青藤碱在治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及青藤碱在治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用。


背景技术：

2.在抗击sars-cov-2疫情过程中，中医药发挥了重要的作用，发现中草药中所含针对新冠病毒的活性成分能够制备成抑制病毒复制的高效、低毒/无毒的药品、食品、保健食品和消毒制剂等，这对于预防感染及早期干预阻断新冠肺炎病情进展具有重大意义。现有技术中对这类活性成分的发现和应用还有待进一步改善，才能更好的防治新冠病毒或其他病毒。
3.青藤碱具有显著的镇痛镇静、镇咳局麻、降血压、抗炎作用，为植物中很强的组织胺释放剂。动物实验提示青藤碱在休克和器官损害中有保护作用，青藤碱在临床上用于治疗风湿性关节炎和神经痛。研究人员正在探索青藤碱在新领域的应用。


技术实现要素：

4.基于此，本发明的目的在于，提供一种青藤碱在治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用，本发明通过实验确定青藤碱对sars-cov-2相关靶点具有相互作用，且与rbd蛋白、 ace蛋白亲和力好。此外，青藤碱还对hcov-229e、h1n1病毒具有显著的抑制作用，并能抑制多种炎症动物模型病理程度恶化和减低体内炎症介质和细胞因子水平。
5.本发明的第一个目的是提供一种药物，包括青藤碱或其药学上可接受的盐，所述青藤碱或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.1-1000mg/kg(即每kg重的给药量为0.1-1000mg的青藤碱或其药学上可接受的盐)。
6.本发明的另一个目的是提供青藤碱或其药学上可接受的盐在治疗冠状病毒、流感病毒的药物中的应用；所述青藤碱或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.1-1000mg/kg。
7.青藤碱的结构式如式(1)：
8.9.进一步地，所述青藤碱或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.5-500mg/kg。
10.进一步地，所述青藤碱或其药学上可接受的盐的给药剂量为5-400mg/kg。
11.进一步地，所述青藤碱或其药学上可接受的盐的给药剂量为100-150mg/kg。
12.进一步地，所述冠状病毒选自新型冠状病毒sars-cov-2和/或冠状病毒hcov 229e。
13.进一步地，所述流感病毒为流感病毒h1n1。
14.进一步地，所述应用中的药物中的青藤碱是通过作用于sars-cov-2的spike蛋白(刺突蛋白)结合域及其受体ace2蛋白来抑制sars-cov-2感染。
15.进一步地，所述应用中的药物中的青藤碱是通过与sars-cov-2相关靶点plpro、 3clpro、rdrp、s ace2相互作用来抑制sars-cov-2感染。
16.进一步地，所述应用中的青藤碱至少满足以下任一条件：
17.(1)与rbd蛋白亲和力常数小于100μm；
18.(2)与ace2蛋白亲和力常数小于100μm。
19.本发明另一个目的是提供青藤碱或其药学上可接受的盐在制备防治冠状病毒、流感病毒的食品、化妆品或消毒剂中的应用；所述青藤碱或其药学上可接受的盐的给药剂量为 0.1 1000mg/kg。
20.进一步地，所述食品还包括保健品。
21.进一步地，所述青藤碱来自于防已科植物青藤的根和茎，蝙蝠葛叶等植物中提取或化学合成或生物工程技术合成。
22.青藤碱具有抗炎活性，能够调节机体内炎症介质和细胞因子水平，且无不良反应的优点。
23.相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
24.通过实验确定了青藤碱对新型冠状病毒sars-cov-2相互作用的靶点及其对 sars-cov-2的spike蛋白结合域的rbd蛋白、受体蛋白ace2具有高蛋白亲和力；此外，青藤碱还可抑制sar cov 2、hcov 229e、h1n1病毒活性，且可减轻炎症动物模型的体内炎症反应。本发明首次确定青藤碱具有对sars-cov-2的抑制作用及其作用靶点，且未见毒性反应。因此，青藤碱有可能开发成为抑制严重急性呼吸系统综合征sars-cov-2感染的食品、保健食品、药品、化妆品和消毒剂，具有良好的市场应用前景。
附图说明
25.图1为实施例3中青藤碱和瑞德西韦对sars-cov-2病毒感染veroe6细胞的抑制作用；
26.图2为实施例3中青藤碱和瑞德西韦对hcov-229e病毒感染huh-7细胞的抑制作用；
27.图3为实施例3中青藤碱对h1n1病毒感染mdck细胞的抑制作用；
28.图4为实施例6中青藤碱和瑞德西韦对huh-7细胞的mtt细胞毒性试验结果；
29.图5为实施例6中青藤碱对vero e6细胞的mtt细胞毒性试验结果。
具体实施方式
30.为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进
行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
31.以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
32.实施例1
33.本实施例探究青藤碱与新冠病毒相关靶点间相互作用。
34.通过从现有技术中的数据库中查阅青藤碱、新型冠状病毒sars-cov-2三维结构后，在工作站中通过分子对接计算方法寻找蛋白质活性配体来确定青藤碱与新型冠状病毒 sars-cov-2相关靶点间的相互作用。
35.结果显示：青藤碱与新型冠状病毒sars-cov-2中病毒复制蛋白酶(plpro)、3c类似蛋白酶oclpro)、核糖核酸合成酶(rdrp)、刺突蛋白-宿主细胞的ace2受体(s-ace2) 等4个靶点具有相互作用，结果如表1所示(表1中的负值绝对值大于5表示青藤碱与靶点间有较强的相互作用；负值的绝对值越大，说明青藤碱与靶点的相互作用越强)。
36.表1：青藤碱与新型冠状病毒相关靶点间相互作用计算机分子模拟对接分值
[0037][0038][0039]
实施例2
[0040]
本实施例探究青藤碱与ace2、sars-cov-2中刺突蛋白(spike)亲和力试验。
[0041]
将青藤碱采用二倍梯度稀释法稀释6个浓度梯度后，分别与制备好的rbd探针、ace2 探针在分子相互作用仪上进行检测，检测结果发现青藤碱与rbd蛋白(kd＝12.74
±
5.12)、 ace2蛋白(kd＝27.12
±
4.53)具有较强的亲和力(kd值越小表明亲和力越大，kd《100μm 即提示有较强亲和力，μm表示μmol/l)，结果如表2所示。
[0042]
表2：青藤碱与sars-cov-2的spike蛋白(刺突蛋白)结合域、ace2蛋白的亲和力
[0043]
rbd探针kd(μm)ace2探针kd(μm)12.74
±
5.1227.12
±
4.53
[0044]
实施例3
[0045]
本实施例探究青藤碱对sars-cov-2、hcov-229e、h1n1病毒的抑制活性试验。
[0046]
96孔培养板每孔加入100μl浓度为2
×
105个/ml的huh-7或vero e6细胞，37℃、5％co2培养24小时；药物实验组和病毒对照组加入50个tcid50(半数组织培养感染剂量)的 hcov-229e或sars-cov-2病毒液100μl/孔，37℃、5％co2培养箱吸附1小时。弃去培养液，加入100μl/孔的两倍梯度稀释的受试药物，每个浓度4个复孔，同时设立细胞对照、病毒对照(阴性对照)和阳性药物对照瑞德西韦(remdesivir)。
[0047]
37℃、5％co2孵箱孵育3天后，光学显微镜下记录cpe(病毒引起的细胞病变)，程度按以下6级标准记录出现cpe的细胞占总细胞的百分比：
“‑”
表示“无”；
“±”
表示“小于10％”；“+”表示“25％”；“++”表示“50％”；“+++”表示“75％”；“++++”表示“》75％”。记录cpe
后，弃上清，mtt染色(嚓喳蓝染色)(方法同药物细胞毒性试验)。采用软件graphpad prism8.0 的nonlinear regression方法计算cpe减少法和mtt染色法中药物对病毒感染致细胞死亡的半数抑制浓度(ic
50
)。计算选择指数si(si为selective index，选择性指数，细胞毒性cc
50
与ic
50
的比值，细胞毒性越小，cc
50
数值就越大，si值也就越大，抗病毒的选择性就越高)。
[0048]
图1为实施例3中青藤碱和瑞德西韦对sars-cov-2病毒感染vero e6细胞的抑制作用，其中，图1中的(a)表示青藤碱对sars-cov-2病毒感染vero e6细胞的抑制作用，青藤碱对sars-cov-2感染致cpe具有显著抑制作用(其ic
50
＝53.31μm)；图1中的(b)表示瑞德西韦对sars-cov-2病毒感染vero e6细胞的抑制作用，瑞德西韦对sars-cov-2感染致 cpe显示出抑制活性(其ic
50
＝0.637μm)(图1中纵坐标“inhibition”表示“抑制率”，横坐标表示浓度)。
[0049]
图2为实施例3中青藤碱和瑞德西韦对hcov 229e病毒感染huh 7细胞的抑制作用；其中，图2中的(a)表示青藤碱对hcov 229e病毒感染huh 7细胞的抑制作用(ic
50
＝ 51.70μm，si＝3.88)；图2中的(b)表示瑞德西韦对hcov 229e病毒感染huh 7细胞的抑制作用(ic
50
＝0.05218μm，si＞1000)(图2中的“cpe reduction assay”表示“cpe还原测定”，“mtt assay”表示“mtt测定”)。
[0050]
图3为实施例3中青藤碱对h1n1病毒感染mdck细胞的抑制作用；青藤碱(ic
50
＝14.66μm)对h1n1病毒感染致cpe具有抑制作用。
[0051]
实施例4
[0052]
本实施例探究青藤碱对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用。
[0053]
除空白对照组外，所有小鼠腹背部剃毛，第0天和第1天，分别取20μl已配好的0.5％二硝基氟苯(dnfb)造模剂均匀涂抹在造模组小鼠的腹背部，取20μl丙酮/橄榄油混合液均匀涂抹在空白对照组小鼠的腹背部。第6天取20μl已配好的0.5％dnfb造模剂均匀涂抹在造模组小鼠的左耳上下两面，取20ul丙酮/橄榄油混合液均匀涂抹在空白对照组小鼠的左耳上下两面，右耳均不涂，作对照。按造模情况随机分组后，造模当天(第0天)给药两小时后开始造模，连续口服给药至第8天后处死动物，取相关脏器进行检测，结果如表3所示。 (50mg青藤碱对应的是151.79μmol，对应1.51
×
106μm)。
[0054]
表3：小鼠耳肿胀厚度的测试结果
[0055][0056][0057]
从表3可以看出，青藤碱可减轻二硝基氟苯所致的小鼠耳肿胀，随着给药剂量的增加，耳肿胀缓解程度越明显。以上结果说明：青藤碱可缓解二甲苯致耳肿胀小鼠体内炎症水平。
[0058]
实施例5
[0059]
本实施例探究青藤碱对角叉菜胶所致大鼠急性足肿胀的影响。
[0060]
大鼠随机分组，青藤碱按照不同浓度灌胃给药7天后按照毛细管放大测量法测量所有大鼠右后足足容积作为基础足容积；测量完毕后在其右后足足跖部位皮下注射角叉菜胶0.1ml/ 只，空白对照组注射等体积生理盐水。注射完毕后，分别用毛细管放大测量法测量致炎后1 小时、2小时、3小时、4小时、5小时大鼠右后足足容积。其后处死大鼠，进行相关脏器检测，结果如表4和表5所示。
[0061]
表4：大鼠急性足肿胀增加的体积的测试结果
[0062][0063][0064]
从表4可以看出，青藤碱能抑制大鼠足肿胀，且具有剂量依赖关系，表明青藤碱可缓解角叉菜胶引起大鼠急性足肿胀模型的体内炎症水平。
[0065]
表5：青藤碱对角叉菜胶所致的大鼠急性足肿胀模型血沉的影响结果
[0066] 血沉(均数
±
标准差)(mm)空白对照组9.37
±
2.15模型组16.78
±
4.74地塞米松阳性药对照组(1mg/天/kg)6.42
±
2.42青藤碱低剂量组(50mg/天/kg)11.94
±
3.33
青藤碱中剂量组(100mg/天/kg)11.79
±
3.36青藤碱高剂量组(150mg/天/kg)8.73
±
3.82
[0067]
从表5可以看出，青藤碱能抑制大鼠足血沉(血沉指红细胞沉降率)，且具有剂量依赖关系，表明青藤碱可缓解角叉菜胶引起大鼠急性足肿胀模型的体内炎症水平。
[0068]
实施例6
[0069]
青藤碱细胞毒性试验(mtt法)
[0070]
96孔培养板每孔加100μl浓度为1
×
105个/ml的huh-7或vero e6细胞，37℃、5％co2培养24小时；药物实验组和空白对照组加入100μl/孔的两倍梯度稀释的受试药物，每个浓度4个复孔，同时设立细胞对照和阳性药物对照瑞德西韦(remdesivir)，继续培养24h。加入10μl mtt继续孵育4h后，弃上清，加入150μl的dmso，用全波长多功能酶标仪检测 490nm处吸光度值。
[0071]
图4为实施例6中青藤碱和瑞德西韦对huh-7细胞的mtt细胞毒性试验结果；图4中的(a)为青藤碱对huh-7细胞的mtt细胞毒性试验结果，青藤碱对huh-7细胞的无毒浓度为cc0＝82.80μm，cc
50
＝256.21μm；图4中的(b)为瑞德西韦对huh-7细胞的mtt细胞毒性试验结果，瑞德西韦对huh-7细胞的无毒浓度为cc0＝51.76μm,cc
50
＝111.90μm(图4中的纵坐标“cell viability”表示“细胞活力”，横坐标表示浓度)。
[0072]
图5为实施例6中青藤碱对vero e6细胞的mtt细胞毒性试验结果，青藤碱对vero e6 细胞的半数毒性浓度为84.66
±
4.25μm(图5中的纵坐标“cell viability"表示“细胞活力”，横坐标表示浓度)。
[0073]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，则本发明也意图包含这些改动和变形。