MFGE8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用

mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物领域，尤其涉及mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用。


背景技术：

2.食管癌(escc)是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，治疗选择有限，具有高发病率和死亡率的特点。由于诊断技术的巨大进步以及手术、化疗、放疗和免疫疗法的发展，escc的治疗和管理已经得到改善。目前，对局部晚期escc的标准治疗是术前放化疗，然后是手术，术前放化疗是全球推荐的方法。然而，即便在有效手术治疗的前提下，食管癌患者的5年生存率仅为5-10％，预后不佳。为了提高总生存率，迫切需要切实有效的治疗工具来对食管癌进行积极地治疗。
3.乳脂球-egf因子8(mfge8)是乳腺上皮素的前蛋白，通常存在于乳腺上皮细胞中。mfge8的主要功能是通过整合素αvβ3/αvβ5充当运动吞噬细胞和凋亡细胞之间的桥梁，负责识别和高效吞噬凋亡细胞。研究表明，mfge8在生物进展过程中积极参与伤口愈合、细胞外基质(ecm)重塑和炎症的解决等生物过程。在肿瘤的研究中，mfge8在黑色素瘤中的研究最多。在黑色素瘤细胞中，mfge8敲除可抑制akt和twist信号传导，损害肿瘤细胞的生存、emt和侵袭。此外，mfge8缺失的黑色素瘤对小分子抑制剂更加敏感。然而，mfeg8在escc研究中的报道较少，其在escc中的功能研究是有限的，其在escc及escc治疗方面尚未有更进一步深入的研究。
4.针对抗体治疗方面，也有报道曾进行过与阻断mfge8或其受体有关的实验。这些阻断处理都发生在癌症以外的许多疾病的体外功能实验中。例如，阻断mfge8的抗体可降低吞噬细胞和巨噬细胞的活性。在急性胰腺炎中，mfge8的作用可被西伦吉特(一种选择性的αvβ3/5整合素抑制剂)所抑制。但目前尚未有报道mfge8中和抗体对癌症具有治疗作用。
5.因此，现有技术还有待于改进和发展。


技术实现要素：

6.鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种mfge8中和抗体的新应用，即mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用，旨在解决现有癌症的治愈率较低且mfge8中和抗体在癌症治疗中未有应用的问题。
7.本发明的技术方案如下：
8.本发明提供一种mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用。
9.可选地，所述癌症为食管癌。
10.可选地，所述药物包括活性成分，所述活性成分包括mfge8中和抗体。
11.可选地，所述活性成分包括治疗有效量的mfge8中和抗体。
12.可选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
13.可选地，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的溶剂、释放剂、抗氧化剂、防腐剂中的至少一种。
14.可选地，所述药物的剂型选自溶液剂。
15.可选地，所述药物的给药途径包括静脉内注射、静脉内输注、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射中的一种或多种的组合。
16.有益效果：本发明提供了mfge8中和抗体的新应用，即mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用，发明人经研究发现mfge8在肿瘤相关成纤维细胞中特异性表达，它可以通过激活akt/stat3信号促进肿瘤细胞的侵袭，并通过erk/akt途径结合整合素αvβ3/αvβ5来增强血管生成。因此，可以通过抑制mfge8的生成来达到防止肿瘤细胞侵袭进而治疗癌症的目的。发明人通过进一步的研究证实了靶向mfge8基因的中和抗体能够有效地在体外阻断肿瘤血管生成，防止肿瘤增殖，防止肿瘤耐药和肿瘤转移；证实了靶向mfge8基因的中和抗体能够阻止体内肿瘤生长。因此，mfge8中和抗体可实现在制备治疗癌症的药物中的应用，该药物能够提高癌症的治愈率，弥补了mfge8中和抗体在癌症治疗中的空白。
附图说明
17.图1为本发明实施例1中qpcr法检测不同细胞中mfge8的表达的结果图。
18.图2为本发明实施例2中使用elisa检测不同细胞中mfge8的表达的结果图。
19.图3为本发明实施例3中采用westernblot法检测不同细胞中mfge8水平的结果图。
20.图4为本发明实施例4中采用免疫荧光对平滑肌肌动蛋白和mfge8进行检测的结果图。
21.图5为本发明实施例5中采用免疫组化检测escc组织切片中mfge8的表达的结果图。
22.图6为本发明实施例6中对escc病人进行tcga数据库分析的结果图。
23.图7为本发明实施例7中对kyse180和kyse410进行细胞迁移与侵入实验的结果图，其中(a)为细胞迁移图，(b)为细胞统计图。
24.图8为本发明实施例8中对kyse180进行细胞增殖实验的结果图。
25.图9为本发明实施例9中分别对kyse180和kyse410进行细胞凋亡实验的结果图，其中(a)为染色图，(b)为凋亡指数图。
26.图10为本发明实施例10中血管内皮细胞增殖能力测试结果图。
27.图11为本发明实施例11中血管内皮细胞转移能力测试结果图，其中(a)为细胞迁移图，(b)为细胞统计图。
28.图12为本发明实施例12中血管内皮细胞血管形成能力测试结果图，其中(a)为血管形成图，(b)为血管密度、血管管长、分支支点统计图。
29.图13为本发明实施例13中分别采用igg、顺铂、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体、mfge8中和抗体及顺铂联用对escc肿瘤进行治疗的结果图，其中其中(a)为肿瘤大小实物图，(b)为肿瘤生长曲线。
30.图14为本发明实施例14中分别采用igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体对escc肿瘤进行治疗的结果图，其中(a)为肿瘤大小实物图，(b)为肿瘤体积数据图。
31.图15为本发明实施例15中采用免疫组化测试肿瘤增殖指标pcna和血管指标cd31结果图，其中(a)为免疫组化图，(b)为免疫指标统计图。
32.图16为本发明实施例16中肿瘤组织的ihc分析结果图。
33.图17中(a)为本发明实施例16中正常重要器官包括心、肝、胃、脾、肺和肾的ihc分析结果图，(b)为本发明实施例16中分别经重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体处理、igg处理的小鼠的正常器官的代表性h&e染色结果图。
34.图18为本发明实施例17中分别采用igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体对尾静脉小鼠模型食管癌肿瘤进行治疗的结果图。
35.图19为本发明实施例18中分别采用igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体对踝关节淋巴结模型食管癌肿瘤进行治疗后的解剖结果图。
36.图20为本发明实施例18中分别采用igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体对踝关节淋巴结模型食管癌肿瘤进行治疗后的he染色结果图。
37.图中，
★
表示具有统计学差异p《0.05，
★★
表示具有显著统计学差异p《0.01，
★★★
表示具有显著统计学差异p《0.001。
38.图中，igg表示：对照组；rm表示：只加入重组蛋白mfge8组；am表示：加入重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体组；d表示:顺铂(cisplatin)。
具体实施方式
39.本发明提供了mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
41.本发明实施例提供了mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用。事实上，本发明实施例提供了mfge8中和抗体的新应用，即mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用，发明人经研究发现mfge8在肿瘤相关成纤维细胞中特异性表达，它可以通过激活akt/stat3信号促进肿瘤细胞的侵袭，并通过erk/akt途径结合整合素αvβ3/αvβ5来增强血管生成。因此，可以通过抑制mfge8的生成来达到防止肿瘤细胞侵袭进而治疗癌症的目的。发明人通过进一步的研究证实了靶向mfge8基因的中和抗体能够有效地在体外阻断肿瘤血管生成，防止肿瘤增殖，防止肿瘤耐药和肿瘤转移；证实了靶向mfge8基因的中和抗体能够阻止体内肿瘤生长。因此，mfge8中和抗体可实现在制备治疗癌症的药物中的应用，该药物能够提高癌症的治愈率，弥补了mfge8中和抗体在癌症治疗中的空白。
42.本实施方式中，mfge8中和抗体是现有技术中的已知物质，可自行制备，也可通过购买的方式获得。
43.在一种实施方式中，所述癌症为食管癌。发明人首次发现了mfge8在escc中仅在肿瘤相关成纤维细胞中(而不是在escc的其他细胞中)表达，它可以通过激活akt/stat3信号促进escc细胞的侵袭，并通过erk/akt途径结合整合素αvβ3/αvβ5来增强血管生成。本实施方式中提供了一种新的有效治疗escc进展的思路，即通过抑制肿瘤相关成纤维细胞分泌的mfge8来实现，通过在体内注射含有mfge8中和抗体的药物，可用于治疗食管癌，提高食管癌的治愈率，弥补了mfge8中和抗体在食管癌治疗中的空白。
44.在一种实施方式中，所述药物包括活性成分，所述活性成分包括mfge8中和抗体。本实施方式中，治疗癌症包括食管癌的药物的活性成分为mfge8中和抗体。
45.在一种实施方式中，所述活性成分包括治疗有效量的mfge8中和抗体。本实施方式中，治疗有效量是指足以对个体显示益处或临床意义的本发明实施例的mfge8中和抗体的使用剂量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性、被治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等。
46.在一种实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的辅料是指本领域技术人员已知的适合于特定的给药模式的任何辅料，辅料应当是无毒的、不干扰或不损害本发明实施例活性成分的效力，且该辅料可以根据上述实施例所述药物的具体剂型而灵活选用。
47.在一种实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括药学上可接受的溶剂、释放剂、抗氧化剂、防腐剂中的至少一种。溶剂、释放剂、抗氧化剂、防腐剂可为本领域常用的溶剂、释放剂、抗氧化剂、防腐剂，此处不再赘述。
48.在一种实施方式中，所述药物的剂型选自溶液剂。
49.在一种实施方式中，所述药物的给药途径包括静脉内注射、静脉内输注、腹膜内注射、肌内注射、皮下注射中的一种或多种的组合。通过这些给药途径，可实现对癌症，尤其是食管癌的治疗，提高总生存率。
50.下面通过具体的实施例进行详细说明。
51.(1)如无特殊说明，以下实施中采用的mfge8中和抗体和重组蛋白mfge8的信息如下表1所示。
52.表1mfge8中和抗体和重组蛋白mfge8的信息
[0053][0054]
(2)以下实施例进行测试时需要使用的抗体可参见如下表2。
[0055]
表2抗体使用表
[0056][0057][0058]
(3)如无特殊说明，以下实施例中涉及到的细胞培养具体可参见如下：
[0059]
a、escc细胞系(kyse30、kyse140、kyse180、kyse410、kyse510和kyse520)使用添加了1％的200mm l-谷氨酰胺(gibco brl，grand island，ny，usa)和10％的胎牛血清(fbs)(gibco brl，grand island，ny，usa)的rpmi-1640培养基(gibco brl，grand island，ny，usa)。
[0060]
b、高葡萄糖dulbecco's modified eagle medium(gibco brl，grand island，ny，usa)，含有1％200mm l-谷氨酰胺(gibco brl,grand island,ny,usa)和10％fbs(gibco brl，grand island，ny，usa)来被用于培养escc细胞系(ec18和hkesc1)。
[0061]
c、角质细胞-sfm：eplife(1:1)培养基(gibco brl，grand island，ny，usa)用于培养正常食管上皮细胞系(ne1和ne3)。所有的细胞都在37℃和5％的co2下培养。
[0062]
d、肿瘤相关成纤维细胞(caf)、正常成纤维细胞(nf)、血液循环成纤维细胞(bf)的获得：
[0063]
从正常组织和配对的肿瘤中培养nf和cafs。将新鲜采集的escc肿瘤组织及其配对的非肿瘤食管组织切成尽可能小的碎片，分别在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)中简单冲洗，然后用胶原酶消化。用20mm不锈钢网过滤消化后的悬浮液，收集单细胞悬浮液。将滤液离心，清洗，最后放入6cm的组织培养皿中，储存在5ml含有20％fbs的dmem培养基中。在37℃下培养30min后，洗掉非粘附细胞(主要是肿瘤细胞)，分别得到纯的nf和caf。
[0064]
从escc患者的外周血中分离出bf，并在健康对照组和小鼠的外周血中进行培养。在手术切除前后，从患者和健康对照组中抽取10ml血样，放入肝素化管中。在ficoll-paque premium(ge healthcare，hatfield，hertfordshire，uk)上，根据制造商的协议，通过密度梯度沉淀分离总的pbmc。将pbmc培养在6孔板上，每孔5
×
106个细胞，在dmem中加入10％fbs。3天后，通过单次抽吸除去粘附的细胞，并更换培养基。培养10天后，得到bf。
[0065]
实施例1
[0066]
(1)实时荧光定量pcr法(qpcr)：
[0067]
用trizol试剂(invitrogen，carlsbad，ca)提取总rna，应用primescript
tm
rt-pcr试剂盒(takara，kusatsu city，japan)来进行cdna。在ht7900系统(roche applied science,penzberg,germany)下使用tb green premix ex taq ii(takara,kusatsu city,japan)进行qpcr。其中，使用的引物如下表3所示。
[0068]
表3引物序列
[0069][0070]
(2)使用上述qpcr法检测正常成纤维细胞(nf)，血液循环成纤维细胞(bf)，肿瘤相关成纤维细胞(caf)、食管癌癌旁组织(escc n)、食管癌组织(escc t)中mfge8的表达，结果如图1所示。结果表明mfge8在caf中的表达显著高于其他细胞。
[0071]
实施例2
[0072]
使用elisa检测试剂盒elisa(r&d systems,minneapolis，usa)检测正常成纤维细胞(nf)和肿瘤相关成纤维细胞(caf)培养上清液中的mfge8的表达，每个样品
重复测定3次，具体操作参照制造商说明，结果如图2所示。结果表明caf中mfge8的表达显著高于nf中mfge8的表达。
[0073]
实施例3
[0074]
采用western blot法对食管正常细胞(ne1、ne3)，escc细胞(kyse30、kyse140、kyse510、kyse520)，正常成纤维细胞(nf1、nf2)以及肿瘤相关成纤维细胞(caf1、caf2)进行蛋白水平检测，收集样品后，电泳胶跑出蛋白条带。分离胶80v，30min，浓缩胶100v，1h。转膜2h后，用5％脱脂牛奶进行封闭后，一抗4℃过夜。tbst洗涤三次，每次15min。二抗室温孵育1h后，进行暗室曝光。过程中使用的抗体参考上述抗体使用表2。结果如图3所示，结果表明mfge8在肿瘤相关成纤维细胞中显著高表达。
[0075]
实施例4
[0076]
采用免疫荧光对平滑肌肌动蛋白(a-sma)和mfge8进行检测。escc组织切片用二甲苯脱蜡后，将escc组织切片在98℃的10mm柠檬酸缓冲液中进行抗原修复10～20min，并冷却数小时直至室温。用10％正常山羊血清封存escc组织切片1h以上，用一抗在4℃下孵育过夜。用tbs冲洗一抗，用荧光体偶联的二抗孵育30min。dapi对细胞核进行染色(invitrogen,carlsbad,ca)。过程中使用的抗体参考上述抗体使用表2。
[0077]
a-sma是肿瘤相关成纤维细胞(caf)特异性表达的蛋白。测试结果如图4所示，a-sma(绿色荧光)与mfge8(红色荧光)显示出了细胞共定位，证实了mfge8和a-sma的共定位，证实mfge8在caf上的特异性表达。
[0078]
实施例5
[0079]
采用免疫组化检测escc组织切片中mfge8的表达，免疫组化采用了标准的链霉蛋白-生物素过氧化物酶复合物方法，escc组织切片用二甲苯脱蜡后，用h2o2(0.3％)阻断内源性过氧化物酶10min。将escc组织切片在98℃的10mm柠檬酸缓冲液中进行抗原修复10～20min，并冷却数小时直至室温。用10％正常山羊血清封存食管癌组织切片1h以上，用一抗在4℃下孵育过夜。用pbs冲洗组织切片4次，每次15min。用二抗在37℃下孵育30min。用苏木精和制备的dab(dako，carpinteria，ca)孵育3～10s，对细胞核进行染色，使用的抗体来自abcam(ab17787，1:100)，具体见上表2。测试结果如图5所示，结果表明mfge8特异性表达在肿瘤相关成纤维细胞中(棕色染色代表mfge8阳性细胞)。
[0080]
实施例6
[0081]
对escc病人进行tcga数据库分析，结果如图6所示，高表达mfge8病人显示出与差的总生存期、无疾病进展和更高的肿瘤分期相关。
[0082]
综上，实施例1-6的研究表明mfge8蛋白仅特异性高表达在escc成纤维细胞(caf)上，且高表达mfge8与escc不良预后高度相关。
[0083]
如无特殊说明，以下实施例7-12的细胞实验均在重组蛋白mfge8或其中和抗体刺激三天后进行。其中mfge8中和抗体在重组蛋白mfge8刺激10min之后加入。
[0084]
实施例7
[0085]
对kyse180和kyse410进行细胞迁移与侵入实验。在无血清培养基的上室中加入大约8
×
104个细胞，在下层24孔板中加入含有10％fbs的dmem培养基。培养24～48h后，刮除上室膜上表面的粘附细胞，并用0.5％结晶紫染色。在显微镜下计算膜表面的细胞数量，每张膜统计5个视野。结果如图7所示，其中(a)为细胞迁移图，(b)为细胞统计图，结果表明加入
重组蛋白mfge8以后细胞的转移和侵袭效率显著增强，而这种能力随后又被mfge8中和抗体的加入抑制。
[0086]
实施例8
[0087]
对kyse180进行细胞增殖实验。在96孔板中，每个孔中接种1
×
103个细胞，利用细胞增殖xtt试剂盒(roche applied science，penzberg，germany)检测细胞增殖率。每个细胞系重复三次，每天测量。结果如图8所示，结果表明重组蛋白mfge8能够显著增强细胞增殖能力，且这种细胞增殖能力的获得能够被加入mfge8中和抗体后有效抑制。
[0088]
实施例9
[0089]
对kyse180和kyse410分别进行细胞凋亡实验。在6孔板中，每个孔中接种约5
×
105个细胞，并在每个孔中加入2ml含有1％fbs和重组蛋白mfge8的rpmi 1640培养基或pbs和重组蛋白mfge8、mfge8中和抗体的rpmi 1640培养基或pbs和igg的rpmi 1640培养基。孵化24h后，加入5或7μg/ml顺铂，在6孔中孵化48h。根据制造商的说明，用bd apoptosis detection kit(bd biosciences，san jose，ca)收集细胞，并用fitc标记的annexin-v和pi双重染色。细胞由bd lsrfortessa分析仪进行分析。数据由flowjo进行分析，结果图9所示，其中(a)为染色图，(b)为凋亡指数图，结果表明重组蛋白mfge8能够显著抑制由顺铂引起的细胞凋亡，而mfge8中和抗体的进一步加入恢复了顺铂对细胞凋亡的抑制作用。
[0090]
实施例10
[0091]
对血管内皮细胞(huvecs)增殖能力进行测试。在96孔板中，每个孔中接种1
×
103个细胞，利用细胞增殖xtt试剂盒(roche applied science，penzberg，germany)检测细胞增殖率。每个细胞系重复三次，每天测量。结果如图10所示，结果表明重组蛋白mfge8能够显著增强细胞增殖能力，这种细胞增殖能力的获得能够被加入mfge8中和抗体后有效抑制。
[0092]
实施例11
[0093]
对血管内皮细胞(huvecs)转移能力进行测试。在无血清培养基的上室中加入大约8
×
104个细胞。在下层24孔板中加入含有10％fbs的dmem。培养24～48h后，刮除上室膜上表面的粘附细胞，并用0.5％结晶紫染色。在显微镜下用计算膜表面的细胞数量，每张膜统计5个视野。
[0094]
结果如图11所示，其中(a)为细胞迁移图，(b)为细胞统计图，结果表明加入重组蛋白mfge8以后细胞的转移和侵袭效率显著增强，而这种能力随后又被mfge8中和抗体的加入抑制。
[0095]
实施例12
[0096]
对血管内皮细胞(huvecs)血管形成能力进行测试。将huvecs重新悬浮在含有重组蛋白mfge8或重组蛋白mfge和mfge8中和抗体的medium 200中。将2.5
×
104个细胞接种在96孔板的固化matrigel(bd biosciences)上。细胞在37℃下培养4～6h。显微镜下，观察管状网络并拍照统计相关信息。结果如图12所示，其中(a)为血管形成图，(b)为血管密度、血管管长、分支支点统计图，结果表明加入重组蛋白mfge8以后细胞的血管形成能力显著增强，而这种能力随后又被mfge8中和抗体的加入抑制。
[0097]
综上，实施例7-12的结果表明，caf分泌的mfge8能够显著促进血管的生成和肿瘤细胞的生长转移，而mfge8中和抗体能够有效地抑制这些促癌功能。
[0098]
实施例13
[0099]
分别用igg、顺铂、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体、mfge8中和抗体及顺铂联用对食管癌肿瘤进行治疗。将1
×
106个kyse180细胞悬浮在100ul pbs中，用针头皮下注射到4周龄裸鼠体内，接下来，裸鼠皮下植入了kyse180形成的1mm3的肿瘤。每4天对小鼠的肿瘤形成进行监测。肿瘤体积按公式v＝0.5
×
l
×
w2计算，其中l为最长尺寸，w为最短尺寸。当肿瘤体积适合于进一步的实验时，小鼠被牺牲，并进行异种移植，移植第四天后进行给药，分别为igg、顺铂(cisplatin，2.5mg/kg)、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体(am)、mfge8中和抗体及顺铂联用(am+cisplatin)，每4天测一次肿瘤体积，结果如图13所示，其中(a)为肿瘤大小实物图，(b)为肿瘤生长曲线。结果表明，靶向mfge8的治疗有效缩小了肿瘤的大小。
[0100]
实施例14
[0101]
用igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体对食管癌肿瘤进行治疗。具体步骤可参见实施例13，结果如图14所示，其中(a)为肿瘤大小实物图，(b)肿瘤体积数据图。结果表明，重组蛋白mfge8能够有效促进肿瘤的增殖，而mfge8中和抗体抑制了肿瘤的增殖。
[0102]
实施例15
[0103]
免疫组化测试肿瘤增殖指标pcna和血管指标cd31。结果如图15所示，其中(a)为免疫组化图，(b)为免疫指标统计图，结果表明pcna和cd31在重组蛋白mfge8中显著高表达，这种高表达在mfge8中和抗体加入后被抑制。
[0104]
实施例16
[0105]
对小鼠腹腔注射mfge8中和抗体，利用ihc分析评估小鼠腹腔注射mfge8中和抗体后与肿瘤组织和正常重要器官包括心、肝、胃、脾、肺和肾的结合活性，结果分别如图16和17所示，比例尺＝100μm(图16)；50μm(图17中(a))；20μm(图17中(b))，图16为肿瘤组织的ihc分析结果图，图17中(a)为正常重要器官包括心、肝、胃、脾、肺和肾的ihc分析结果图，(b)为分别经重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体处理、igg处理的小鼠的正常器官的代表性h&e染色结果图。结果表明，用mfge8中和抗体治疗时，在上述正常重要器官中没有观察到明显的组织学变化。
[0106]
实施例17
[0107]
用igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体，对尾静脉小鼠模型食管癌肿瘤进行治疗，通过nod scid小鼠的尾静脉注射1
×
106个kyse410或kyse180细胞，6周龄，小鼠在90天左右被牺牲，进行异种移植，移植后第四天开始给药(每周2次)，分别为igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体，结果如图18所示，mfge8中和抗体能够有效在体内抑制由重组蛋白mfge8引起的小鼠食管癌肺转移。
[0108]
实施例18
[0109]
用igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体对踝关节淋巴结模型食管癌肿瘤进行治疗。将1
×
106个kyse180细胞注射到小鼠的跗关节，即踝关节上方的外侧跗关节区域，小鼠在40天左右被牺牲，进行异种移植，移植后第五天开始给药(每周2次)，分为igg、重组蛋白mfge8、重组蛋白mfge8和mfge8中和抗体。解剖结果如图19所示，he染色结果如图20及下表4所示(he染色过程为：石蜡切片脱蜡后，hematoxylin染色1min，自来水转色。eosin染色5min，过100％酒精风干)。结果表明mfge8中和抗体能够有效在体内抑制由重组蛋白mfge8引起的小鼠食管癌踝关节淋巴结转移。
[0110]
表4淋巴结转移情况
[0111]
cell typecell countlm metastasislgg1
×
1061/4rm1
×
1064/4am1
×
1060/4
[0112]
综上所述，本发明提供了mfge8中和抗体的新应用，即mfge8中和抗体在制备治疗癌症的药物中的应用，发明人经研究发现mfge8在肿瘤相关成纤维细胞中特异性表达，它可以通过激活akt/stat3信号促进肿瘤细胞的侵袭，并通过erk/akt途径结合整合素αvβ3/αvβ5来增强血管生成。因此，可以通过抑制mfge8的生成来达到防止肿瘤细胞侵袭进而治疗癌症的目的。发明人通过进一步的研究证实了靶向mfge8基因的中和抗体能够有效地在体外阻断肿瘤血管生成，防止肿瘤增殖，防止肿瘤耐药和肿瘤转移；证实了靶向mfge8基因的中和抗体能够阻止体内肿瘤生长。因此，mfge8中和抗体可实现在制备治疗癌症的药物中的应用，该药物能够提高癌症的治愈率，弥补了mfge8中和抗体在癌症治疗尤其是食管癌治疗中的空白。
[0113]
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。