一种姜黄素在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用

1.本发明涉及药物应用技术领域，特别涉及一种姜黄素在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用。


背景技术：

2.随着社会的快速发展，人们因生活方式及生育年龄的改变而引起的不孕不育愈来愈严重。据统计，大约1％的育龄女性是由于早发性卵巢功能不全导致不育。早发性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，poi)，即卵巢早衰(premature ovarian failure，pof)是指女性在40岁之前卵巢生理活动衰退的临床综合征，poi的发病率占成年女性的1-4％。poi分为原发和继发性。原发性poi临床表现为没有月经和不育；继发性poi临床表现为原来有正常的月经，但过早闭经、不育。无论哪种poi，都有绝经前后症状，如过早老化，骨质疏松、肥胖等，使患者未老先衰，给身心健康带来极大痛苦。近年来研究发现poi临床表现复杂、病因复杂、异质性强且缺乏有效治疗，所以对于poi治疗的临床应用方面尚处于起步阶段，仍面临诸多困难。
3.虽然现在依赖于促性腺激素的ivf治疗已经成为了程序化的辅助生殖技术来帮助女性患者生育，但是对于一些卵巢响应匮乏(poor ovarian response,por)的病人，如poi病患来说，她们的卵巢中只有对促性腺激素不起反映的小卵泡，注射促性腺激素无法得到或只能获得非常少量的有腔卵泡，这相对于正常卵巢响应的女性所产生的20到30个有腔卵泡的差距是非常大的，这个结果也就导致了这些病人无法通过常规的ivf达到生育的目的。因而，系统研究小卵泡的激活和生长对治疗por及poi引发的不孕不育具有重要意义。但在原始卵泡激活领域的临床探究几乎空白。2008年申请人发表的science文章提出pten-pi3k控制小卵泡激活的假说，以此为理论基础，2013年斯坦福大学薛人望教授设计了卵泡体外激活技术(in vitro activation,iva)实现了治疗poi不孕问题的零突破。该技术利用腹腔镜手术取出poi患者的部分卵巢并玻璃化冷冻保存。对卵巢块进行复苏后把这些卵巢块修剪为更小的立方体以阻断hippo信号通路；同时在培养中添加pten抑制剂及pi3k激动剂以激活pi3k-akt信号通路，随后这些培养过的卵巢块会移植回poi患者的输卵管膜下以等待卵泡生长发育。待卵巢块中的卵泡发育到有腔卵泡阶段就可以取卵进行常规的ivf辅助生殖，通过这个iva技术实现了poi病人的生育。iva技术在临床试验应用的开展为poi患者生育带来曙光，为临床治疗poi生育提供了崭新的思路。
4.然而，由于在这种iva技术中使用的pten抑制剂及pi3k不是fda批准的安全药物，所以使用这些试剂处理卵巢组织存在高度致癌风险。同时，该项技术在使用时缺乏对不同poi患者个体差异的考虑，用同一种药物激活原始卵泡的治疗方法很可能导致pi3k下游分子的负反馈，从而导致原始卵泡的激活效果不理想。目前这种iva技术的成功率只有15％左右，还远远的不能满足临床需求。
5.因此，探索治疗poi及por的新的安全有效的药物尤为重要，现有技术还有待于改
进和发展。


技术实现要素：

6.鉴于上述现有iva技术的不足，本发明的目的在于提供一种姜黄素在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，旨在解决现有技术缺少安全有效的用于治疗poi及por药物的问题。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种姜黄素在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用。
9.所述的应用，其中，所述姜黄素通过促进卵巢从初级向次级卵泡发育治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏。
10.所述的应用，其中，所述治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物包括药学上可接受的载体。
11.有益效果：本发明通过研究发现姜黄素可以显著促进小鼠卵巢次级卵泡的发育，并且在随后的体内发育中可以继续发育到有腔的成熟卵泡直至排卵，这表明姜黄素可以显著促进小卵泡的作用直至排卵；同时姜黄素可以显著促进卵巢中颗粒细胞的增殖并且降低卵巢细胞的凋亡；本发明还依托医院取得人类卵巢组织进行验证，发现姜黄素能显著促进人类卵泡的生长，同时还可以增加人类卵泡的存活数量，这提示姜黄素不仅仅可以用于治疗早发性卵巢功能不全等女性不育的疾病，并且对于女性生育力保存也存在一定积极作用。
附图说明
12.图1为姜黄素在体外促进卵巢中次级卵泡的发育结果图。
13.图2为体外使用姜黄素处理促进卵泡随后在体内的发育结果图。
14.图3为姜黄素促进卵巢细胞增殖，降低细胞凋亡的结果图。
15.图4为姜黄素激活卵巢细胞内信号传导测试结果图。
16.图5为运用iva技术，姜黄素促进人类卵巢卵泡发育的结果图。
具体实施方式
17.本发明提供一种姜黄素在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
18.姜黄素已经作为一种传统的中药在降脂，抗氧化等方面发挥作用。而本技术通过一系列实验发现，姜黄素在治疗早发性卵巢功能不全(poi)及卵巢响应匮乏这类生殖方面疾病中发挥着较佳的作用。
19.基于此，本发明提供了一种姜黄素在制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物中的应用，即将姜黄素用来制备治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏的药物。
20.具体来讲，本发明通过研究发现姜黄素可以显著促进小鼠卵巢次级卵泡的发育，并且在随后的体内发育中可以继续发育到有腔的成熟卵泡直至排卵，这表明姜黄素可以显著促进小卵泡的作用直至排卵；同时姜黄素可以显著促进卵巢中颗粒细胞的增殖并且降低
卵巢细胞的凋亡；本发明还依托医院取得人类卵巢组织进行验证，发现姜黄素能显著促进人类卵泡的生长，同时还可以增加人类卵泡的数量，这提示姜黄素不仅仅可以用于治疗早发性卵巢功能不全等女性不育的疾病，并且对于女性生育力保存也存在一定积极作用。
21.在本发明中，所述治疗早发性卵巢功能不全及卵巢响应匮乏药物包括药学上可接受的载体，所述载体如赋形剂、添加剂、香味剂制成各种剂型，所述剂型包括散剂、片剂、微丸、胶囊、微囊、颗粒剂或液体等。
22.下面通过具体实施例对本发明做进一步的解释说明：
23.实施例1
24.首先获取新生七天小鼠卵巢，将这些卵巢用姜黄素处理六天后获得卵巢样本作为姜黄素处理组(curcumin)；将未经过姜黄素处理的六天后小鼠卵巢样本作为对照组(control)，通过脱水包埋切片及苏木精染色等组化实验对卵巢组织染色，结果如图1所示。从图1中a-d可以看出，相对于对照组，姜黄素处理组卵巢中大卵泡的数量(粗箭头)显著增加。随后我们进行了全卵巢组织切片计数，统计学计数结果表明，姜黄素处理组中次级卵泡的数量相对于对照组显著增加，这表明姜黄素可以显著促进小鼠卵巢从初级卵泡向次级卵泡的发育(如图1中e所示)。随后，我们统计了两组卵巢中初级卵泡和次级卵泡的卵母细胞直径，结果如图1中f所示，姜黄素处理组中初级和次级卵母细胞直径显著增大，以上结果都说明姜黄素处理可以显著促进小鼠小卵泡的发育。
25.随后，本实施例将姜黄素处理过的小鼠卵巢埋植到小鼠肾被膜下，使这些卵巢组织在小鼠体内生长，结果如图2所示，从图2中a-d可以看出埋植14或17天后，姜黄素处理组(curcumin)的卵巢大小和对照组(control)无明显差别；然而埋植21或28天后，姜黄素处理组中卵巢组织块的大小相对于对照组显著增加；统计学分析的结果也证实了这点(如图2中m所示)。随后，我们对这些卵巢组织块进行脱水包埋及苏木精染色分析，结果如图2中e-l所示，埋植14或17天后，姜黄素处理组中的卵泡形态和发育阶段与对照组相似，而埋植21或者28天后，姜黄素处理组中出现了大的有腔卵泡和黄体(箭头所示为有腔卵泡，粗箭头所示为黄体)，而对照组中大多数为次级卵泡。随后，我们对埋植21天的卵巢组织块进行全卵巢切片计数分析，统计学结果显示，如图2中n所示，姜黄素处理组中有腔卵泡和黄体的数量显著增加，这表明姜黄素在体内也可以促进小卵泡的发育直至排卵。
26.接下来，本实施例将姜黄素处理过的卵巢组织埋植回小鼠肾被膜下，在收样前两个小时对小鼠腹腔注射brdu，随后对收取的卵巢组织进行免疫荧光检测，埋植七天及十三天后，结果如图3所示。从图3中a和b可以看出，埋植七天及十三天后，姜黄素处理(curcumin)可明显增加初级和次级卵泡颗粒细胞的增殖。图3中c-f的免疫荧光结果也表明，姜黄素处理组的卵巢中卵泡颗粒细胞阳性信号(箭头指示brdu阳性信号)显著增多。
27.同时，本实施例也用western blot对卵巢细胞凋亡情况进行检测，结果发现姜黄素处理后指示凋亡的marker cleaved caspase 3的表达显著降低，如图3所示，这表明姜黄素可以显著促进卵巢中颗粒细胞的增殖并且降低卵巢细胞的凋亡。
28.实施例2
29.对姜黄素促进卵泡发育分子机制进行研究，运用western blot技术对卵泡发育重要信号通路pi3k相关分子akt,foxo3a,以及mtorc1信号通路相关分子s6k1,rps6,4e-bp1的表达进行检测，结果如图4所示，从图4中a中可以看出姜黄素处理10min开始p-akt的表达显
著增加，在处理20min时p-akt的表达达到最高。p-foxo3的表达也表现出同样的趋势；而另一条卵泡发育的重要通路mtorc1下游的p-s6k1，p-rps6，p-4e-bp1的表达却降低了，这些结果共同表明姜黄素可通过激活pi3k-akt信号通路促进卵泡的发育而不是mtorc1信号通路。随后，我们在姜黄素处理组中添加了pi3k信号通路抑制剂ly294002或mtorc1信号通路抑制剂rapamycin对p-akt的表达进行western blot检测。结果如图4中b所示，姜黄素处理组对p-akt的促进作用完全被ly294002抑制，而添加姜黄素和rapamycin处理组对p-akt的表达无影响。以上结果再次证明了姜黄素可通过激活pi3k-akt信号通路促进卵泡的发育而不是mtorc1信号通路。
30.以上结果都表明姜黄素可在体外和体内实验中促进小鼠卵巢中卵泡的发育，随后本实施例依托香港大学深圳医院收集非医学原因流产的人类胎儿卵巢样本，探究了姜黄素对人卵泡发育的影响。首先用姜黄素体外培养胎儿卵巢组织，随后将这些组织埋植到scid免疫缺陷小鼠肾被膜下，经过3-6个月的发育后，收取这些卵巢样本进行免疫组化和免疫荧光的检测，结果如图5所示，从图5中a中可以看到，姜黄素处理组(curcumin)中的卵巢组织块大小相对与对照组(control)略微降低；图5中b的统计学分析显示出同样的结果。随后，我们对这些卵巢组织块进行脱水包埋苏木精染色及免疫荧光染色。结果显示如图5中c-d所示，姜黄素处理的组织块中卵泡的数量相对于对照组有所增加。随后我们将这些切片进行生殖细胞的marker mvh的染色，免疫荧光结果如图5e-f显示，姜黄素处理组中指示生殖细胞的marker mvh的表达(图5e-f，箭头)显著增多。这些结果表明姜黄素可以显著促进人类卵泡的发育。同样，我们对这些卵巢组织块中的卵泡数量进行统计学计数，结果表明姜黄素处理组中的原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡数量都显著上升，这提示我们姜黄素不仅仅可以用于治疗早发性卵巢功能不全等女性不育的疾病，
31.并且对于女性生育力保存也存在一定积极作用。
32.应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。