10-姜酚在制备增加紫杉醇抗肿瘤活性的药物中的应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及10-姜酚在制备增加紫杉醇抗肿瘤活性的药物中的应用。


背景技术：

2.乳腺癌是全球发病率最高的癌症，也是导致女性癌症死亡的主要原因之一。三阴性乳腺癌缺乏her2、pr和er表达，是最具侵袭性的乳腺癌亚型，我国三阴性乳腺癌发病率高达12.6万/年。三阴性乳腺癌具有高复发率和高死亡率的临床特点。由于其缺乏有效的药物靶点，化疗依然是其主要的治疗手段。其中，紫杉烷类药物(紫杉醇)是经典的化疗药物。然而，这些化疗药物副作用严重，大剂量化疗往往会导致疾病复发和耐药性。而紫杉类药物易出现耐药性(耐药率达50％)，导致治疗效失败，因此，探索逆转化疗药物耐药的方法，挖掘化疗“增效剂”，提高紫杉类药物疗效，改善患者预后，对于三阴性乳腺癌治疗具有重要意义。然而，目前全球范围内仍无低毒药物能同时逆转耐药，而又不降低紫杉类药物的临床疗效。


技术实现要素：

3.基于此，本发明的目的在于提供10-姜酚在制备增加紫杉醇抗肿瘤活性的药物中的应用。10-姜酚能有效提高三阴性乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性，可作为化疗“增效剂”，提高紫杉醇的化疗效果。
4.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案。
5.10-姜酚在制备增加紫杉醇抗肿瘤活性的药物中的应用。
6.在一些实施例中，所述肿瘤为乳腺癌。
7.在一些实施例中，所述乳腺癌为三阴性乳腺癌。
8.在一些实施例中，所述药物可以提高紫杉醇抑制肿瘤细胞增殖的能力。
9.在一些实施例中，所述药物可以促进紫杉醇诱导的肿瘤细胞凋亡。
10.本发明还提供了一种抗肿瘤组合物，所述抗肿瘤组合物包含10-姜酚和紫杉醇。
11.在一些实施例中，所述肿瘤为乳腺癌。优选地，所述肿瘤为三阴性乳腺癌。
12.本发明还提供了一种抗肿瘤药物，所述抗肿瘤药物包含上述抗肿瘤组合物和药物学上可接受的载体。
13.在一些实施例中，所述肿瘤为乳腺癌。优选地，所述肿瘤为三阴性乳腺癌。
14.本发明提供了10-姜酚在作为紫杉醇抗肿瘤药物中的应用。发明人结合体外与体内实验创新性地发现，10-姜酚能有效提高紫杉醇抑制三阴性乳腺癌细胞增殖的能力和促进紫杉醇诱导的三阴性乳腺癌细胞凋亡，从而有效抑制三阴性乳腺癌细胞的生长，减小肿瘤的体积；但是10-姜酚不会增加紫杉醇的毒副作用，安全性好。10-姜酚是天然植物生姜的提取物，目前已有商业化提取工艺进行成分提取，安全性高，开发利用的前景好。本发明为10-姜酚作为低毒有效的化疗增效剂的临床转化提供重要的支撑和创造更多的经济价值，
也为基于天然植物开发新药提供更广阔的市场前景。
附图说明
15.图1为10-姜酚联合紫杉醇处理对三阴性乳腺癌细胞增殖和集落形成的影响结果图；其中，a：细胞增殖结果；b：细胞集落形成结果。
16.图2为10-姜酚联合紫杉醇处理对三阴性乳腺癌细胞凋亡的影响结果图；其中，a：流式细胞术检测结果；b：统计图；c：凋亡蛋白的wb检测结果图。
17.图3为10-姜酚对乳腺癌异种移植瘤的体内化学增敏作用结果图；其中，a：肿瘤大小；b：肿瘤体积和小鼠体重检测结果；c：肿瘤细胞凋亡检测结果。
18.图4为10-姜酚联合紫杉醇对小鼠肝脏、肾脏的毒性评价结果；其中，a：肝脏h&e染色结果；b：肾脏h&e染色结果。
具体实施方式
19.本发明下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
20.除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
21.10-姜酚，英文名称为10-gingerol(本发明简称10-g)，分子式为c
21h34
o4，是生姜中的主要刺激性成分。
22.紫杉醇，英文名称为taxol；别名泰素、紫素、特素；化学名称为5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉烷-11-烯-9-酮-4,10-二乙酸酯-2-苯甲酸酯-13[(2'r,3's)-n-苯甲酰-3-苯基异丝氨酸酯]；分子量为853.92；分子式c
47h51
no
14
。
[0023]
下面结合具体实施例进行说明。
[0024]
实施例1
[0025]
利用10-姜酚与紫杉醇联合处理三阴性乳腺癌细胞，检测乳腺癌细胞的增殖、毒性和凋亡情况。
[0026]
一、细胞增殖和毒性
[0027]
实验分组：taxol组和taxol+10-g组。分别使用taxol和taxol+10-g处理三阴性乳腺癌细胞株mda-mb-231和sum-159，同时使用非肿瘤乳腺上皮细胞mcf-10a作为对照。将mda-mb-231、sum-159和mcf-10a细胞接种到培养板中，培养12h后三种细胞分别给药不同浓度的taxol和taxol+10-g，药物在细胞培养体系中的终浓度分别如下：taxol组：0nm、25nm、50nm、100nm、200nm、400nm；taxol+10-g组：taxol 0nm+10-g 0um、taxol 25nm+10-g25um、taxol 50nm+10-g 50um、taxol 100nm+10-g 100um、taxol 200nm+10-g 150um、taxol400nm+10-g 200um。其中，taxol 0nm和taxol 0nm+10-g 0um中加入不含任何药物的培养基(含10v/v％fbs)处理细胞。
[0028]
加入药物处理48h后，收集各组细胞，利用cck8试剂盒对细胞活性进行检测，操作严格按照说明书进行。
[0029]
采用中位药效(chou-talalay)联合指数法计算10-姜酚和紫杉醇的药物联合作用
指数(combined index，ci)，计算公式如下：
[0030][0031]
其中，(d)1和(d)2分别为联合用药时10-姜酚和紫杉醇的用药剂量；(d)1和(d)2分别为10-姜酚和紫杉醇联合用药时产生相等效应的剂量。
[0032]
判断标准为：ci》1.1、ci＝0.9-1.1和ci《0.9分别表示拮抗、加和和协同作用。
[0033]
结果如图1所示，与单纯使用紫杉醇(taxol组)相比，10-姜酚联合低剂量紫杉醇(taxol+10-g组)对细胞增殖的抑制作用明显增强；ci协同作用分析表明10-姜酚显著增加了紫杉醇对于三阴性乳腺癌细胞的细胞毒性；此外，10-姜酚既没有对非肿瘤乳腺上皮细胞mcf-10a产生细胞毒性作用，也没有增强紫杉醇的细胞毒性(图1a)。此外，克隆形成实验表明，药物干预48h后，将培养基换成不含药的培养基继续培养14天，紫杉醇单独处理组mda-mb-231和sum-159细胞的克隆形成减少；而10-姜酚和紫杉醇联合处理组mda-mb-231和sum-159细胞的克隆数量明显少于紫杉醇单组处理组(图1b)。这些结果表明，10-姜酚能增加mda-mb-231和sum-159细胞对紫杉醇的敏感性，并且安全性高。
[0034]
二、细胞凋亡
[0035]
实验分组：(1)mda-mb-231细胞：对照组(control)、taxol 100nm组、taxol 100nm+10-g50um组。(2)sum-159细胞：对照组(control)、taxol 100nm组、taxol 100nm+10-g 100um组。将mda-mb-231和sum-159细胞接种到培养板中，细胞达到70％融合度后细胞分别给与对照培养基(含10v/v％fbs)、taxol或taxol 100nm+10-g。药物处理24h后收集细胞，使用流式细胞术检测细胞的凋亡情况，使用western blot法检测凋亡相关蛋白(cleaved-parp、bax、bcl-2)的表达。
[0036]
结果表明，与单独使用紫杉醇处理相比，10-姜酚和紫杉醇联合处理显著地增加了mda-mb-231和sum-159细胞的凋亡率(图2a-b)。凋亡相关蛋白检测结果表明，与单独使用紫杉醇处理相比，联合使用10-姜酚和紫杉醇处理的细胞，cleaved-parp和bax蛋白水平显著增加，bcl-2的表达降低(图2c)。上述结果表明10-姜酚可以协同促进紫杉醇诱导的细胞凋亡。
[0037]
实施例2
[0038]
10-姜酚协同紫杉醇可以抑制小鼠体内三阴性乳腺癌的生长。
[0039]
选取15只6周龄、雌性小鼠(nod/scid)，分为以下3组：对照组(vehicle)、紫杉醇组(taxol)以及紫杉醇联合10-姜酚组(taxol+10-g)，每组各5只nod/scid小鼠，构建皮下移植瘤模型：(1)三阴性乳腺癌细胞mda-mb-231重悬于pbs缓冲液中，并按1:1与基质胶混合，每只小鼠皮下注射2
×
106个癌细胞。(2)用25g针头的微注射器取重悬细胞对小鼠进行皮下注射。(3)给药处理：皮下注射4天后，开始用灌胃或腹腔注射的方式给药。对照组用pbs(0.25ml/小鼠)每天一次灌胃。紫杉醇组用10mg/kg紫杉醇溶液腹腔注射，每3天给药一次。紫杉醇联合10-姜酚组，采用40mg/kg10-姜酚溶液灌胃，每天给药一次；用10mg/kg紫杉醇溶液腹腔注射，每3天给药一次。肿瘤种植后，每3天测量肿瘤体积及小鼠体重。肿瘤种植33天后，将小鼠安乐死并将肿瘤取出。运用tunel染色和免疫组织化学法从分子层面检测肿瘤的生长及凋亡情况。运用he染色法检测肝脏和肾脏的形态改变。操作严格按照说明书进行。
[0040]
如图3所示，与对照组及紫杉醇治疗组相比，紫杉醇与10-姜酚联合治疗组表现出明显的肿瘤生长抑制作用，肿瘤体积明显减小；药物治疗29天后，单独使用紫杉醇的小鼠体重略有减轻，但10-姜酚与紫杉醇联合使用时，紫杉醇诱导的体重减轻没有加剧(图3a-b)。并且，在治疗期间，小鼠并没有表现出皮肤溃疡、腹泻和中毒死亡等不良反应。
[0041]
tunel实验和免疫组织化学检测提示，紫杉醇与10-姜酚联合治疗可显著增加肿瘤细胞的凋亡率，并降低增殖因子ki67的表达(图3c)。
[0042]
如图4所示，各组病理h&e染色分析中并没有观察到肝、肾组织在形态上存在病理变化(图4a-b)。并且，组间肝脏和肾脏指数也没有明显差异(图4a-b)。
[0043]
以上结果提示10-姜酚在三阴性乳腺癌紫杉醇化疗中具有潜在的辅助作用，且安全性好。
[0044]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0045]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。