一种长效微粒iii型胶原蛋白植入剂
技术领域
1.本发明涉及一种注射植入剂。具体来说，涉及一种性能优异的一种长效微粒iii型胶原蛋白植入剂。
2.技术背景ⅲ型胶原蛋白，是人体皮肤、筋膜、肌腱中主要的胶原蛋白，与i型胶原蛋白比例为4比1。ⅲ型胶原蛋白较细小，存在于表皮层和真皮层之间，称之为“婴儿胶原蛋白”。微胶原层（cushion network）主要由ⅲ型胶原蛋白构成，是位于表皮层与真皮层之间的组织结构，是撑起表皮的关键，也是肌肤塌陷的第一步。
[0003]ⅲ型胶原蛋白在炎症和抗原反应中引起的作用最小，已被中国、美国的食品和药品管理部门批准用于许多类型的医疗应用，包括伤口辅料和人工皮肤。
[0004]
然而，ⅲ型胶原蛋白有体内存留时间短等重大不足。
[0005]
虽然，现有一些长效胶原蛋白技术，例如：cn 101648989（长效型胶原蛋白及其制造方法）：本发明公开了一种长效型胶原蛋白及其制造方法，是将一猪皮经过刮除多余组织、 去除油脂、膨润、消化、离心分离、盐析、收集下层沉淀物、冷冻干燥后即可得一胶 原蛋白，再将该胶原蛋白与γ-聚麸胺酸(γ-pga)混合，同时加入一戊二醛溶液并搅拌均 匀，进行第一交联，再重复加入该戊二醛溶液搅拌均匀，进行第二次交联后，即可得 该长效型胶原蛋白，其可解决习用胶原蛋白的存留时间过短、必须常常补充施打，以 及会残留高浓度的戊二醛，具有生物毒性会危害人体健康等缺点；cn102924731a（一种三重交联的胶原蛋白及制造方法和用途）：一种三重交联胶原蛋白的制造方法，包括：提供一可溶性的胶原蛋白样品；混合该胶原蛋白样品与一第一交联剂，以形成一重交联的胶原蛋白；混合该一重交联的胶原蛋白与一第二交联剂，以形成二重交联的胶原蛋白；以及混合该二重交联的胶原蛋白与一第三交联剂，以形成三重交联的胶原蛋白。其中，第一交联剂、第二交联剂、及第三交联剂分别选自由：醛类交联剂、亚胺类交联剂及环氧化物交联剂所组成的群组，且第一交联剂异于第二交联剂，第三交联剂异于第一交联剂及第二交联剂；但是，上述技术使用化学改性方法，虽然效果显著，但是存在化学试剂残留与改性过程中形成有害物质的风险, 此外，还有反应条件不温和、产生副产物、特异性差、催化效率和产率低及工过程中胶原蛋白有损失等不足。
[0006]
更重要的是，上述胶原蛋白是在均相中整体交联的，或者交联成一个巨大的粒子，不是很小的微粒，更不是大小基本均匀的微粒，然而，使用时却是较小的粒子，因而，其表观疗效不一致，如效期波动大。
[0007]
此外，其制剂基本为凝胶剂，因其水分散体系粘度高在生产使用中造成诸多不便，如剂量分装不准，注射时通针性不好。
[0008]
因此，现实中需要一种iii型胶原蛋白植入剂，其有长效且效期波动小，通针性好等优势。
技术实现要素：
[0009]
本发明的目的就是提供一种性能改善的长效且效期波动小、通针性好的微粒iii型胶原蛋白植入剂及其制备方法。
[0010]
本发明人发现，通过谷氨酰胺转氨酶把普通iii型胶原蛋白改性成大小基本均匀的微粒交联胶原蛋白，不仅可以延长其在体内的作用时间，而且效期波动小，还使其水分散体系的粘度下降，解决其在生产使用中造成诸多问题，如可准确分装剂量，使注射时通针性较好；此外，还可以减少有害物质的混入、使反应条件温和、降低工过程中胶原蛋白的损失、提高特异性、不产生副产物、提高催化效率和提高产率等。
[0011]
谷氨酰胺转氨酶 (transglutaminase, ec2.3.2.13)，简称tg 酶，属于酰基转移酶。谷氨酰胺转氨酶催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-羟胺基团与伯胺化合物 (酰基受体) 之间发生酰基转移反应，生成异肽键，从而使蛋白质发生共价交联。在反应过程中，每个交联释放一个氨分子。如果胺基底物不能作为酰基受体，tg 酶可利用水作为酰基受体催化谷氨酰胺残基的脱胺化。
[0012]
tg 酶对酰基受体底物具有宽泛性。
[0013]
tg 酶介导的分子交联能够提高胶原蛋白的热稳定性和持水力等特性，有助于形成强有力的凝胶， 改善胶原蛋白植入剂的性能。
[0014]
tg 酶还可催化胶原蛋白发生脱酰胺反应，改善胶原蛋白的起泡性和乳化性，从而使胶原蛋白植入剂更好地微粒化，去凝胶化，降低粘度，性能大大改善。
[0015]
基于此，完成了本发明。
[0016]
本发明涉及一种（性能改善的）长效且效期波动小、通针性好的微粒iii型胶原蛋白植入剂的制备方法，该方法包括：（1）、制备温度不高于4℃的包括表面活性剂及挥发性的不完全溶于水的有机溶剂的溶液，即油相；（2）、制备温度不高于4℃的包括iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，即水相；（3）、上述水溶液制备完成后30分钟内把上述水溶液与上述有机溶剂的溶液混合，并使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至-4℃24小时以上，较佳地48小时以内，使胶原蛋白基本交联；（4）、上述胶原蛋白基本交联后滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm之间的微粒；（5）、上述保留的微粒洗涤后低温冷冻法除去其中溶剂。
[0017]
本发明涉及一种（性能改善的）长效且效期波动小、通针性好的微粒iii型胶原蛋白植入剂，该胶原蛋白植入剂包括：使用谷氨酰胺转氨酶交联的iii型胶原蛋白微粒，微粒的粒径位于0.5μm至25μm之间。
具体实施方式
[0018]
较佳地，上述水性溶液，即水相中iii型胶原蛋白的质量浓度为0.1%-10%，更佳地0.5%-5%；较佳地，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为1-10u/g，较佳地4-8u/g，更佳地5-6u/g。
[0019]
上述有机溶剂包括但不限于c1～c6酸与c1～c6醇形成的酯，如乙酸乙酯、乙酸甲酯、丙酸乙酯、乙酸丁酯、戊酸戊酯、异戊酸异戊酯等；c1～c6醇与c1～c6醇形成的醚，如乙醚，甲乙醚；c3～c6酮，如丙酮。
[0020]
上述表面活性剂包括但不限于亲油性表面活性剂，特别是hlb值为3～8的亲油性表面活性剂，其实例如司盘类表面活性剂，如span20 、40、60或 80，糖酯类表面活性剂，如c12～c18酸葡萄糖酯；c12～c18酸丙二醇酯；c12～c18酸丙三醇（甘油）酯；以共它们的组合。
[0021]
上述亲油性表面活性剂可与其重量比0.1～5%的亲水性表面活性剂合用，如tween 80。
[0022]
谷氨酰胺转氨酶应在油包水型乳液形成前加入水相中，不应在油包水型乳液形成前或后加入油相中，否则iii型胶原蛋白植入剂性能下降或消失。
[0023]
上述油相与上述水相的体积比为2.5～10，较佳为3～6。
[0024]
上述水性溶液制备完成后应在30分钟内把上述水性溶液与油性溶液混合，较佳10分钟内，最佳地5分钟内。
[0025]
较佳地，过滤上述乳液过程中，滤去粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；最佳地，滤去粒径大于25μm及小于10μm的微粒或滤去粒径大于15μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于10μm与25μm间的微粒或保留粒径位于5μm与15μm间的微粒。
[0026]
低温冷冻法包括冷冻干燥法及喷雾冷冻干燥法。
[0027]
本发明工艺中了采用酶法交联胶原蛋白，与化学交联工艺和物理交联工艺相比，有较大优势：反应条件温和、不产生副产物、高特异性以及高催化效率和产率。
[0028]
此外，酶温和的反应条件减少了加工过程中胶原蛋白的损失。
[0029]
实施例下非选择性实施例，即植入剂的制备方法，进一步描述了本发明范围内的优选实施例。在本发明的范围内这些实施例还可有许多变化。
[0030]
实施例1（1）、制备温度4℃的含2%的表面活性剂：span 80的乙酸乙酯的溶液，即得油相；（2）、制备温度4℃的含5%的iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为7u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后20至30分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌30分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持4℃至0℃ 24小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为4.5；（4）、上述胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与25μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
[0031]
同法制作13批次。
[0032]
实施例2
（1）、制备温度0℃的含5%的表面活性剂：油酸葡萄糖酯的乙醚的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含3%的iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为3u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至10分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为3；（4）、上述胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于5μm及小于0.5μm的微粒，保留粒径位于0.5μm与5μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
[0033]
同法制作13批次。
[0034]
实施例3（1）、制备温度0℃的含10%的表面活性剂：c12酸（月桂酸）甘油酯的丙酮的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含8%的iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为10u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后1至5分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌40分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为6；（4）、上述胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
[0035]
同法制作13批次。
[0036]
实施例4（1）、制备温度0℃的含10%的表面活性剂：硬脂（c18）酸丙二醇酯及0.1%的tween 80的异戊酸异戊酯的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含5%的iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为8u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为8；（4）、上述胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于15μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与15μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
[0037]
同法制作13批次。
[0038]
实施例5（1）、制备温度0℃的含10%的表面活性剂：span 20的乙酸丁酯的溶液，即得油相；
（2）、制备温度1℃的含5%的iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为4u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌20分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为9；（4）、上述胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
[0039]
同法制作13批次。
[0040]
实施例6（1）、制备温度0℃的含6%的表面活性剂：软酯酸（c16酸）蔗糖酯及0.1%的tween 80的乙酸甲酯的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含2%的iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为5u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至25分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌50分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为5；（4）、上述胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于5μm的微粒，保留粒径位于5μm与25μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
[0041]
同法制作13批次。
[0042]
实施例7（1）、制备温度0℃的含5%的表面活性剂：油酸葡萄糖酯的乙醚的溶液，即得油相；（2）、制备温度1℃的含3%的iii型胶原蛋白和谷氨酰胺转氨酶的水溶液，上述谷氨酰胺转氨酶的用量与iii型胶原蛋白的用量的比例为3u/g，即得水相；（3）、上述水溶液制备完成后5至10分钟内把上述水溶液与上述油相混合，并强力搅拌60分钟使它们形成油包水型乳液，温度保持0℃至-4℃ 48小时，使胶原蛋白基本交联，上述油相与上述水相的体积比为3；（4）、上述胶原蛋白基本交联后用滤膜滤去上述乳液中粒径大于25μm及小于10μm的微粒，保留粒径位于10μm与25μm间的微粒；（5）、上述保留的微粒用10-30%乙醇水溶液洗涤后在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂，即得。
[0043]
同法制作13批次。
[0044]
对照例1～7-1除不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）及小于0.5μm或5μm或10μm 或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
[0045]
对照例1～7-2除不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
[0046]
对照例1～7-3除不滤去粒径小于0.5μm或5μm或10μm 或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
[0047]
对照例1～7-4除谷氨酰胺转氨酶不（直接）加入水相中，而是加入油相中外，其他均与各自对应的实施例相同。
[0048]
对照例1～7-5除不添加表面活性剂、不滤去粒径大于25μm或5μm或10μm或15μm或20μm（该值与各自对应的实施例相同）及小于0.5μm或5μm或10μm 或15μm（该值与各自对应的实施例相同）的微粒外，其他均与各自对应的实施例相同。
[0049] 测试例1 通针性能测试原理：通针性能越好，相同量的混悬液在同一条件下通过同一针头所需时间越少。
[0050]
方法：取相同重量(4mg)的上述实施例、对照例及市售品iii型胶原蛋白（4mg，薇旖美, 山西锦波, 该胶原蛋白溶液按下法：在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂水）加入用相同量（5ml）的医用注射用生理盐水经相同时间相同方式（如同一振摇方法）复溶（重构）成混悬液，取相同量混悬液装于同一注射器（针头也不变，清洗干净后干燥重复使用）中，用同等的恒定压力推注射器使其中混悬液排完，测定所需时间。最后分别计算上述实施例及对照例测得的时间与市售品测得的时间的比值，以该比值衡量上述实施例及对照例的通针性能，该比值越小，通针性能越强，该比值越大，通针性能越弱。
[0051]
测试结果见表1～7。
[0052]
测试例2体外降解时间测试取相同重量iii型胶原蛋白（4mg）的上述实施例、对照例及市售品iii型胶原蛋白（4mg，薇旖美, 山西锦波，该胶原蛋白溶液按下法：在真空冷冻干燥机中-60
‑‑
80℃冷冻干燥48小时除去其中溶剂水）加入用相同量(5ml，即0.08%)的医用注射用生理盐水（ph值7.0）经相同时间相同方式复溶成混悬液。上述混悬液中均加入相同量的胶原蛋白水解酶（蜡样芽孢杆菌蛋白酶,从蜡样芽孢杆菌纯化分离），上述胶原蛋白水解酶用量与上述胶原蛋白重量比为4u/mg，之后均置入温度37℃、相对湿度70%的恒温恒湿的环境中，于0hr、1 hr、3 hr、5 hr、7 hr、9 hr、11 hr 、13 hr、15 hr、17 hr、
……
取样,直至下述所述的吸光度值a基本稳定（波动范围小于2%），该稳定吸光度值a的平均值表示为a0。
[0053]
取样后，立刻90℃灭酶10min，待降至室温，4000r /min 离心10min，得到澄清的水解液。取5ml上述水解液样品溶液，加入5ml 15% ( w/w) 三氯醋酸( tca) 水溶液，混匀后静置10min，4 000r /min离心10min，上清液稀释至1 ～ 10mg /ml 浓度的溶液，取稀释液1ml 加入4ml 双缩脲试剂，混匀，静置30min。在波长540nm 处测定吸光度值a。按线性回归
方程可计算降解产生的多肽浓度c( mg /ml)（参见文献1：肉类工业. 2011,(11)，总第367期，第21-24页，刘丽莉、杨协力，胶原蛋白酶酶解牛骨胶原蛋白的动力学研究）。
[0054]
上述吸光度值a（或降解产生的多肽浓度c）反映样品溶液中己降解的胶原蛋白的量，上述吸光度值a
0-a（或c
0-c，c0表示吸光度值a基本稳定后的平均值a0求得的降解产生的多肽浓度，即胶原蛋白完全降解产生的多肽浓度,反应初始胶原蛋白的量）反映样品溶液中残留的胶原蛋白的量，由依米氏方程可知蛋白质酶降解在较低浓度时呈一级反应特征（参见上文献1），故可用 ln（a
0-a）（或ln（c
0-c））的值与时间t作图，求其降解斜率k，通过该斜率k及公式t
0.99
=ln100/k计算出胶原蛋白完全降解（降解99%或残留1%, t=ln( c0＇/ c＇)/k, t c＇/ c0＇=0.01，其中c0＇与 c＇分别表示初始胶原蛋白的量及残留胶原蛋白的量）的时间t
0.99
。
[0055]
最后分别计算上述实施例及对照例测得的胶原蛋白完全降解的时间t
0.99
与市售品测得的胶原蛋白完全降解的时间t
0.99
（以其平均值计）的比值，以该比值衡量上述实施例及对照例的相对体内存留性能，该比值越大，体内存留（长效）性能越强，该比值越小，体内存留（长效）性能越弱。该比值波动越小，iii型胶原蛋白在体内存留（长效）性能变化越小；该比值波动越大，iii型胶原蛋白在体内存留（长效）性能变化越大。
[0056]
测试结果见表1～7。
[0057]
表1 实施例1对照例1-1对照例1-2对照例1-3对照例1-4对照例1-5通针性能0.240.420.490.22
‑‑
降解时间比4.3
±
1.04.8
±
3.06.7
±
4.13.6
±
2.21.3
±
0.28.5
±
5.2表2 实施例2对照例2-1对照例2-2对照例2-3对照例2-4对照例2-5通针性能0.130.320.390.16
‑‑
降解时间比2.1
±
0.43.2
±
1.84.5
±
2.11.8
±
0.61.2
±
0.16.9
±
4.4表3 实施例3对照例3-1对照例3-2对照例3-3对照例3-4对照例3-5通针性能0.280.440.520.31
‑‑
降解时间比5.6
±
1.56.8
±
4.18.3
±
6.04.2
±
2.61.5
±
0.410.2
±
7.3表4 实施例4对照例4-1对照例4-2对照例4-3对照例4-4对照例4-5通针性能0.200.370.440.22
‑‑
降解时间比3.2
±
0.85.3
±
3.16.5
±
4.12.6
±
1.31.4
±
0.29.7
±
5.8表5 实施例5对照例5-1对照例5-2对照例5-3对照例5-4对照例5-5通针性能0.300.470.560.28
‑‑
降解时间比5.4
±
1.37.3
±
4.29.2
±
6.34.5
±
2.41.6
±
0.311.8
±
8.7表6 实施例6对照例6-1对照例6-2对照例6-3对照例6-4对照例6-5通针性能0.270.420.560.29
‑‑
降解时间比5.7
±
1.47.6
±
4.29.0
±
5.84.8
±
2.91.5
±
0.311.5
±
7.7表7 实施例7对照例7-1对照例7-2对照例7-3对照例7-4对照例7-5通针性能0.320.570.690.35
‑‑
降解时间比6.8
±
1.79.3
±
6.910.5
±
8.05.4
±
2.81.7
±
0.413.2
±
9.9结果显示：1）、实施例较市售品有更慢的酶水解速率，显著更长的体内存留（长效）性能；2）、实施例较不添加表面活性剂的对照例有更好的体内存留（长效）性能，该对照例体内存留（长效）性能波动性极大；3）、实施例较谷氨酰胺转氨酶不（直接）加入水相中，而是加入油相中的对照例有更好的体内存留（长效）性能，该对照例体内存留（长效）性能极弱；4）、实施例较不滤除较大及较小的颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能波动很大；5）、实施例较不滤除较大颗粒的仅滤除较小颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能波动较大；6）、实施例较不滤除较小颗粒的仅滤除较大颗粒的对照例有更好的体内存留（长效）性能，更长的体内存留（长效）性，更小的波动性，该对照例体内存留（长效）性能较短，变波动性也较大；7）、实施例较市售品、不滤除较大及较小的颗粒的对照例及不滤除较大颗粒的仅滤除较小颗粒的对照例有更好的通针性能；实施例与不滤除较小颗粒的仅滤除较大颗粒的对照例有基本一致的通针性能。