性结合并抑制mir-21-5p的正义、反义单链和/或双链寡核苷酸；所述mir-21-5p序列为5
’‑
uagcuuaucagacugauguuga-3’；
16.a2)化学修饰或非修饰的特异性结合并抑制mir-21-5p功能区序列的正义、反义单链和/或双链寡核苷酸；
17.所述mir-21-5p功能区序列为uagcuuau和/或agcuuau。
18.本发明还保护将mir-21作为药物靶点的物质的应用，为b1)、b2)、b3)、b4)或b5)：
19.b1)制备用于治疗crswnp鼻黏膜2型炎症的产品；
20.b2)制备用于预防crswnp鼻黏膜2型炎症的产品；
21.b3)制备用于减轻crswnp鼻黏膜2型炎症的产品；
22.b4)制备用于减少crswnp鼻黏膜中嗜酸性粒细胞的浸润的产品；
23.b5)制备用于减轻crswnp鼻黏膜中炎症细胞的浸润的产品。
24.上述应用中，所述将mir-21作为药物靶点的物质具体可为将mir-21-5p作为药物靶点的物质。
25.实验证明，敲除mir-21(准确的说是敲除mir-21-5p)可以减少crswnp鼻黏膜中嗜酸性粒细胞的浸润、减轻crswnp鼻黏膜中炎症细胞的浸润、减轻crswnp鼻黏膜2型炎症，减轻crswnp鼻黏膜2型炎症表现为il-4、il-5和/或eotaxin的显著降低。由此可见，mir-21是针对crswnp鼻黏膜2型炎症的治疗靶点，敲除mir-21可以治疗crswnp鼻黏膜2型炎症。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
26.图1为敲除mir-21减少嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜中嗜酸性粒细胞的浸润。
27.图2为敲除mir-21减少嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜中cd45
+
炎症细胞的浸润。
28.图3为敲除mir-21减轻嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜中2型炎症因子的分泌。
29.图4为在嗜酸性crswnp小鼠模型中，敲除mir-21影响mir-21-5p的表达。
30.图5为上皮细胞beas-2b中过表达mir-21-5p可促进il-33的产生。
具体实施方式
31.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
32.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.下述实施例中，mir-21-5p的核苷酸序列为
[0034]5’‑
uagcuuaucagacugauguuga-3’。
[0035]
实施例、
[0036]
一、材料与方法
[0037]
1、研究对象
[0038]
mir-21敲除小鼠(129s6-mir21a
tm1yoli
/j)购于杰克逊实验室，其中mir-21序列的93bp前体被pgk-gb2 loxp ifrt侧翼新霉素抗性盒替换，mir-21敲除小鼠(129s6-mir21a
tm1yoli
/j)与野生型c57bl/6小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)繁殖后获得纯合的mir-21敲除小鼠，纯合的mir-21敲除小鼠中mir-21-5p的表达缺失。
[0039]
本实施例使用的mir-21敲除小鼠均为纯合的mir-21敲除小鼠，对照为同窝野生型c57bl/6小鼠(以下简称同窝野生型小鼠)。所有小鼠都饲养在12h光照/12h黑暗、22
±
2℃、相对湿度为50
±
5％的环境中，并且可以自由获取饮用水和食物。所有动物实验均按照《实验动物护理和使用指南》进行。
[0040]
2、嗜酸性crswnp小鼠模型的构建
[0041]
本研究中共纳入24只小鼠，均为6周龄的mir-21敲除小鼠或同窝野生型小鼠。具体如下：
[0042]
(1)由6只6周龄的mir-21敲除小鼠组成mir-21敲除-crswnp组。每只小鼠鼻内用米曲霉菌蛋白酶(ap)和卵清蛋白(ova)的混合物处理(参考文献：development of a mouse model of eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyp by nasal instillation ofanaspergillus protease and ovalbumin，2017)：将2个单位ap(sigma，usa)和75μg ova(sigma，usa))组成的混合物在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)中稀释至总体积为20μl，每只小鼠鼻内滴注20μl，之后将小鼠头部保持在向下的位置，以防止试剂流入肺部。每周3次，持续12周。
[0043]
(2)按照步骤(1)的方法，将mir-21敲除小鼠替换为同窝野生型小鼠，其他步骤均不变，得到由6只6周龄的同窝野生型小鼠组成的野生型-crswnp组。
[0044]
步骤(1)和步骤(2)获得的小鼠即为嗜酸性crswnp小鼠模型。
[0045]
(3)由6只6周龄的mir-21敲除小鼠组成mir-21敲除-对照组。每只小鼠鼻内用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)处理：每只小鼠鼻内滴注20μl pbs，之后将小鼠头部保持在向下的位置，以防止试剂流入肺部。每周3次，持续12周。
[0046]
(4)由6只6周龄的同窝野生型小鼠组成野生型-对照组。每只小鼠鼻内用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)处理：每只小鼠鼻内滴注20μl pbs，之后将小鼠头部保持在向下的位置，以防止试剂流入肺部。每周3次，持续12周。
[0047]
(5)完成步骤(1)-(4)中最后一次鼻内滴注后24h，收集鼻腔灌洗液样本。麻醉后，将小鼠心内灌注生理盐水，解剖后收获鼻黏膜组织进行病理组织学分析。
[0048]
3、组织学分析
[0049]
(1)嗜酸性粒细胞浸润评估
[0050]
对于入组小鼠心内灌注后，去除头部皮肤和软组织，切除下颌骨。将小鼠头骨在4％多聚甲醛中固定12h，在5％硝酸中脱钙3天，再根据标准程序将组织石蜡包埋。对连续切片用苏木精和伊红(h&e)染色，以评估息肉样病变和嗜酸性粒细胞浸润情况。
[0051]
(2)炎症细胞浸润评估
[0052]
将步骤(1)获得的小鼠头部石蜡切片进行免疫组织染色用于评估鼻组织中炎症细胞的浸润。用cd45抗体(abcam，usa)评估炎症细胞浸润程度。
[0053]
h&e染色和免疫组化染色的所有组织学分析均由两名病理学技术人员单独进行且两名病理学技术人员均对研究设计不知情。
[0054]
4、鼻腔灌洗液和细胞因子的检测
[0055]
对入组小鼠切除部分气管，将一根24号导管插入鼻咽部。鼻腔内注入300μl pbs缓冲液，收集来自鼻孔的液体作为鼻腔灌洗液。使用bca试剂盒检测蛋白浓度，使用mouse procarta plex mix&match试剂盒(thermo fisher，usa)并按照制造商的说明在bio-plex200系统(bio-rad，usa)上进行分析。
[0056]
5、实时定量pcr
[0057]
根据制造商的说明，使用trizol试剂(thermo fisher，usa)提取小鼠鼻黏膜组织以及培养的细胞系的总rna。
[0058]
为了检测小鼠鼻黏膜中mir-21-5p和mir-21-3p的表达水平，使用transscript mirna first-strand cdna synthesis supermix试剂盒和特异性mirna反转录引物(mir-21-5p的特异性mirna反转录引物为：5
’‑
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcaaca-3’；mir-21-3p的特异性mirna反转录引物为：5
’‑
gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacgacagc-3’)进行反转录。之后根据制造商的说明，使用transstart tip green qpcr supermix试剂盒定量检测mir-21-5p(上游引物：5
’‑
gcgcgctagcttatcagactga-3’；下游引物：5
’‑
gtgcagggtccgaggt-3’)和mir-21-3p(上游引物：5
’‑
gcgccaacagcagtcgatgg-3’；下游引物：5
’‑
gtgcagggtccgaggt-3’)。使用u6小核rna(上游引物：5
’‑
gcttcggcagcacatatactaaaat-3’；下游引物：5
’‑
cgcttcacgaatttgcgtgtcat-3’)进行标准化。
[0059]
对于mrna表达分析，使用prime script rt master mix(takara biotechnology，china)合成cdna。使用tb green fast qpcr试剂盒(takara biotechnology，china)进行实时定量pcr以评估il-33(上游引物：5
’‑
gcctgtcaacagcagtctactg-3’；下游引物：5
’‑
tgtgcttagagaagcaagatactc-3’)的表达量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)用作参考基因(检测gapdh的上游引物：5
’‑
gtctcctctgacttcaacagcg-3’，下游引物：5
’‑
accaccctgttgctgtagccaa-3’)。rna表达被量化并显示，量化使用以下公式计算：单位＝2
(
–
δct)
×
1000。
[0060]
6、细胞培养和转染
[0061]
将人支气管上皮细胞系beas-2b在含1％青霉素、1％链霉素和10％胎牛血清的rpmi 1640培养基中培养。
[0062]
对于转染，将细胞接种在24孔板中，当细胞汇合度达到80％时进行转染，使用lipofectamine 3000过表达mirna(invitrogen，usa)。将beas-2b细胞用100nmol/l mir-21-5p agomir(即化学修饰的双链mirna模拟物；吉玛公司，中国)转染，转染后48h，收获细胞并使用实时定量pcr检测il-33的表达。
[0063]
7、统计学分析
[0064]
数据表示为中位数和四分位间距(iqr)，并使用graphpad prism版本8.0(graphpad software，lajolla，calif)进行数据分析。多组间比较采用kruskal-wallis检验加post-hoc dunn's多组间比较检验，两组之间的差异分析使用mann-whitney u检验。在p值《0.05时差异被认为是显著的。
[0065]
二、实验结论
[0066]
1、敲除mir-21减少嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜中嗜酸性粒细胞的浸润
[0067]
为了研究mir-21在crswnp发病机制中的作用，本发明的发明人分别在mir-21敲除小鼠和同窝野生型小鼠中通过鼻腔滴注ap+ova 12周建立了嗜酸性crswnp小鼠模型(见图1中a)。
[0068]
野生型-crswnp组小鼠鼻组织的h&e染色显示息肉样病变和弥漫性肿胀的黏膜，伴有广泛的嗜酸性粒细胞浸润，而野生型-对照组小鼠的黏膜光滑而薄，没有明显炎症(见图1中b)。
[0069]
进一步，评估浸润在鼻黏膜上皮下层的嗜酸性粒细胞计数。统计结果见图1中c(**为p《0.01)。结果表明，与野生型-对照组小鼠相比，野生型-crswnp组小鼠鼻黏膜中浸润的嗜酸性粒细胞显著增加；与mir-21敲除-对照组小鼠相比，mir-21敲除-crswnp组小鼠鼻黏膜中浸润的嗜酸性粒细胞增加。然而，与野生型-crswnp组小鼠相比，mir-21敲除-crswnp组小鼠鼻黏膜中浸润的嗜酸性粒细胞显著减少。
[0070]
2、敲除mir-21减轻嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜中的cd45
+
炎症细胞的浸润
[0071]
免疫染色结果表明(见图2；**为p《0.01，*为p《0.05)，与野生型-对照组小鼠相比，野生型-crswnp组小鼠鼻黏膜中的cd45
+
炎症细胞显著增加；与mir-21敲除-对照组小鼠相比，mir-21敲除-crswnp组小鼠鼻黏膜中的cd45
+
炎症细胞增加。与野生型-crswnp组小鼠相比，mir-21敲除-crswnp组小鼠鼻黏膜中cd45
+
炎症细胞显著降低，即mir-21的缺失显著降低了嗜酸性crswnp小鼠模型中cd45
+
炎症细胞在鼻黏膜中的浸润。
[0072]
3、敲除mir-21减轻嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜中的2型炎症
[0073]
为了评估ap+ova激发的嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜的2型炎症反应，检测鼻腔灌洗液中炎症细胞因子/趋化因子的浓度。
[0074]
鼻腔灌洗液中炎症细胞因子/趋化因子的浓度检测结果见图3(**为p《0.01，*为p《0.05)。与野生型-对照组小鼠相比，野生型-crswnp组小鼠的鼻腔灌洗液中2型炎症因子il-4、il-5和嗜酸性粒细胞趋化因子eotaxin的浓度显著增加。与野生型-crswnp组小鼠相比，mir-21敲除-crswnp组小鼠的鼻腔灌洗液中il-4、il-5和eotaxin显著降低。因此，mir-21的缺失显著减轻了鼻黏膜中的2型炎症，表现为mir-21的缺失在蛋白水平上显著降低了与2型炎症相关的细胞因子/趋化因子(如il-4、il-5和eotaxin)的产生。
[0075]
4、在嗜酸性crswnp小鼠模型中，敲除mir-21主要影响mir-21-5p的表达
[0076]
在mirna生物发生过程中，mirna前体分子可以被加工以释放mirna-5p/-3p(或mirna/mirna*)双链体。通常其中一条链被认为是具有生物活性的mirna，而另一条链被认为是无活性链并且通常会降解。本发明的研究结果表明，mir-21-5p在小鼠鼻组织中的表达丰度很高，mir-21-3p在小鼠鼻组织中的表达丰度非常低，这表明mir-21-3p的非活性作用(图4)。本发明首次证明鼻黏膜中上调的mir-21-5p与嗜酸性炎症2型炎症相关，并且可促进上皮来源的细胞因子il-33的产生。敲除mir-21可显著减轻嗜酸性crswnp小鼠模型鼻黏膜中的2型炎症。由此可见，mir-21-5p是针对嗜酸性crswnp 2型炎症的治疗靶点，敲除mir-21可以治疗crswnp 2型炎症。
[0077]
5、在上皮细胞中过表达mir-21-5p促进il-33的产生
[0078]
通过对人呼吸道上皮细胞系beas-2b转染mir-21-5p agomir(即对beas-2b细胞过表达mir-21-5p)，研究mir-21-5p对il-33表达的影响。
[0079]
mir-21-5p agomir(即mir-21-5p双链模拟物)的序列为：5
’‑
uagcuuaucagacugauguuga-3’和3
’‑
uuaucgaauagucugacuacaa-5’。
[0080]
按照上述方法，将mir-21-5p agomir替换为mirna agomir双链阴性对照序列，其它步骤均不变，作为阴性对照。
[0081]
mirna agomir双链阴性对照序列为：5
’‑
uucuccgaacgugucacgutt-3’和3
’‑
ttaagaggcuugcacagugca-5’。
[0082]
检测结果见图5(p《0.05，对照为阴性对照，mir-21-5p模拟物为mir-21-5p双链模拟物)。结果表明，与阴性对照相比，在人呼吸道上皮细胞beas-2b中过表达mir-21-5p，il-33的表达水平显著增加；即mir-21-5p可调控il-33的产生。
[0083]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。