一种特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子及其制备方法与应用

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子及其制备方法与应用。


背景技术：

2.斑马鱼是科学研究中常用的经典模式生物。在耳科研究领域，由于斑马鱼具有典型的内耳解剖结构，并且具有感觉神经系统—侧线系统，侧线神经丘(即毛细胞，如图1所示)与内耳毛细胞功能及分子结构极为相似，且便于活体观察及干预，现已广泛用于毛细胞发育、再生、听觉及前庭功能障碍研究。斑马鱼侧线神经丘是体内测试毒性化合物的有价值模型，也是研究耳毒性药物致聋机制的理想研究模型，因为它们的毛细胞被认为与哺乳动物内耳中的毛细胞是同源的，并且很容易在体内获得药物。
3.耳科领域研究斑马鱼侧线神经丘的过程中，需要使用特定活体染色剂进行活体染色标记，目前市售及文献中用到的标记物有：fm1-43和daspei，fm1-43是一种用于研究胞吞作用和胞吐作用的苯乙烯基染料，可作为毛细胞机械传感器通道的渗透阻滞剂。daspei是一种苯乙烯基荧光染料，可对活细胞的线粒体染色。但是上述两种荧光染料属于活体荧光染料，在应用过程中发现上述两种荧光染料对斑马鱼侧线神经丘的特异性染色效果不是很理想，染色处理后需要立即观察，有时无法特异性标记，且荧光易淬灭，体内标记存留时间相对较短。因此，寻求和开发一种荧光不易淬灭、能够特异性标记斑马鱼侧线神经丘、体内存留时间长的染色试剂，对于耳科领域研究和阐明耳毒性药物致聋机制和发育机制具有重要助力作用，具有重要的研究意义和应用价值。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有斑马鱼侧线神经丘荧光标记物的技术的缺点，本发明的目的在于提供一种特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子及其制备方法与应用，解决现有的斑马鱼标记物无法特异性标记、体内存留时间短、荧光易淬灭的问题。
5.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
6.本发明公开了一种特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子，包括脂质体，所述脂质体内水相负载有荧光标记物，脂质体表面修饰有靶向多肽ls19；
7.其中，所述靶向多肽ls19的氨基酸序列如seq.id.no.1所示。
8.优选地，所述脂质体油相负载疏水性潜在治疗药物。
9.优选地，所述靶向多肽ls19通过碳化二亚胺类化合物和dspe-mpeg-cooh形成酰胺键，偶联在脂质体表面。
10.优选地，所述脂质体的载体包括卵磷脂和胆固醇。
11.优选地，所述荧光标记物为罗丹明-b。
12.优选地，所述碳化二亚胺类化合物为edc。
13.本发明还公开了上述一种特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子的制备方法，制备方法如下：
14.1)制备负载荧光标记物的脂质体
15.称量卵磷脂、dspe-mpeg-cooh和胆固醇，加入溶剂充分溶解，加入含荧光标记物的纯化水溶液，充分反应，洗涤、过滤，制得负载荧光标记物的脂质体；
16.2)对脂质体进行功能化修饰靶向多肽ls19
17.取步骤1)制得的脂质体，洗涤，涡旋加入靶向多肽ls19、碳化二亚胺类化合物反应，离心收集下清，洗涤，取上清，制得偶联靶向多肽ls19的靶向纳米粒子。
18.优选地，步骤1)中，卵磷脂、dspe-mpeg-cooh、胆固醇、荧光标记物、靶向多肽ls19和碳化二亚胺类化合物的质量比为65：10：10：3：6：6。
19.优选地，步骤1)中，溶解采用超声溶解；充分反应的具体步骤为：40℃、17rpm水化40min，水浴超声1min，探头超声9min。
20.本发明还公开了上述一种特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子在制备用于斑马鱼活体生物成像的荧光显色粒子中的应用。
21.优选地，所述靶向纳米粒子为斑马鱼生物成像研究的特异性荧光标记物。
22.优选地，所述靶向纳米粒子为斑马鱼活体成像观察侧线神经丘的染料。
23.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
24.本发明提供的一种特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子，该靶向纳米粒子仅针对毛细胞，以具有磷脂双分子层结构的脂质体为载体，负载荧光标记物，利用靶向多肽ls19特异性识别内耳毛细胞中特异性表达的肌动蛋白prestin的功能，将靶向多肽ls19偶联至脂质体表面，从而制备得到内耳靶向给药系统(ls19-np)，即组装形成稳定的内耳靶向纳米粒子ls19-np。该靶向纳米粒子选用的脂质体为长循环、配体靶向载药脂质体，更加智能化，毒性更低，易于商业化，具有靶向性、缓释性、细胞亲和性和组织相容性，能够通过受体-配体相互作用驱动纳米粒子主动靶向递送至毛细胞。通过荧光标记物靶向作用于毛细胞(即斑马鱼侧线神经丘)，实现荧光成像可视化，安全且长期稳定；只需要一次荧光染色处理，能够在斑马鱼体内长时程存在，荧光不易淬灭，可以满足长时程活体观察斑马鱼侧线神经丘的损伤和恢复过程的研究要求。与现有的线粒体活体染料daspei或fm1-43活体标记荧光染料相比，该靶向纳米粒子靶向性、特异性标记更明确，荧光性质更稳定，在体内存留时间也更长，不易被机体代谢排出体外，能够解决当前斑马鱼侧线神经丘荧光标记物的缺点，是耳科研究领域以斑马鱼为模型研究耳毒性药物致聋机制和发育机制的有效工具，能够对毛细胞进行特异性标记和活体成像观察，具有巨大的转化应用潜能，有望成为一种新型特异型性斑马鱼侧线神经丘荧光标记物。
25.进一步地，脂质体油相负载潜在治疗药物，使得靶向纳米粒子在具备靶向标记的功能同时，还具备靶向递送潜在治疗药物和靶向治疗耳毒性药物损伤的作用，应用范围更广。
26.本发明提供的一种靶向、特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子的制备方法，该方法制备工艺简单，原料易得，靶向多肽ls19的偶联率能够达到84.9％，能够对斑马鱼进行活体特异性、靶向荧光标记侧线神经丘，在斑马鱼体内长时程存在，荧光不易淬灭，可以满足长时程活体观察斑马鱼侧线神经丘的损伤和恢复过程的研究
要求，能够实现荧光成像可视化，安全且长期稳定。
附图说明
27.图1为斑马鱼侧线神经丘示意图；其中，a为斑马鱼侧线神经丘的主视图，图中的绿色圆点为单个神经丘，a’为单个神经丘(毛细胞)的局部放大俯视图，a”为单个神经丘(毛细胞)的局部放大侧视图；
28.图2为本发明的一种靶向、特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子的示意图；
29.图3为本发明的靶向纳米粒子的检测表征结果图；其中，a为dls检测结果图，b为zeta电位检测结果图，c为透射电镜检测结果图，d为荧光发射光谱检测结果图，e为本发明的ls19标准曲线图；
30.图4为本发明的靶向纳米粒子对斑马鱼胚胎发育过程(4-96hpf)的活体成像观察图；其中，a为斑马鱼胚胎处于球期(4hpf)的明场视野图像，a’为斑马鱼胚胎处于球期(4hpf)的荧光图像，b为斑马鱼处于胚胎发育后期的明场视野图像，b’为斑马鱼处于胚胎发育后期的荧光图像，c为斑马鱼处于孵化期的明场视野图像，c’为斑马鱼处于孵化期的荧光图像，d为斑马鱼的头部局部放大高倍成像(
×
60)，e为斑马鱼处于幼虫期的明场视野图像，e’为斑马鱼处于幼虫期的荧光图像；
31.图5为本发明的靶向纳米粒子与荧光染料daspei(0.005％)共同染色标记斑马鱼的对比图；其中，从左到右依次为daspei染色、ls19-np染色、daspei和ls19-np共同染色处理，图中绿色荧光为daspei(0.005％)所标记，图中红色荧光为本发明靶向纳米粒子ls19-np所标记；
32.图6为本发明的靶向纳米粒子对斑马鱼侧线神经丘染色处理15分钟后，特异性荧光标记在体内长时程存留的结果图；其中，从左到右分别为染色0h和染色48h的荧光存留情况。
具体实施方式
33.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
34.需要说明的是，本发明术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
35.下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
36.如图2，本发明提供的一种靶向、特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子，以具有磷脂双分子层结构的脂质体为载体，载体的内水相(亲水)负载有荧光标记物，油相(疏水)可以用于后续潜在治疗药物的负载，在碳化二亚胺类化合物的作用下，
使脂质体表面的羧基与靶向多肽ls19的氨基反应形成酰胺键，将靶向多肽ls19(靶向识别外毛细胞中特异性表达的prestin)偶联至脂质体表面形成共组装体，从而构建得到一种靶向、特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子。
37.其中，脂质体载体包括卵磷脂和胆固醇，荧光标记物选用但不限于罗丹明-b。
38.本发明提供的一种靶向、特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子的制备方法如下：
39.1.制备负载荧光标记物-罗丹明b的脂质体
40.准确称量65mg卵磷脂(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、10mg dspe-mpeg-cooh(购自广州市碳水科技有限公司)、10mg胆固醇(购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司)于离心管中，加入8ml氯仿，超声充分溶解；将溶解后的反应液转移至100ml茄形瓶中，置于旋转蒸发仪上，70℃、30rpm旋蒸至氯仿挥发完全；将茄形瓶取下，加入4ml含3mg罗丹明b(购自海阿拉丁生化科技股份有限公司)的纯化水溶液，40℃、17rpm水化40min；将茄形瓶取下，水浴超声1min后，将溶液取出至10ml离心管，探头超声(20％功率/超2s停3s/冰浴)9min；将溶液转移至100kda超滤管中，纯化水(ph值7-8)超滤洗涤5次(3777g，20min/次)；采用0.22μm滤膜过滤并用纯化水定容至6ml，即可得到内水相负载罗丹明b的脂质体(即为lipid-罗丹明b，简称np)。
41.若需要负载潜在治疗药物，可在制备的反应液中加入潜在治疗药物，其他步骤同上，制成内水相负载罗丹明b，油相负载潜在治疗药物的脂质体。
42.2.对负载荧光标记物-罗丹明b的脂质体进行功能化修饰靶向多肽ls19
43.取60mg步骤(1)制得的脂质体，采用15mm mes(脂肪酸甲脂磺酸钠；ph值5.5；购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司)洗涤并定容至9.251ml，分别涡旋加入6mg靶向多肽ls19(0.0404mg/ml，148.5μl；纯化水溶解后，加1％nahco3调ph值至中性；靶向多肽ls19由上海强耀生物科技有限公司定制；氨基酸序列如表1所示)、6mg edc(10mg/ml，600μl；购于sigma公司)，置于37℃摇床150rpm反应过夜(大于20h)；反应结束后，将反应液转移至100kda的超滤管中，离心、收集下清(用于检测多肽偶联率)，并采用纯化水超滤、洗涤5次，上清即为偶联靶向多肽ls19的脂质体(即lipid-罗丹明b-ls19脂质体，简称ls19-np)。
44.表1靶向多肽ls19的氨基酸序列表
45.名称氨基酸序列序号靶向多肽ls19lsthttesrsmvggscggsseq.id.no.1
46.对上述制得的靶向纳米粒子进行检测表征：
47.表征一：dls检测
48.对制得的ls19-np进行dls检测，检测结果如图3a所示，水动力尺寸(mean by number)为119.6nm。
49.表征二：zeta电位检测
50.对制得的ls19-np进行zeta检测，检测结果如图3b所示，zeta电位为-18.07mv。
51.表征三：透射电镜检测结果
52.对制得的ls19-np进行透射电镜检测，ls19-np的尺寸和形貌如图3c所示，其粒径大小在100nm左右，这说明脂质体纳米粒子修饰靶向多肽ls19对其粒径大小无明显影响，符合脂质体平均粒径在100nm左右的要求，使得药物负载率相对较高，更容易进入细胞。
53.表征四：荧光光谱检测结果
54.取制得的ls19-np加纯化水稀释至0.5mg/ml，2ml；另取20μl 1mg/ml的罗丹明b水溶液，加纯化水稀释至2ml。采用荧光光谱检测罗丹明b水溶液和ls19-np的荧光发射光谱。
55.罗丹明b水溶液和ls19-np的荧光发射光谱如图3d所示，ls19-np的荧光发射光谱与罗丹明b水溶液的相比，发射波长位置明显红移(即波长增大)，说明靶向脂质体纳米粒子成功负载罗丹明b。
56.表征五：靶向蛋白偶联率
57.对制得的ls19-np超滤离心取下清，采用bca法检测下清中靶向多肽ls19的含量，根据投料量计算靶向多肽ls19的偶联率。
58.采用靶向多肽ls19制作标准曲线：将20.2mg靶向多肽ls19溶于500μl水溶液中，采用mes稀释至125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、15.625μg/ml及7.8125μg/ml。
59.制得的ls19标准曲线如图3e所示，根据待测样品的bca检测结果，计算靶向多肽ls19的偶联率，计算结果如表2所示：
60.表2靶向多肽ls19的bca检测结果
61.根据标曲算浓度mg/ml实际浓度mg/ml反应浓度mg/ml偶联率％0.0150807080.150807084184.919292
62.表2的结果显示，靶向多肽ls19的偶联率达到84.9％，这说明偶联效果好，能够通过受体-配体相互作用实现向毛细胞靶向递送。
63.表征六：斑马鱼胚胎发育过程(4-96hpf)的活体成像观察
64.将*ab wt株成年雄性和雌性斑马鱼(购于国家斑马鱼资源中心，雌雄比例约为2:1)放置在一个28.5℃的斑马鱼养殖系统(购于北京爱生)中，保持14小时/10小时的光/暗循环。受精卵收集过程如下：提前一天将雌雄斑马鱼置于交配盒中，于次日早上开灯后抽掉交配盒中的隔离挡板，雌雄斑马鱼相互追逐就会触发产卵，收集4～5hpf(受精后数小时)的胚胎，用纯净水洗涤3次，以便在成像前清除周围的碎片。然后在显微镜下将洗涤后的活胚置于24孔培养板中(20个胚胎置于1ml 0.003％苯硫脲培养液/孔中)，每组重复5个孔，用20μl/ml浓度制得的ls19-np处理胚胎，并培养4～96hpf，培养期间使用明场倒置显微镜(stemi 2000-c,zeiss,oberkochen,germany)观察和评估每个孔中的发育胚胎，并记录不同时间点(4，12，24，36，48，60，72和96hpf)存活和孵化的胚胎数量，通过统计分析斑马鱼胚胎的存活率和孵化率，以评估其生物毒性，并进行活体成像观察，使用大视场荧光变焦生物立体显微镜(axio zoom v16；蔡司)连接到一个ccd相机(axiocam506 mono；zeiss)记录胚胎发育后期(10hpf)、咽部发育期(24hpf)、孵化期(48hpf)和幼虫期(96hpf)的荧光图像，验证该靶向纳米粒子对斑马鱼侧线神经胶质细胞的靶向特异性。
65.结果见图4，表明该靶向纳米粒子在斑马鱼侧线神经丘中特异性累积，证实其特异性递送至毛细胞，具有高度靶向性。
66.表征七：ls19-np对斑马鱼侧线神经丘特异性标记性能评估
67.选择受精后发育至第5天的*ab wt株斑马鱼幼鱼，以观察ls19-np(20μl/ml)在斑马鱼侧线神经胶质细胞中的靶向累积和表达，并用线粒体活体染料daspei(0.05％)或fm1-43活体标记荧光染料标记斑马鱼侧线神经胶质细胞，使用大视场荧光变焦生物立体显微镜(axio zoom v16；蔡司)连接到一个ccd相机(axiocam506 mono；zeiss)记录ls19-np与
daspei(0.05％)或fm1-43共同染色处理后的斑马鱼活体成像荧光图像，验证该靶向纳米粒子对斑马鱼侧线神经丘的靶向特异性；并初步观察ls19-np染色处理后在体内的存留时间(初步观察0-48h的荧光存留情况，不仅限于48h)。
68.图5中，本发明的靶向纳米粒子与daspei(0.05％)共同染色处理斑马鱼15分钟，可见ls19-np(红色)荧光标记位置与daspei(0.05％)绿色荧光标记位置重合，且本发明的靶向纳米粒子靶向性、特异性标记更明确，更稳定。通过荧光共标证实本发明的靶向纳米粒子特异性、高效、靶向标记斑马鱼侧线神经丘，显示出优越的特异性。
69.图6结果表明：相比于现有荧光染料荧光存留3h左右，本发明的靶向纳米粒子染色处理一次后，在斑马鱼体内的存留时间更持久，初步只观察了0-48h的荧光存留情况，显示出荧光性质非常稳定，不易淬灭，可以长时程存在，存留时间可能不仅限于48h；上述结果充分表明：本发明的靶向纳米粒子能够实现斑马鱼活体实时成像，并满足长时程活体荧光成像研究要求。
70.综上所述，本发明提供的一种靶向、特异性、持久性荧光标记斑马鱼侧线神经丘的靶向纳米粒子，脂质体能够成功负载荧光标记物罗丹明b，靶向多肽ls19能够成功偶联至lipid-罗丹明b-ls19脂质体表面，从而对斑马鱼侧线神经丘具有高度特异性，实现斑马鱼活体实时成像，并满足长时程活体荧光成像研究要求。
71.以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。