DT-10在制备抗真菌药物和日用品中的应用

dt-10在制备抗真菌药物和日用品中的应用
技术领域：
1.本发明属于天然产物结构优化物领域，具体涉及天然产物木豆素c结构优化物dt-10在制备抗真菌药物或抗真菌日用品中的应用。


背景技术：

2.近年来，免疫力低下人群数量不断增加，这也导致侵袭性真菌感染越发严重。真菌感染行动基金组织(gaffi)统计数据显示，每年有超过3亿人患上严重的真菌感染疾病，其中大约有200万人会因为真菌感染而死亡。其中，念珠菌属、隐球菌属和曲霉属是三大主要致病菌属，它们能够侵袭免疫力低下人群，例如器官移植、肿瘤化疗、人类免疫缺陷病毒(hiv)感染患者，成为导致患者死亡的真正原因。
3.目前，临床上用于治疗真菌感染的药物种类较少，主要有三大类，包括唑类、多烯类和棘白菌素类。这三大类抗真菌药物不仅抗菌谱窄，而且副作用强，很难满足临床真菌治疗需求。更糟糕的是，在本就缺乏抗真菌药物的情况下，真菌耐药问题日益突出，给真菌治疗带来难度。因此，抗真菌药物的研发迫在眉睫。
4.天然产物是新药开发的重要来源。dt-10是天然产物木豆素c(longistylin c，lgc)异戊烯基环化产物，其结构优化物dt-10的结构式如下所示：
[0005][0006]
公开于专利cn102276433a中。但是本专利之前未发现任何与dt-10抗真菌的研究报道。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供化合物dt-10在制备抗真菌药物或抗真菌日用品中的应用。
[0008]
本发明通过实验表明，dt-10不仅能够抑制氟康唑敏感白色念珠菌sc5314和临床分离菌株11d、11e以及11f，而且对氟康唑耐药白色念珠菌atcc10231、cmcc(f)98001、bncc186382、bncc337321和临床分离菌株ca632、cwq1、cwq2也具有较强的抑制活性，其最小抑菌浓度mic为3.125-12.5μg/ml。作用机理研究表明，dt-10通过结合细胞膜磷脂，增加膜渗透性，降低膜流动性。同时，在16
×
mic浓度下，dt-10在20min内能够将活性菌量降低至检测线以下，故不易产生耐药性。另外，dt-10对氟康唑耐药新生隐球菌bncc339771的mic＝3.125μg/ml，对烟曲霉bncc 340016的mic＝12.5μg/ml。
[0009]
因此，本发明的第一个目的是提供化合物dt-10在制备抗真菌药物中的应用；
[0010]
所述的化合物dt-10的结构式如下所示：
[0011][0012]
本发明的第二个目的是提供一种抗真菌感染的药物，其含有化合物dt-10作为活性成分。
[0013]
优选，所述的药物以化合物dt-10为活性成分和其他药物赋形剂或载体制成。
[0014]
优选，所述的真菌包括但不限于白色念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉感染。
[0015]
优选，所述的药物可以是颗粒剂、胶囊剂、片剂、散剂、滴丸剂、缓释剂或注射剂中的任意一种或多种。
[0016]
本发明第三个目的是提供一种防止真菌感染或污染的日用品，其含有化合物dt-10作为活性成分。
[0017]
优选，所述的真菌包括但不限于白色念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉感染。
[0018]
优选，所述的日用品包括但不限于包括但不限于衣物消毒液、洗手消毒液、化妆品、洗发水、阴道洗液或漱口水。
[0019]
化合物dt-10是天然产物木豆素c结构优化物，具有比lgc更低的细胞毒性(shan yan，et al.chinese journal of natural medicines.2015)。进一步研究发现，dt-10对白色念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉具有较强抑制活性，可用于制备抗真菌的药物或抗真菌日用品。
附图说明：
[0020]
图1是dt-10结合细胞膜磷脂活性图，注：pg，phosphatidylglycerol，磷脂酰甘油；pe，phosphatidylethanolamine，磷脂酰乙醇胺；cl，cardiolipin，心磷脂。
[0021]
图2是dt-10增大细胞膜渗透性图。
[0022]
图3是dt-10降低细胞膜流动性图。
[0023]
图4是dt-10和lgc溶血活性测定图，注：t，代表triton-x-100。
[0024]
图5是dt-10杀菌时间图。
具体实施方式：
[0025]
下面通过实施例进一步描述本发明，但本发明并不局限于这些实施方式，任何在本实施例基本精神层面的改进或代替，仍属于本发明权利要求所保护的范围。
[0026]
实施例1：dt-10抑菌活性测定
[0027]
1、仪器和设备
[0028]
96孔细胞培养板(康宁)、生物安全柜、恒温振荡器、恒温培养箱、万分之一天平。
[0029]
2、菌株
[0030]
白色念珠菌(candida albicans)标准菌株sc5314由安徽中医药大学邵菁教授惠赠，bncc菌株购买于北纳生物-河南省工业微生物菌种工程技术研究中心，白色念珠菌临床
分离菌株ca632、cwq1、cwq2、11d、11e、11f由山东大学常文强副教授惠赠，其他菌种为实验室保存菌株。
[0031]
3、试剂配制
[0032]
(1)dt-10母液和工作液配制：称取化合物dt-10粉末10mg，溶解于1ml dmso(麦克林公司)，即得到10mg/ml dmso母液，-20℃保存。取母液40μl，加入80μl dmso，即得到4mg/ml工作液。
[0033]
(2)抗生素母液配制：氟康唑(fluconazole)、两性霉素b(amphotericin b)和制霉菌素(nystatin)母液和工作液配制方法同dt-10。
[0034]
(3)rpmi-1640培养基：称取rpmi-1640粉末10.4g和mops粉末34.53g，加入1l灭菌去离子水，完全溶解后用naoh调节ph至7.0。用0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，4℃保存。
[0035]
(4)ypd固体培养基：称取蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母提取物10g、琼脂粉20g，加入1l去离子水，高温高压灭菌。
[0036]
(5)ypd液体培养基：称取蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母提取物10g，加入1l去离子水，高温高压灭菌。
[0037]
(6)pda固体培养基：马铃薯200g切成小块，加入800ml去离子水煮沸20min，纱布过滤，称取葡萄糖20g和琼脂15～20g，加入到滤液中，去离子水定容至1l，高温高压灭菌。
[0038]
4、实验方法
[0039]
(1)白色念珠菌和新生隐球菌测试方法：
[0040]
将白色念珠菌和新生隐球菌接种于ypd固体培养基，30℃，培养2d。挑取菌落于ypd液体培养基，30℃，200rpm，培养至指数生长后期。取该菌液10μl再次接种于1ml ypd液体培养基，30℃，200rpm，培养至指数生长期。血细胞计数板计数，用rpmi-1640培养基调整菌液浓度为1
×
104cfu/ml。96孔细胞培养板第一行加入195μl菌液和5μl待测化合物工作液，其余孔各加入100μl菌液，取第一行孔中的液体100μl于第二行孔中，依次二倍梯度稀释。将96孔细胞培养板置于37℃恒温培养箱中，白色念珠菌24h后观察最小抑菌浓度mic值，新生隐球菌48h后观察mic值。肉眼观察每孔菌生长情况，以不生长菌落孔对应的浓度为最小抑菌浓度。
[0041]
(2)烟曲霉测试方法：
[0042]
将烟曲霉接种到pda培养基，置于30℃培养5d，用prmi-1640培养基冲洗平板，获得孢子悬浮液，血细胞计数板计数，将孢子悬浮液浓度调整为1
×
105cfu/ml。化合物对烟曲霉的抑制活性测定方法同白色念珠菌。
[0043]
5、实验结果
[0044]
表1
[0045][0046]
如表1所示，dt-10对新生隐球菌、烟曲霉和白色念珠菌都具有较强的杀菌活性，其mic值为3.125-12.5μg/ml。其中，新生隐球菌bncc 339771、烟曲霉bncc 340016、白色念珠菌(atcc10231、cmcc(f)98001、bncc 186382和bncc 337321)以及白色念珠菌临床分离菌株(ca632、cwq1和cwq2)皆为氟康唑(fcz)耐药菌株，dt-10对这些菌株都有抑制活性。
[0047]
实施例2：dt-10结合细胞膜磷脂
[0048]
1、试剂
[0049]
细胞膜磷脂成分磷脂酰甘油(sigma-aldrich,841188p)和磷脂酰乙醇胺(sigma-aldrich,840027p)溶解于甲醇，心磷脂(sigma-aldrich，c1649)为5mg/ml乙醇溶液，麦角甾醇(alfa，ab0565)溶解于乙醇。
[0050]
2、实验方法
[0051]
使用棋盘肉汤稀释法探究不同细胞膜成分对dt-10和两性霉素b抗菌活性的影响。在96孔板中加入50μl rpmi-1640培养基，第一行前10个孔中加入相应浓度的dt-10或两性霉素b，第一行后两个孔中加入待研究细胞成分，依次向下倍比稀释至第八行。在第一列各孔中加入对应浓度待研究细胞成分，依次从左到右倍比稀释至第8列，室温孵育3h。随后，第10和12列加入50μl rpmi-1640培养基，其他列全部加入50μl稀释好的白色念珠菌sc5314菌液。96孔板置于37℃培养18h后测定od
600
吸光度。
[0052]
3、实验结果
[0053]
两性霉素b为多烯类抗真菌药物，它能够结合真菌细胞膜上的麦角甾醇，进而改变真菌细胞膜的通透性。如图1所示，体系中加入麦角甾醇能够明显降低两性霉素b抑菌活性，而细胞膜磷脂(心磷脂、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油)对其活性没有显著影响。与两性霉素b相反，细胞膜磷脂能够明显降低dt-10抑菌活性，而麦角甾醇对其影响不明显。
[0054]
实施例3：dt-10增大细胞膜渗透性
[0055]
1、实验方法
[0056]
稀释好的白色念珠菌sc5314菌液分别加入终浓度1/2
×
mic的dt-10或氟康唑，阴性对照加入等体积dmso。同时加入终浓度为80μg/ml的dapi和10μm的sytox-green，37℃摇菌5、15、30、60min取样，pbs缓冲液清洗后分别测定激发波长364nm/发射波长454nm和激发波长488nm/发射波长538nm处的荧光强度。
[0057]
2、实验结果
[0058]
氟康唑(fcz)能够特异性干扰真菌细胞色素p450，进而抑制细胞膜上麦角固醇的合成并杀死真菌细胞。如图2所示，与阴性对照dmso组相比，随着氟康唑处理时间延长，细胞中荧光强度增加不明显，而dt-10处理5min便可导致荧光强度显著增加，说明dt-10能够破坏细胞膜，增加膜渗透性。
[0059]
实施例4：dt-10降低细胞膜流动性
[0060]
1、实验方法
[0061]
稀释好的白色念珠菌sc5314菌液加入终浓度2μmol/l的laurdan染液(dmso溶解)，37℃摇菌10min后菌液加入终浓度1/2
×
、1
×
、2
×
mic的dt-10，加入终浓度50mm的苯甲醇(benzyl alcohol)为阳性对照，加入等体积dmso为阴性对照。处理40min后pbs缓冲液清洗，酶标仪分别测定激发波长350nm/发射波长435nm和激发波长350nm/发射波长500nm处的荧光强度，计算广义偏振度gp值，gp＝(435nm荧光强度-500nm荧光强度)/(435nm荧光强度+500nm荧光强度)。gp值为-1和+1分别代表最高和最低膜流动性。
[0062]
2、实验结果
[0063]
如图3所示，dt-10能够明显降低细胞膜流动性，而且随着dt-10浓度增加，流动性降低越明显。
[0064]
实施例5：dt-10和lgc溶血活性测定
[0065]
1、实验方法
[0066]
无菌脱纤维羊血pbs清洗三次后加入二倍梯度稀释的dt-10或lgc，37℃孵育1h，2500rpm离心，吸取上清测定543nm吸光度。等体积dmso为阴性对照，0.2％triton-x-100为阳性对照。每个样品3个技术重复，实验进行3次生物学重复。
[0067]
2、实验结果：
[0068]
如图4所示，在浓度为256μg/ml(白色念珠菌mic值的40倍)时，dt-10溶血活性可忽略，而lgc却表现出明显增高的溶血活性。
[0069]
实施例6：杀菌时间测定
[0070]
1、实验方法
[0071]
调整好的白色念珠菌sc5314菌液分别加入终浓度为8
×
和16
×
mic的dt-10、制霉菌素(nst)、两性霉素b(amp)、氟康唑(fcz)和5-氟胞嘧啶(5-f)，加入等体积的dmso为阴性对照。37℃摇菌处理20min后分别10倍梯度稀释进行菌落平板计数。
[0072]
2、实验结果
[0073]
两性霉素b和制霉菌素能够结合细胞膜上的麦角甾醇，增强细胞膜渗透性，进而将细胞杀死；氟康唑通过干扰真菌细胞色素p450抑制麦角甾醇的合成,从而起到灭杀真菌细胞的作用；5-氟胞嘧啶通过干扰dna和蛋白质合成来发挥抗真菌作用。通过作用方式可知，两性霉素b和制霉菌素能够直接杀菌，因此在该两种药物处理下细胞快速死亡。而氟康唑和5-氟胞嘧啶通过抑制细胞成分合成方式导致细胞死亡，因此在这两种药物处理下细胞死亡速度相对较慢。如图5所示，dt-10表现出比制霉菌素和两性霉素b更快的杀菌速度，在16
×
mic处理浓度下，20min内dt-10能够将活性菌量降低至检测线以下。