动物双歧杆菌A6在治疗肌少症中的应用

动物双歧杆菌a6在治疗肌少症中的应用
技术领域
1.本公开涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种动物双歧杆菌a6在治疗肌少症中的应用。


背景技术：

2.近年来，随着人口老龄化的进展，肌少症的发病率逐步升高，严重威胁着中老年人生命健康，并带来沉重经济负担。目前，针对肌少症治疗方案较少，主要为非药物治疗，如营养支持、康复训练等方式。这些方法过程繁琐、花费时间长、效益稍低。因此，探索出一系列有效治疗肌少症的外源性干预策略，对肌少症的临床治疗具有重要指导意义。


技术实现要素：

3.为解决现有问题，本公开提供动物双歧杆菌a6在制备治疗和/或预防肌少症的药物中的应用和动物双歧杆菌a6在制备治疗和/或预防由炎症性肠病诱导的肌少症的药物中的应用。
4.在本公开实施例中，药物还包括药用辅料。
5.在本公开实施例中，药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、ph值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂以及释放阻滞剂。
6.在本公开实施例中，药物还包括药物载体。
7.在本公开实施例中，药物载体包括纳米粒和脂质体。
8.在本公开实施例中，药物的剂型包括注射液、注射用冻干粉针、混悬剂、植入剂、栓塞剂、胶囊剂、片剂、丸剂和口服液。
9.本公开的应用方案简便、效果显著，可缓解炎症性肠炎病变进展，改善疾病虚弱状态；同时，可改善肌肉功能(包括抓力、耐力等肌肉功能指标)，逆转肌萎缩进展过程，延缓肌肉量丢失状态，促进肌纤维类型转换(往ii型转换)。本公开对于肌少症或肌萎缩相关疾病的临床干预具有较高的参考价值，简便易行，适于推广应用。
附图说明
10.下面参照附图将对发明的特征、优点以及示例性实施方式的技术上和工业上的意义进行描述，在附图中，相同的附图标记指示相同的元件。
11.图1示出本公开实施例的动物双歧杆菌a6的生长曲线。
12.图2示出本公开实施例的动物双歧杆菌a6对小鼠体重的影响。
13.图3至图5示出本公开实施例的动物双歧杆菌a6对肠道上皮组织损伤的缓解作用。
14.图6示出本公开实施例的动物双歧杆菌a6对小鼠耐力的维持作用。
k2hpo4，2g柠檬酸二铵，5g乙酸钠，20g葡萄糖，0.58g mgso4·
7h2o，0.20g mnso4·
h2o，1ml吐温80，加入1l蒸馏水混合煮溶冷却至室温后，加入0.5g半胱氨酸盐酸盐，用1mol/l盐酸及1mol/l naoh分别调ph至6.5，加入15g琼脂粉，分装至三角瓶中，121℃灭菌15min。
30.3.实验菌株及处理
31.3.1受试菌株：双歧杆菌是人体肠道的原籍菌，具有多种益生功能，如调节肠道菌群平衡，增强机体免疫力，缓解腹泻，降低胆固醇等。动物双歧杆菌a6，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(china general microbiological culture collection center,cgmcc)，编号cgmcc no.9273，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年6月5日，分类命名：动物双歧杆菌乳酸亚种bifidobacterium animalis subsp.lactis。
32.3.2菌株处理：实验室用脱脂乳甘油冻存管保存菌株，脱脂乳甘油冻存菌种的活化可将冻存的菌种取出后置于室温融化，于无菌环境中以1％的接种量接种于厌氧mrs液体培养基中进行培养。冻干菌粉状态的菌种需要在无菌环境中对安瓿管外侧进行消毒后，敲碎安瓿管上端，加入少量无菌的mrs培养基重悬菌粉，而后将菌液接种于厌氧mrs液体培养基中。37℃厌氧培养12h，连续活化两代，第三代培养液用于后续试验，使菌浓度达到10
10
cfu/ml，菌液在室温下以2000
×
g离心15min，收集菌体。收获的菌体以生理盐水洗涤两次后重悬于生理盐水，使用时将菌悬液倍比稀释成10
10
cfu/ml浓度。
33.4.炎症性肠病诱导小鼠肌少症模型的建立
34.采用右旋糖酐硫酸钠(dextran sodium sulfate，dss)饮水，每日记录小鼠体重、粪便隐血等疾病活动指数(disease activity index,dai)情况，小鼠饮水14天后处死取材、功能评价。dss诱导的小鼠结肠炎模型与人溃疡性结肠炎(uc)病症相似，同时伴随着肌肉功能质量的下降，是研究益生菌对uc作用及肌肉质量作用效果的良好模型。dss造模期间会导致小鼠体重减轻，随炎症程度增加伴随结肠变短，直肠出血直至小鼠死亡。在炎症性肠病进展过程中，小鼠肌肉功能及肌肉质量均表现出降低趋势。
35.5.实验分组和剂量设置
36.将10周龄c57bl/6j小鼠随机分为3组(灌胃生理盐水的未造模组、灌胃生理盐水的模型组、灌胃动物双歧杆菌a6的模型组)，每组10只，5只一笼饲养。室温22
±
2℃，12h光照/黑暗循环。每只小鼠每天灌胃0.2ml相应溶液(菌的浓度为10
10
cfu/ml)。固定时间段灌胃，持续2周。
37.6.样本收集
38.每日收集小鼠粪便样本，结合小鼠体重、粪便粘稠度、隐血情况评价小鼠肠炎状态。给药2周后，将小鼠用乙醚麻醉后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，进行后续解剖。
39.(1)留取小鼠血液约0.8ml/只，将血液静置2h后，600
×
g离心10min得到血清，留存于-80℃，用于血液中炎症因子、代谢产物的检测。
40.(2)留取粪便样品置于-80℃冻存，用于后续分析。
41.(3)解剖肠道组织，测量肠组织长度；摘下盲肠，称取重量，并用相机记录盲肠形态；距盲部1cm取回肠2cm，靠近盲肠下端1cm处取近端结肠2cm，分别浸泡在4％福尔马林液固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片厚度5μm，用于后一部分置于组织固定液，用于后续组织学分析；收集小鼠的盲肠内容物，装于无菌离心管后转移至-80℃，用于后期菌群dna提取
及高通量检测。解剖心、肝、脾、肺、肾等器官，观察脏器大小，记录异常现象。
42.7.腹泻情况评价
43.每天观测各组小鼠的临床表现，包括精神状态、粪便形态、肛门红肿等现象，进行疾病活动指数评分(disease activity index,dai)。
44.8.小鼠肌肉功能性评价
45.8.1小鼠耐力评价
46.将小鼠放在小鼠专用跑步机上的跑道上，将速度设置为梯度增加，跑步机的后缘设置有电击系统，若小鼠处于疲劳状态或停止跑步时间大于5s，则可认为处于耐力耗竭状态，记录此时的跑步距离为最大跑步距离，此时的时间为耗竭时间，此时的速度为最大跑步速度。
47.8.2小鼠握力评价
48.小鼠握力用小鼠专用电子握力计测量。小鼠被缓慢放在篱笆上，慢慢均匀用力地向后拉，用力方向平行于地面并垂直于测试面板。测量重复3次，取最大值。
49.9.肌肉样本评价
50.解剖小鼠的比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌、股四头肌，一部分采用冰冻包埋，用于后续组织切片、病理学染色，一部分置于-80℃冻存，用于后续基因和蛋白分析。
51.10.动物双歧杆菌a6的生长曲线测定
52.为确定动物双歧杆菌a6的生长状况，明确后续研究的采样时间，发明人测定了动物双歧杆菌a6的生长曲线。将动物双歧杆菌a6活化后以1％接种量接种于新的厌氧mrs培养基中，于不同时间点取样测定其od600值及ph值，绘制其生长曲线。动物双歧杆菌a6的生长曲线如图1所示，接种初始培养液的od600值为0.047。0～2h，od600增长缓慢，说明菌株处于迟滞期，od600值为0.068。2h后od600出现较快增长，由迟滞期进入对数期。6h左右到达对数中期，此时培养液的od600为0.778。在12h左右od600增长放缓，进入稳定期，此时培养液的od600为1.684；在12-24h，培养液的od600趋于平缓，最终达到1.924。
53.11.动物双歧杆菌a6对小鼠体重、疾病活动指数(dai)的影响
54.dss诱导的小鼠结肠炎模型与人溃疡性结肠炎(uc)病症相似，同时伴随着肌肉功能质量的下降，是研究益生菌对uc作用及肌肉质量作用效果的良好模型。dss造模期间会导致小鼠体重减轻，随炎症程度增加伴随结肠变短，直肠出血直至小鼠死亡。在炎症性肠病进展过程中，小鼠肌肉功能及肌肉质量均表现出降低趋势。在本研究中，给予dss造模4天后，体重开始呈现缓慢下降趋势；从第8天开始，体重逐渐明显下降(约下降3％)；第10天，体重下降为8％左右；第14天，体重约下降15％。而对模型组给予动物双歧杆菌a6干预后，在第14天，小鼠体重仅丢失6％左右(如图2所示)。随着小鼠炎症程度逐步增加，可观察到普遍的直肠出血，dia评分可升至8.5分，而给予动物双歧杆菌a6干预后，其dai评分可降至6分。解剖后发现dss组小鼠结肠长度4-5cm，显著低于正常组小鼠结肠长度7cm，出现明显的结肠变短，而给予动物双歧杆菌a6干预后，小鼠结肠长度可为6cm。以上结果表明，在灌胃动物双歧杆菌a6的实验组中均得到缓解，具体表现为显著减少小鼠体重丢失状态，降低dai评分升高趋势，增加结肠长度，说明动物双歧杆菌a6干预起到了缓解dss诱导的肠炎作用效果。
55.12.动物双歧杆菌a6对肠道上皮组织损伤的缓解作用
56.为进一步直观分析dss造模前后肠道组织损伤状态及其变化的直接诱因，我们对
末端结肠进行h&e染色分析观察组织损伤状态，结合阿利新蓝染色观察黏液层分布，并通过pas染色对隐窝中杯状细胞进行计数，结果如图5所示。正常组肠壁结构完整，肠上皮细胞中柱状细胞整齐排列，隐窝明显，无炎症细胞浸润；黏液层分布紧凑，隐窝中多见pas+杯状细胞分布。dss处理后肠壁结构破坏，隐窝局部或大部分缺失，粘液层分布大量减少，pas+杯状细胞急剧减少。而动物双歧杆菌a6干预后则能够对上述症状起到缓解作用，具体体现在he染色组织学评分显著降低(如图3所示)；黏液层分布增加；粘蛋白muc2 mrna表达量显著提高；每隐窝中pas+细胞显著增加(如图4所示)。
57.13.动物双歧杆菌a6对小鼠握力的恢复作用
58.为更加直观观察分析小鼠肌力变化，本公开实施例将不同分组灌胃实验的小鼠在不同时间点，连续动态进行了握力评价，以便直观观察到小鼠的握力动态变化。至第6天，dss造模组开始出现握力下降趋势，并在第8天(为290gf)进一步下降(第14天为200gf)。我们显著观察到，给予动物双歧杆菌a6干预后的小鼠，其握力虽也处于下降趋势，但始终能够维持在相对较高水平，且给予动物双歧杆菌a6干预组与单纯dss造模组相比具有统计学差异(p《0.05)(如图5所示)，由此可知，动物双歧杆菌a6对于小鼠肌力(握力)的维持具有重要作用。
59.14.动物双歧杆菌a6对小鼠耐力的维持作用
60.除了握力指标外，本公开实施例进一步纳入耐力指标，以此来进一步完善对小鼠肌力功能的评价。对不同分组小鼠给予不同干预措施，至第14天后，将小鼠置于小鼠跑步机，观察小鼠的跑步状态，主要体现为最大跑步距离、耗竭时间、最大速度等指标。dss造模组小鼠的最大跑步距离较小、耗竭时间较短、最大跑步速度较小，而给予动物双歧杆菌a6干预后的小鼠，可表现为增加最大跑步距离、延长耗竭时间、且可增加最大跑步速度，以上指标在单纯dss造模组和动物双歧杆菌a6干预组中具有统计学差异(p《0.05)(如图6所示)，由此可知，动物双歧杆菌a6对于小鼠肌肉耐力的维持具有重要作用。
61.15.动物双歧杆菌a6对小鼠肌肉重量的影响
62.为进一步直观分析dss造模后及动物双歧杆菌a6干预后肌肉重量的变化，我们将不同分组的小鼠在第14天处死，对肌肉(股四头肌、腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌、趾长伸肌)进行取材、称重、分析。在不同分组中，腓肠肌、股四头肌表现出重量的差异(dss造模组表现为两种肌肉重量下降，动物双歧杆菌a6干预组表现为肌肉重量的恢复)(如图7所示)，而比目鱼肌、胫骨前肌、趾长伸肌并未显示出组间的差异。由此说明，给予动物双歧杆菌a6干预后，可在一定程度上提升肌肉重量，从而促进肌力恢复。
63.16.动物双歧杆菌a6对小鼠肌纤维损伤状态的影响
64.基于上述肌肉重量改变的结果，本公开实施例进一步在组织病理学层面探究动物双歧杆菌a6影响肌再生功能的具体机制。对腓肠肌取材、包埋，行he染色后，dss造模组小鼠表现为肌纤维肌膜排列紊乱、肌纤维横截面积、直径变小，而给予动物双歧杆菌a6干预后，可缓解肌纤维损伤状态、促进肌纤维直径增粗，表现为肌纤维横截面积增大(如图8所示)。
65.17.动物双歧杆菌a6对肌纤维类型转换的影响
66.骨骼肌是一种动态的多样化的组织，肌纤维类型和肌纤维蛋白同工型的多种多样，可适应于不同的功能要求。为进一步揭示动物双歧杆菌a6调节肌再生功能的潜在机制，结合骨骼肌形态学特征、机能及代谢生化特性，我们对小鼠腓肠肌肌纤维进行病理学肌纤
维类型染色。根据代谢酶活性特征结合骨骼肌收缩快慢特性，小鼠骨骼肌纤维可分为四类：慢收缩氧化型(i型)、快收缩氧化型(iia型)、快收缩氧化酵解型(iix型)、快收缩酵解型(iib型)。其中，i型肌纤维相当于红肌纤维，iia型肌纤维和iix型肌纤维相当于中间型肌纤维，iib型肌纤维相当于白肌纤维。dss造模组小鼠表现为i型、iia型肌纤维比例升高，iix型、iib型肌纤维比例降低，而动物双歧杆菌a6干预组小鼠表现为i型、iia型肌纤维比例降低，iix型、iib型肌纤维比例升高。以上结果提示，dss造模组肌纤维类型转换顺序为从iib型、iix型至iia型、i型，而给予动物双歧杆菌a6干预后肌纤维类型转换顺序为从i型、iia型至iix型、iib型(如图9所示)。
67.综上，本公开采用灌胃4
×
10
10
cfu的动物双歧杆菌a6，实验发现动物双歧杆菌a6干预起到了缓解dss诱导的肠炎作用效果，具体体现在显著缓解小鼠体重减少状态，降低dai评分升高趋势，增加结肠长度和减少脾增大。同时本公开发现动物双歧杆菌a6干预能够降低肠通透性的增加；减少肠上皮组织损伤，增加黏液层分布和隐窝中杯状细胞数量。更为重要的是，动物双歧杆菌a6的干预可以显著促进肌力的恢复(包括耐力、握力等)，增加肌肉质量，同时，可修复肌损伤相关状态，调节肌纤维转换趋势，起到保护肌肉、促进肌肉功能恢复的作用，以上结果为动物双歧杆菌a6缓解dss诱导的肌少症可能作用机制提供参考价值与借鉴意义。
68.应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
69.在本说明书中，每当提及“示例性实施方式”、“优选实施方式”、“一个实施方式”等时意味着针对该实施方式描述的具体的特征、结构或特点包括在本发明的至少一个实施方式中。这些用词在本说明书中不同地方的出现不一定都指代同一实施方式。此外，当针对任一实施方式/实施方式描述具体的特征、结构或特点时，应当认为本领域技术人员也能够在全部所述实施方式中的其它实施方式中实现这种特征、结构或特点。
70.以上详细描述了本发明的实施方式。然而，本发明的方面不限于上述实施方式。在不脱离本发明的范围的情况下，各种改型和替换均可以应用到上述实施方式中。