医用细胞CMU-pb-7在制备降血脂药物中的应用的制作方法

7在制备降血脂药物中的应用，医用细胞cmu-pb-7是一株来源于本实验室前期从健康人粪便中分离的鼠李糖乳杆菌，在高脂小鼠体内可缓解高脂饮食引起的糖耐量受损，降低血脂水平，且可提高肝脏组织抗氧化能力及调节肝脏脂代谢关键蛋白的表达而缓解高脂饮食引起的脂肪变。本发明提供的医用细胞cmu-pb-7在降血脂药物制备方面有较大的潜在应用前景。
附图说明
14.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
15.图1附图为本发明医用细胞cmu-pb-7在mrs琼脂平板上的菌落形态；
16.图2附图为本发明医用细胞cmu-pb-7在厌氧血琼脂平板上的菌落形态；
17.图3附图为本发明医用细胞cmu-pb-7革兰染色镜下形态，1000倍镜；
18.图4附图为本发明医用细胞cmu-pb-7生物被膜形成图，1000倍镜；
19.图5附图为本发明医用细胞cmu-pb-7体外胆固醇降解率结果图；
20.图6附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的体重增长变化图；
21.图7附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的体重增长率变化图；
22.图8附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的糖耐量影响检测结果图；
23.图9附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的血清tc水平检测结果图；
24.图10附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的血清tg水平检测结果图；
25.图11附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的血清ldl-c水平检测结果图；
26.图12附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的血清hdl-c水平检测结果图；
27.图13附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的gsh水平检测结果图；
28.图14附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的cat水平检测结果图；
29.图15附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的t-aoc水平检测结果图；
30.图16附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的mda水平检测结果图；
31.图17附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型的肝脏组织形态学观察结果图；
32.图18附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型肝脏组织病理切片he
染色结果图；
33.图19附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠模型回肠组织病理切片he染色结果图；
34.图20附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠肝脏指数结果图；
35.图21附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠肝脏组织学损伤评分结果图；
36.图22附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠回肠组织学损伤评分结果图；
37.图23附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠肝脏hmgcr蛋白表达水平检测结果图；
38.图24附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠肝脏fxr蛋白表达水平检测结果图；
39.图25附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠肝脏srebp1蛋白表达水平检测结果图；
40.图26附图为本发明医用细胞cmu-pb-7对高脂血症小鼠肝脏cyp7a1蛋白表达水平检测结果图；
41.其中，*，p《0.05；**，p《0.01，***，p《0.001；****，p《0.0001。
具体实施方式
42.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.实施例1cmu-pb-7的分离、培养、鉴定及益生功能检测
44.(1)样本来源
45.选取健康人作为志愿者。选取人群需满足取样前两周正常饮食，无肠道疾病史，无抗生素服用史。取样为当天晨便，收集新鲜样本后立即使用南京法迈特公司的智能微生物分离系统进行粪菌分离。分离完成后收集粗提粪菌液，加入含40％甘油的mrs肉汤培养基作为冻存保护液冻存于-80℃超低温冰箱中备用。
46.(2)cmu-pb-7的分离
47.从-80℃冰箱中取出冻存的粗提粪菌液，在9ml的生理盐水中加入1ml的粗提粪菌液，充分混匀，梯度稀释至浓度为10-3
～10-7
。吸取各个浓度菌液100μl，分别涂布于mrs琼脂培养基、tpy琼脂培养基及m17琼脂培养基，37℃厌氧条件培养48h-72h。初步根据菌落特征，挑选单个菌落形态呈圆形，表面光滑，边缘整齐，奶油白色，且散发奶油味的菌落在上述对应琼脂培养基上进行分区划线纯培养。
48.(3)cmu-pb-7培养特性
49.取cmu-pb-7菌株单个菌落，分别接种于mrs琼脂平板和厌氧血琼脂平板，37℃厌氧条件培养48h；观察mrs平板以及厌氧血琼脂平板上菌落特征，结果见图1-图2；结果显示，cmu-pb-7为兼性厌氧菌，在mrs平板和厌氧血琼脂平板上菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，
奶油白色，且散发奶油味，且在厌氧血琼脂平板上无溶血现象。
50.(4)cmu-pb-7的生化鉴定
51.cmu-pb-7的生化鉴定采用法国梅里埃生物公司的api 50chl细菌生化鉴定系统进行鉴定。按照api 50chl鉴定试剂条说明书进行严格操作，得到菌株的反应结果用api鉴定软件进行分析，鉴定结果为鼠李糖乳杆菌，鉴定率99.9％，t值0.3。cmu-pb-7生化反应结果见表1。
52.表1 cmu-pb-7生化反应结果
[0053][0054][0055]
其中，0号管为空白对照管。
[0056]
(5)cmu-pb-7的革兰染色菌体形态
[0057]
挑取mrs琼脂平板上的cmu-pb-7的单个菌落，于载有10μl无菌生理盐水的玻片上涂片，待其干燥后，酒精灯外焰固定，冷却后进行革兰染色，油镜下观察菌体形态，结果见图3；结果显示，cmu-pb-7为菌体呈紫色、短杆状，单个、成对或短链排列的革兰氏阳性菌。
[0058]
(6)cmu-pb-7的生物被膜形成实验
[0059]
取1
×
109cfu/ml的cmu-pb-7的菌液按2％(v/v)接种量接种至15ml mrs肉汤培养基中，充分混匀，按每孔2ml菌液的量加入预先放有细胞爬片的六孔板培养皿中，37℃厌氧培养72h。培养完成后，弃去培养基，取出细胞爬片，无菌pbs洗3次，2.5％戊二醛固定6h～8h。固定完成后，无菌pbs洗3次，1％结晶紫染液染色30min。染色完成后，无菌pbs洗3次。待细胞爬片自然干燥后，油镜下观察生物被膜形成情况。结果见图4；结果显示，cmu-pb-7具有生物被膜形成能力，其生物被膜形态呈链状，聚集排列。
[0060]
(7)cmu-pb-7的降胆固醇能力检测
[0061]
分别取1
×
109cfu/ml的cmu-pb-7的菌液按2％(v/v)接种量接种至10ml的高胆固醇的mrs肉汤培养基(首先制备胆固醇标准储备液(10.0g/l)：胆固醇(sigma公司)0.1g，用无水乙醇溶解至10ml，使其浓度为10.0g/l，并使用0.22μm滤膜过滤除菌，储备于无菌干燥的离心管中。高胆固醇的mrs肉汤培养基(1g/l)：取胆固醇标准储备液1ml于9ml灭菌mrs肉汤培养基(环凯微生物科技有限公司)中，使其终浓度为1g/l。)和10ml mrs肉汤培养基中，37℃厌氧培养，分别在培养0h、12h、24h、48h取样1ml，4000r/min离心10min；以接种至高胆固醇的mrs肉汤培养基离心后的上清液作为待测样品，接种至mrs肉汤培养基离心后的上清作为空白对照品，总胆固醇测试盒(厂家：北京普利莱基因技术有限公司，货号：e1015-50)中的标准溶液(5mmol/l)作为标准品，按试剂盒说明书操作步骤进行测定：取190μ1工作溶液(工作溶液配制按4：1比例配置，即取4ml试剂r1与1ml试剂r2混匀，立即使用或4℃保存)加入96孔板，在各工作液中，分别加入10μ1空白对照品、标准品、待测样品。在37℃室温反应20分钟后在酶标仪测定各管od
550nm
值。胆固醇含量(mmol/l)＝[(样本孔od
550nm-空白孔od
550nm
)/(标准孔od
550nm-空白孔od
550nm
)]
×c标准
，od
550nm
为酶标仪工作波长为550nm测得的吸光度值，c
标准
为标准液浓度5mmol/l；计算胆固醇降解效率，按照公式：胆固醇降解率％＝(c0－cn)/c0×
100％，c0为未培养前mrs-cho培养基中胆固醇含量，cn为实验菌株不同时点培养基中胆固醇含量。结果见图5；结果显示，随着培养时间的延长，cmu-pb-7的胆固醇降解率逐渐增加，在48h处可达52.93％。
[0062]
实施例2高脂血症小鼠模型的建立
[0063]
选取24只6～8周龄，体质量19～21g spf级雄性c57bl/6小鼠24只。随机分为3组，每组8只，分别为对照组(normal diet，nd)：普通饲料(厂家：北京科澳协力饲料有限公司，名称：大小鼠生长繁殖饲料)+0.2ml生理盐水灌胃；模型组(high-fat diet，hfd)：高脂饲料(厂家：江苏省协同医药生物工程有限责任公司，名称：60％脂肪供能高脂饲料，货号：xthf60)+0.2ml生理盐水灌胃；hfd+cmu-pb-7组：高脂饲料+0.2ml的1x109cfu/ml cmu-pb-7灌胃。每天固定时间对各组小鼠灌胃处理。持续灌胃9周后，经眼球取血后颈椎脱臼处死小鼠，留取小鼠血液，肝脏，回肠等标本用于后续检测与分析。
[0064]
实施例3高脂血症小鼠模型的评估
[0065]
(1)cmu-pb-7医用细胞对高脂血症小鼠体重影响的检测
[0066]
每日固定时间，在灌胃之前用电子天平称量每只小鼠的体重。小鼠的体重变化及体重增长率((第9周小鼠体重-第1周小鼠体重)/第1周小鼠体重)结果见图6和图7，结果显示，连续灌胃9周后，与hfd组相比，hfd+cmu-pb-7组在各个时间点均低于hfd组小鼠体重，而hfd+cmu-pb-7组小鼠的体重高于nd组。同时，与hfd组相比，hfd+cmu-pb-7组小鼠的体重增长率显著低于hfd组(p《0.05)，而hfd+cmu-pb-7组与nd组小鼠体重增长率之间没有明显改
变。
[0067]
(2)高脂血症小鼠糖耐量检测
[0068]
在连续灌胃9周的最后一天晚上，小鼠禁食不禁水。次日8点使用血糖仪检测每只小鼠空腹血糖。空腹血糖检测完成后，每只小鼠按0.01ml/g腹腔注射20％葡萄糖溶液(小鼠葡糖糖耐受实验葡萄糖使用量为2g/kg，采用pbs配置20％葡萄糖溶液)，在30min、60min、90min、120min的时间点检测小鼠血糖。结果见图8；结果显示，在30min处，各组小鼠血糖浓度升高至最高点，在60min、90min和120min处血糖浓度逐渐下降。与hfd组相比，nd组小鼠血糖值降低，提示高脂饮食导致小鼠糖耐量受损；而hfd+cmu-pb-7组小鼠各个时间点血糖值虽然低于hfd组但高于nd组，提示cmu-pb-7可缓解高脂饮食引起的小鼠糖耐量受损。
[0069]
(3)高脂血症小鼠血脂检测
[0070]
采用眼球取血法，收集小鼠血清，在4℃低温离心机中2000r/min离心15min，收集上层血清，用全自动生化仪(迈瑞)测定血清胆固醇(tc)、三酰甘油(tg)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)，低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)水平。结果见图9-图12；结果显示，hfd组小鼠血清tc，tg和ldl-c水平均高于nd组(p《0.05)，提示成功建立高脂血症小鼠模型；与hfd组相比，hfd+cmu-pb-7组小鼠血清tc，tg和ldl-c水平降低，hdl-c水平升高(p《0.05)。提示cmu-pb-7在一定程度上可调节高脂血症小鼠的血脂水平。
[0071]
(4)高脂血症小鼠肝脏抗氧化因子检测
[0072]
取小鼠肝组织0.1g加入1ml预冷裂解液(索莱宝)，组织匀浆，4℃，10000r/min，离心5min，收集上清液。使用还原性谷胱甘肽(gsh)检测试剂盒、过氧化氢(cat)活性检测试剂盒和总抗氧化能力(t-aoc)检测试剂盒分别测定肝脏组织中抗氧化因子水平，使用丙二醛(mda)检测试剂盒测定肝脏脂质过氧化水平。结果见图13-图16，结果表明：与nd组相比，hfd组肝脏t-aoc，gsh和cat水平显著降低，mda水平增高(p《0.05)，提示肝脏组织抗氧化能力降低；而与hfd组相比，hfd+cmu-pb-7组gsh、cat和t-aoc水平显著增加，mda水平降低(p《0.05)。提示cmu-pb-7可提高肝脏组织抗氧化能力，降低氧化应激水平。
[0073]
(5)高脂血症小鼠肝脏形态学观察
[0074]
解剖小鼠后，取肝脏用pbs冲洗干净，肉眼观察小鼠肝脏的体积、硬度，光滑度，脂肪变情况，并拍照记录。结果见图17，结果表明：与nd相比，hfd组小鼠肝脏体积变大，质地较硬，切面油腻，有脂肪变。而与hfd相比，hfd+cmu-pb-7组鼠肝脏体积较小，质地柔软，切面光滑，无脂肪变。提示cmu-pb-7可提高肝脏组织抗氧化能力，缓解脂肪变。
[0075]
(6)高脂血症小鼠肝脏组织he染色
[0076]
①
取各组小鼠肝脏组织用4％甲醛溶液固定，经石蜡包埋并切片。
②
石蜡切片放入烤箱中60℃1h，二甲苯浸泡5min；再分别浸泡于无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇3min；然后用流水冲洗，甩干。
③
苏木素染色5min后，用流水冲洗，1％盐酸酒精分化，再次用流水冲洗；伊红染色1min。再分别浸泡于75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇溶液1min，于放入烤箱中60℃5min，用中性树脂封片。
④
显微镜下观察并拍照。光学显微镜下观察比较各组小鼠肝脏组织病理学改变。结果见图18，结果显示：nd组小鼠肝脏组织结构正常；hfd组可见小鼠肝脏组织中的肝细胞形态不规则、排列紊乱、细胞核粗糙疏松、大量脂滴形成，可见明显脂肪变；hfd+cmu-pb-7组的小鼠肝脏组织中的肝细胞形态较规则、排列整齐、细胞核紧密、脂滴形成减少，脂肪性减轻。可见cmu-pb-7能缓解高脂血症小鼠肝脏组织
的脂肪变。
[0077]
(7)高脂血症小鼠回肠组织he染色
[0078]
①
取各组小鼠回肠组织用4％甲醛溶液固定，经石蜡包埋并切片。
②
石蜡切片放入烤箱中60℃1h，二甲苯浸泡5min；再分别浸泡于无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇3min；然后用流水冲洗，甩干。
③
苏木素染色5min后，用流水冲洗，1％盐酸酒精分化，再次用流水冲洗；伊红染色1min。再分别浸泡于75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇、无水乙醇溶液1min，放入烤箱中60℃5min，用中性树脂封片。
④
显微镜下观察并拍照。光学显微镜下观察比较各组小鼠回肠组织病理学改变，结果见图19，结果显示：nd组小鼠的回肠组织结构完整；hfd组可见小鼠的回肠组织肠壁结构缺损、肠绒毛断裂、缺失，上皮细胞脱落，回肠组织损伤严重；hfd+cmu-pb-7组小鼠的回肠组织肠壁结构完整，肠绒毛无断裂、缺失，上皮细胞完整无脱落，回肠组织损伤缓解。提示cmu-pb-7可调节肠道内的氧化应激水平，缓解回肠组织的氧化损伤。
[0079]
(8)高脂血症小鼠肝脏指数检测
[0080]
解剖前称小鼠的质量记为m2，解剖后称小鼠的肝脏组织质量为m1，称量完成后计算小鼠的肝脏指数，肝脏指数＝m1/m2。结果见图20，结果显示：与nd相比，hfd组小鼠肝脏指数增加(p《0.05)；与hfd组相比，hfd+cmu-pb-7组小鼠肝脏指数下降(p《0.05)，提示cmu-pb-7可缓解小鼠肝脏体积，质量的改变。
[0081]
(9)高脂血症小鼠肝脏组织学损伤评分
[0082]
肝脏组织学损伤评分：0分：《5％的肝细胞脂肪变；1分：5％～33％的肝细胞脂肪变；2分：33％～66％的肝细胞脂肪变；3分：》66％的肝细胞脂肪变。评估结果见图21，结果显示：hfd+cmu-pb-7组小鼠肝脏组织损伤程度评分显著低于hfd组，提示cmu-pb-7能缓解高脂血症小鼠肝脏组织的脂肪变。
[0083]
(10)高脂血症小鼠回肠组织学损伤评分
[0084]
回肠组织学损伤评分：0分，正常肠黏膜；1分，肠黏膜顶端上皮下轻度水肿、毛细血管扩张充血；2分，肠黏膜上皮细胞与固有层间隙增大；3分，肠黏膜部分固有层顶端裸露、上皮细胞脱落；4分，黏膜固有层裸露或腺上皮结构消失、毛细血管扩张充血，可能伴随固有层炎细胞侵润；5分，肠黏膜出血、溃疡，固有层崩解。评估结果见图22，结果显示：hfd+cmu-pb-7组小鼠回肠组织损伤程度评分显著低于hfd组，提示cmu-pb-7能缓解高脂血症小鼠回肠组织损伤。
[0085]
(11)高脂血症小鼠脂代谢相关蛋白表达的检测
[0086]
取小鼠肝脏组织0.1g，加入裂解液进行组织匀浆，提取肝脏总蛋白，采用bca法测定总蛋白浓度。配制8％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，取50μg蛋白上样，电泳电压设为80v，时间90min。转膜电流设为300ma，时间90min，完成后转膜至pvdf膜上，2％bsa封闭1h，弃封闭液，洗膜3次(1
×
tbst，5min)，孵育一抗hmgcr(1:1000)、fxr(1:1000)、srepb1(1:1000)、cyp7a1(1:1000)和gapdh(1:1000)放入4℃冰箱过夜，tbst洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记二抗(1:2000)室温孵育1h。以gapdh(1:1000)作为内参对照，ecl化学发光检测蛋白质印记条带，根据蛋白灰度值分析蛋白表达水平，实验重复3次，取平均值。评估结果见图23～26，结果显示：与hfd组相比，hfd+cmu-pb-7组的hmgcr蛋白表达水平降低，fxr、srebp1和cyp7a1蛋白表达水平增加，提示cmu-pb-7可通过调节肝脏脂代谢关键
蛋白表达缓解肝脏脂肪变。
[0087]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。