干细胞示踪的多模态纳米探针的制备方法

1.本发明涉及一种体内示踪探针的制备方法，更具体的说，本发明主要涉及一种干细胞示踪的多模态纳米探针的制备方法及应用。


背景技术：

2.目前，光学成像、核磁共振成像等现有细胞成像技术各有利弊。近年来国内外也有对干细胞示踪的材料技术进行研究，但受材料本身限制，对于细胞示踪的效果并不理想。近年来，磁性粒子成像 (mpi) 作为一种新开发的分子成像技术，拥有高图像对比度、高灵敏度和出色的线性成像的优势，具有很好的干细胞示踪应用前景。因而有必要基于磁性粒子成像，对多模态纳米体内示踪材料的制备方法进行研究和改进。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一在于针对上述不足，提供一种干细胞示踪的多模态纳米探针的制备方法，以期望现有技术中光学成像、核磁共振成像等细胞成像技术存在利弊，无法对体内干细胞进行多模态示踪等技术问题。
4.为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案。
5.本发明提供了一种干细胞示踪的多模态纳米探针的制备方法，该方法包括如下步骤。
6.步骤a、将油酸铁与十八烯的混合物置于二甲基硅油中进行油浴热分解，制得纳米氧化铁，所述纳米氧化铁中油酸铁与十八烯的摩尔比为1:3-7；然后将纳米氧化铁放入聚乙二醇中进行表面改性，制得水溶性的纳米氧化铁；所述纳米氧化铁与聚乙二醇的体积比为1:3-7。
7.步骤b、将以质量份计，将8-12份的1, 2-二棕榈酰-甘油3-磷酸胆碱、0.5-2份胆固醇和 0.1-0.8份的吲哚菁绿放入容器中，进行超声处理后得到脂质体混合物；将脂质体混合物溶解在氯仿或甲醇溶液中，然后在40℃以上的温度下蒸发至干燥，再在真空下进一步干燥后得到脂质体薄膜。
8.步骤c、将纳米氧化铁溶解在去离子水中，然后再混入脂质体薄膜，在50℃以上进行超声处理，且每隔单位时间涡旋一次；得到包被有脂质体的纳米氧化铁囊泡悬浮液；使用去离子水洗涤后得到包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒，用以作为所述干细胞示踪的多模态纳米探针。所述纳米氧化铁与去离子水的质量比为1:200-300；所述纳米氧化铁与脂质体薄膜的质量比为1:3-6。
9.更进一步的技术方案是：所述步骤b中氯仿或甲醇溶液的体积比为2:1。
10.更进一步的技术方案是：所述步骤b中将脂质体混合物溶解在氯仿或甲醇溶液中后，在40℃以上的温度下通过旋转蒸发至干燥。
11.更进一步的技术方案是：所述步骤c中将脂质体薄膜与溶解在去离子水中的纳米氧化铁，在50℃以上超声处理30min，且每间隔10min涡旋一次。
12.更进一步的技术方案是：所述步骤c中将包被有脂质体的纳米氧化铁囊泡悬浮液离心处理30min，然后再使用去离子水洗涤。
13.更进一步的技术方案是：所述步骤a中得到纳米氧化铁的粒径为10-30nm，所述步骤c中得到包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的粒径为120-180nm。
14.本发明还提供了一种干细胞示踪的多模态纳米探针的应用方法，所述方法将上述方法制备的干细胞示踪的多模态纳米探针，进行局部注射，与磁性粒子成像（mpi）、核磁共振成像（mri）与光学成像相配合，进行干细胞在体多模态示踪显示。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果之一是：通过热分解的方式制备纳米氧化铁材料，在包被了嵌有吲哚菁绿的脂质体膜后作为干细胞示踪的多模态纳米探针，可以清晰地观察到轮廓；并且探针在体内对于核磁共振成像的弛豫性能优越，光学性能表现良好，mpi性能明显优于普通商用造影剂，亦具有良好的稳定性和生物安全性。
附图说明
16.图1为纳米氧化铁颗粒及粒径图。
17.图2为包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的轮廓图。
18.图3为包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的核磁共振成像的弛豫性能图。
19.图4为包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的光学性能表现图。
20.图5为包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的mpi性能表现图。
21.图6为包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的生物安全性测定图。
22.图7为用于说明本发明中包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒制备及使用图。
具体实施方式
23.下面结合附图对本发明作进一步阐述。
24.近年来磁性粒子成像 (mpi) 作为一种新开发的分子成像技术，拥有高图像对比度、高灵敏度和出色的线性成像的优势，具有很好的干细胞示踪应用前景。因此在本发明中，将mpi与其他一种或多种成像技术联合运用，从而进行优势互补，实现对干细胞的多模态示踪。
25.因此本发明的一个实施例是一种方法，该方法是基于上述mpi分子成像技术，制备包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒，作为干细胞示踪的多模态纳米探针；并且如图7所示，将该方法制备完成的包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒，局部注射入小鼠体内，且在24h后，分别通过磁性粒子成像、核磁共振成像与光学成像，进行干细胞在体多模态示踪显示，从而获得三模态的干细胞示踪图像。
26.上述作为多模态纳米探针的包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒，是通过如下的方法制备的。
27.步骤s1、使用热分解法制备纳米氧化铁(ios)；具体为将油酸铁与十八烯的混合物置于二甲基硅油中进行油浴热分解，二甲基硅油的温度为280℃上下，从而制得纳米氧化铁；其中纳米氧化铁中油酸铁与十八烯的摩尔比为1:3-7，该比例可根据制备的需求进行动态调整，例如在实施例中，将两者的摩尔比调整为1:5。本步骤使油酸铁充分热分解与十八烯混合反应，再采用正己烷洗涤2-3次后，所制得的氧化铁纳米材料(ios)颗粒均匀，粒径统
一(如图1a所示)，尺寸在15nm左右(如图1b所示)。
28.步骤s2、将步骤s1中制得的纳米氧化铁放入聚乙二醇中进行表面改性，制得水溶性的纳米氧化铁；并且前述改性过程中，纳米氧化铁与聚乙二醇的体积比为1:3-7，在本实施例中，将两者的投料比设置为1:5。
29.步骤s3、将以质量份计，将8-12份的1, 2-二棕榈酰-甘油3-磷酸胆碱、0.5-2份胆固醇和 0.1-0.8份的吲哚菁绿放入容器中，进行超声处理后得到脂质体混合物。前述超声处理，可参考步骤s4中的超声处理方式进行。
30.在本实施例中，优选的配比是将大约 10 mg 1, 2-二棕榈酰-甘油3-磷酸胆碱（dppc）、1 mg 胆固醇和 0.26 mg吲哚菁绿(icg)称重到圆底烧瓶中，将混合后的脂质体混合物溶解在约10ml的氯仿或甲醇溶液（体积比为2:1）中，然后在40℃以上的温度下蒸发至干燥，此处最好采用旋转蒸发至干燥，然后再在真空下进一步干燥后得到脂质体薄膜，此处的真空干燥的时间一般需超过8h。此步骤将得到嵌有icg的脂质体薄膜。
31.步骤s4、将纳米氧化铁溶解在去离子水中，然后再混入脂质体薄膜，在50℃以上进行超声处理，且每隔单位时间涡旋一次；得到包被有脂质体的纳米氧化铁囊泡悬浮液；前述纳米氧化铁与去离子水的质量比为1:200-300，且纳米氧化铁与脂质体薄膜的质量比为1:3-6；例如在本实施例中使用5ml的去离子水溶解20mg的水溶性纳米氧化铁，然后再与100mg步骤s3中制得的脂质体薄膜进行水合，并将烧瓶在 60 ℃下超声处理30分钟，且每隔 10 分钟涡旋一次。
32.本步骤中更加优选的是，上述将包被有脂质体的纳米氧化铁囊泡悬浮液离心处理（10000 rpm，30min），并去除上清液。
33.步骤s5、然后采用使用去离子水洗涤颗粒2-3次，然后得到最终产物——包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒，该包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的粒径为120-180nm，用以作为所述干细胞示踪的多模态纳米探针。
34.基于上述实施例所制备得到的包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒，发明人还对其进行了实验验证，以确保其能够实现对干细胞的多模态在体示踪。
35.包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒轮廓图如图2所示。图2a为将包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的水溶液（20μg/毫升）滴加到电镜专用的双联铜网上，待溶剂蒸干后，将铜网放到电镜样品台，调整仪器参数，选择合适视野对纳米粒进行tem成像。图2b为将1ml包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的水溶液（2mg/ml）加入动态光散射仪专用的玻璃皿中，随后将玻璃皿插入载样仓，调节仪器参数，测量纳米粒子的水合粒径。在图2中可见，包被嵌有icg的脂质体膜后的纳米氧化铁颗粒可观察到清晰地轮廓。
36.图3为将包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的水溶液（2mg/ml），依次对半稀释，得到5个样品，将这些样品固定在7.0 t的mri成像仪的扫描仓中，选择t2map序列对样品进行mri成像，随后测量得到每个样品的弛豫时间t2，根据公式：r1 = (1/t2
ꢀ−
1/t2(0))/[铁] 求得材料的弛豫率，从而评估材料的弛豫性能。在图3中可见，多模态纳米探针材料(l@icg-ios)的核磁共振成像的弛豫性能优越，弛豫值约为商用造影材料（vivotrax）的2倍。
[0037]
图4为将1ml包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的水溶液（2μg /毫升）加入分光光度计专用玻璃皿，随后固定在扫描仓，采用紫外-可见分光光度计测量材料的荧光光谱。在图4中可见，多模态纳米探针材料(l@icg-ios)的光学性能表现良好。
[0038]
图5为将包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒的水溶液（2mg/ml），依次对半稀释，得到5个样品，将这些样品固定在mpi成像仪的扫描仓中进行mpi成像，随后测量得到每个样品的mpi信号值，线性拟合得到材料的“mpi信号-铁浓度”图，评估材料的mpi性能。在图5中可见，多模态纳米探针材料(l@icg-ios)的mpi性能是商用造影剂的3倍，性能出色。
[0039]
图6为称取1mg包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒分别溶解在5ml水溶液、5ml磷酸盐缓冲液（pbs）或5ml的dmem血细胞培养基中，分别在第0/7/14/21/28天测量材料的水合粒径和荧光信号，用于评估材料的稳定性。在图6中可见，多模态纳米探针材料(l@icg-ios)具有良好的稳定性和生物安全性。
[0040]
由上述的实验验证可知，本发明方法所制得的包被有脂质体的纳米氧化铁颗粒，作为干细胞示踪的多模态纳米探针，可以清晰地观察到轮廓；并且探针在体内对于核磁共振成像的弛豫性能优越，光学性能表现良好，mpi性能明显优于普通商用造影剂，亦具有良好的稳定性和生物安全性。亦可在小鼠体内注射用于干细胞在体多模态示踪显示，亦可经同理应用于大动物以及人体内进行干细胞在体多模态示踪显示。
[0041]
除上述以外，还需要说明的是在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本技术概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。
[0042]
尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本技术公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本技术公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。