用于治疗视网膜相关疾病的组合物、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别地涉及感光细胞群和小胶质细胞群的组合及其在治疗视网膜相关疾病中的应用。


背景技术：

2.视网膜色素上皮和神经视网膜发生变性是目前引起人类不可治失明的主要原因。由于神经视网膜变性通常不可逆并且难以代偿及再生，同时其分子机制尚未明了，因此目前对视网膜变性疾病的治疗手段十分有限。
3.近年来，rpe细胞替代治疗视网膜变性疾病取得长足进展，国内外团队已开展临床转化研究。但rpe作为一类支持细胞，只能针对早期疾病发挥作用或给予营养支持，而发挥感光功能的感光细胞由于其高度的细胞特化性，移植后受宿主微环境的影响不易存活以及功能整合，导致其在此类疾病的临床转化效果不甚理想。研究发现小胶质细胞作为一组高度特化的免疫细胞，在视网膜免疫监视和维持视网膜微环境的稳态中起着关键的调节作用。
4.目前开展临床转化的主要为rpe细胞的替代治疗，但作为行使视觉功能主要感光细胞的替代治疗仍十分匮乏，如何修复光感受器细胞等功能神经元的损伤成为关键问题。视网膜变性疾病导致视网膜相关细胞损害、微环境重构，严重影响了移植细胞的存活、整合。如何能促进移植的供体感光细胞在宿主视网膜存活，适应微环境与宿主整合，进而发挥结构、功能恢复作用成为亟待解决的重大问题。


技术实现要素：

5.为了弥补以上领域的不足，本发明联合功能良好的小胶质细胞移植以改善视网膜下腔的微环境，促进移植的感光细胞存活和整合。
6.本发明提供的用于治疗视网膜相关疾病的组合物，包含治疗有效量的感光细胞群和小胶质细胞群，所述感光细胞群和所述小胶质细胞群所含有的细胞是分散的细胞。
7.优选地，所述感光细胞群所含有的感光细胞的数量是所述小胶质细胞群所含有的小胶质细胞的数量的3000倍～30倍，优选1000倍～100倍，更优选300倍。
8.优选地，所述感光细胞群包含干细胞诱导分化的感光细胞群；
9.和/或所述小胶质细胞群包含干细胞诱导分化的小胶质细胞群。
10.优选地，所述感光细胞群包含的感光细胞是从干细胞分化45～77天的感光细胞。
11.优选地，所述小胶质细胞群包含的小胶质细胞是从干细胞分化到7～14天的小胶质细胞。
12.优选地，所述干细胞是诱导的多能干细胞(ipsc)或胚胎干细胞(esc)。
13.术语“胚胎干细胞”是在受精后14天内从胚胎中分离或获得的没有经过体内发育的干细胞。
14.优选地，所述组合物是适于注射到受试者眼中的流体形式，例如悬液。
15.优选地，所述组合物还包含选自细胞溶媒(葡萄糖、氯化钠)、用于细胞稳定的成分(95％酒精)、防腐剂(山梨酸)，等渗剂(葡萄糖、氯化钠)，ph调节剂(盐酸、氢氧化钠)，润滑剂(甘油、聚乙二醇)的至少一种添加剂。
16.优选地，所述视网膜相关疾病选自视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、stargardt病。
17.优选地，所述受试者是哺乳动物，优选人、犬科动物和猫科动物。
18.优选地，所述感光细胞群和所述小胶质细胞群存在于单一制剂或分开的制剂中。
19.本发明还提供了一种用于治疗视网膜相关疾病的试剂盒。
20.本发明所提供的用于治疗视网膜相关疾病的试剂盒，在分开的容器中包含治疗有效量的感光细胞群和小胶质细胞群，所述感光细胞群和所述小胶质细胞群所含有的细胞是分散的细胞。
21.优选地，所述感光细胞群和所述小胶质细胞群在使用前被混合到一块以便直接给药至受试者眼中，或者所述感光细胞群和所述小胶质细胞群被分开给药。
22.感光细胞群和小胶质细胞群的组合在制备药物中的用途也属于本发明的保护范围，所述药物用于治疗视网膜相关疾病，其中所述感光细胞群和所述小胶质细胞群所含有的细胞是分散的细胞。
23.优选地，所述视网膜相关疾病选自视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、stargardt病。
24.优选地，所述药物用于注射到视网膜下腔。
25.本发明建立了感光细胞联合视网膜小胶质细胞共同移植治疗视网膜相关疾病的技术体系，通过利用小胶质细胞调节宿主视网膜微环境来促进移植的感光细胞存活和整合，从而显著提高感光细胞移植在视网膜相关疾病中的治疗作用，为目前不可逆性致盲眼病患者的治疗带来希望，降低盲率、惠及民生。
附图说明
26.为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
27.图1为感光细胞和小胶质细胞联合移植治疗视网膜变性小鼠流程图。
28.图2为中浓度比例(3000:10)的小胶质细胞和感光细胞的联合移植对于视网膜功能恢复的代表性结果。
29.图3为高浓度比例(3000:100)的小胶质细胞和感光细胞的联合移植对于视网膜功能恢复的结果。
30.图4为低浓度比例(3000:1)的小胶质细胞和感光细胞的联合移植对于视网膜功能恢复的结果。
具体实施方式
31.小胶质细胞是一组高度特化的免疫细胞，广泛存在于中枢神经系统中，包括视网膜，它在免疫监视和维持视网膜微环境的稳态中起着关键的调节作用。本发明提供了一种基于感光细胞和小胶质细胞联合移植治疗视网膜相关疾病的新策略，在小胶质细胞的协同
作用下显著提高了移植治疗后的视网膜功能。
32.一、感光细胞群
33.对于能够用于本发明的感光细胞群没有特殊限制。从干细胞分化感光细胞有若干种方法，如下列文献中记载的方法：zhong,xiufeng et al.“generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human ipscs.”nature communications vol.54047.10 jun.2014,doi:10.1038/ncomms5047；
34.kuwahara,atsushi et al.“generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.”nature communications vol.6 6286.19 feb.2015,doi:10.1038/ncomms7286；
35.pan d,xia xx,zhou h,jin sq,lu yy,liu h,gao ml,jin zb.coco enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.stem cell res ther.2020 aug 24；11(1):366.doi:10.1186/s13287-020-01883-5.pmid:32831148；pmcid:pmc7444242.
36.zhang x,jin zb.directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells.j vis exp.2021 apr 21；(170).doi:10.3791/62298.pmid:33970142.
37.在一些实施方式中，利用crispr-cas9基因编辑工具构建荧光标记感光细胞特异性基因crx的多能干细胞(crx-tdtomato-pscs)，对crx-tdtomato-pscs进行3d诱导分化成视网膜类器官，然后通过流式分选纯化出荧光标记的感光细胞用于移植。
38.在一些实施方式中，crx特异性荧光标记可替换为其他标记，例如：m/lopsin、rhodopsin、rx。
39.在一些实施方式中，感光细胞群包含的感光细胞是从干细胞分化约45～77天的感光细胞，例如从干细胞分化约45～48天、48天～50天的感光细胞。
40.在一些实施方式中，干细胞是诱导的多能干细胞(ipsc)或胚胎干细胞。
41.二、小胶质细胞群
42.对于能够用于本发明的小胶质细胞没有特殊限制。从干细胞分化小胶质细胞有若干种方法，如下列文献中记载的方法：gao,mei-ling et al.“functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ.”science china.life sciences vol.65,6(2022):1057-1071.doi:10.1007/s11427-021-2086-0。
43.在一些实施方式中，利用crispr-cas9基因编辑工具构建荧光标记小胶质细胞特异性基因cx3cr1的多能干细胞(cx3cr1-gfp-pscs)，利用优化的小胶质细胞诱导分化技术，将cx3cr1-gfp-pscs诱导分化成可靠的荧光标记的小胶细胞。
44.在一些实施方式中，小胶质细胞群包含的小胶质细胞是从干细胞分化到7约～14天的小胶质细胞，例如从干细胞分化到约7～10天、10天～12天、12天～14天的小胶质细胞。
45.在一些实施方式中，干细胞是诱导的多能干细胞(ipsc)或胚胎干细胞(esc)。
46.三、联合移植
47.发明人发现，与单纯感光细胞移植治疗视网膜变性策略相比，将一定阶段、恰当比例的感光细胞群和小胶质细胞群联合移植进入视网膜变性小鼠的视网膜下腔，能更加有效地提高感光细胞的存活和整合，从而显著提高联合移植对于视网膜变性小鼠视网膜功能的
恢复作用，用于治疗视网膜相关疾病。
48.在一些实施方式中，感光细胞群包含的感光细胞是从干细胞分化约45～77天的感光细胞。
49.在一些实施方式中，小胶质细胞群包含的小胶质细胞是从干细胞分化到约7～14天的小胶质细胞。
50.在一些实施方式中，感光细胞群所含有的感光细胞的数量和所述小胶质细胞群所含有的小胶质细胞的数量的比例为3000:1～3000:100，优选1000倍～100倍，更优选300倍。
51.在一些实施方式中，感光细胞群和小胶质细胞群所含有的细胞是分散的细胞。
52.在一些实施方式中，感光细胞群和小胶质细胞群以组合物的形式进行联合移植，组合物是适于注射到受试者眼中的流体形式，例如悬液。
53.在一些实施方式中，组合物还包含选自细胞溶媒、用于细胞稳定的成分、防腐剂，等渗剂，ph调节剂，润滑剂的至少一种添加剂。
54.在一些实施方式中，视网膜相关疾病选自视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、stargardt病。
55.四、用于治疗视网膜相关疾病的试剂盒
56.本发明还提供了用于治疗视网膜相关疾病的试剂盒，试剂盒在分开的容器中包含治疗有效量的感光细胞群和小胶质细胞群，感光细胞群和小胶质细胞群所含有的细胞是分散的细胞。
57.术语“分散的细胞”是指将感光细胞群的感光细胞或小胶质细胞群中的小胶质细胞分散在例如流体中，而不是聚在一起。细胞聚堆生长，会造成内部细胞无法接触流体而造成死亡。同时，分散的细胞有别于体外生长的类器官或组织。
58.在一些实施方式中，感光细胞群和小胶质细胞群在使用前被混合到一块以便直接给药至受试者眼中，或者所述感光细胞群和所述小胶质细胞群被分开给药。
59.在一些实施方式中，所述药物用于注射到视网膜下腔。
60.当在本发明中使用时，“分化”或“分化培养”一定天数的感光细胞或小胶质细胞指的是从多能干细胞开始分化的天数。
61.术语“约”在本发明中结合天数使用时，指的是
±
3天、优选
±
2天、更优选
±
1天。
62.实施例
63.实施例1、感光细胞群的制备
64.构建特异性荧光标记感光细胞特异性基因crx的诱导多能干细胞，在批量分化后进行纯化分选，以期富集到高纯度的感光细胞。
65.具体方法如下：
66.1)crx特异性荧光标记的视网膜变性患者及其健康人hesc或hipsc建立：
67.ipsc来源于血液白细胞诱导分化而来，采用常规方法制备；esc来源于h9细胞系，购自赛默飞。在ipsc和esc细胞系的基础上，运用crispr/cas9技术，在crx启动子后插入荧光蛋白标签的cdna片断，构建crx荧光标记的疾病和健康人ipsc，并通过抗生素筛选后获得片段插入阳性的干细胞克隆；
68.2)体外诱导ips分化为三维视网膜类器官：
69.利用体外三维视网膜诱导分化的方式，阶段性应用wnt通路抑制剂、sag、视磺酸、
牛磺酸等，先使ips于96孔v形低黏附板中形成拟胚体，后逐步诱导其分化形成具有分层结构的视网膜类器官；
70.3)利用流式细胞技术(facs/macs)结合荧光表达对光感受器前驱细胞进行分选，以获得纯化的光感受器细胞用于视网膜下腔联合移植。
71.图1中1示出了特异性荧光标记感光细胞的多能干细胞构建。供体细胞荧光标记过程为利用crispr-cas9基因编辑工具构建荧光标记感光细胞特异性基因crx多能干细胞(crx-tdtomato-pscs)；图1中2示出了多能干细胞诱导分化和分选感光细胞的过程。供体细胞诱导分化过程为对crx-tdtomato-pscs进行3d诱导分化成视网膜类器官，然后通过流式分选纯化出荧光标记的感光细胞用于移植。
72.实施例2、小胶质细胞群的制备
73.使用的基因编辑技术敲入cx3cr1特异性标记的诱导多能干细胞，并通过cx3cr1标记的多能干细胞分化和纯化获得视网膜小胶质细胞。
74.具体方法如下：
75.1)cx3cr1特异性荧光标记的视网膜变性患者及其健康人ips建立：在ipsc细胞系的基础上，运用crispr/cas9技术，在cx3cr1启动子后插入荧光蛋白标签的cdna片断，构建cx3cr1荧光标记的疾病和健康人ipsc，并通过抗生素筛选后获得片段插入阳性的干细胞克隆；
76.2)体外诱导ips分化为拟胚体，后逐步通过添加m-csf、il3、il34等因子，诱导分化成小胶质细胞；
77.3)利用流式细胞技术(facs/macs)结合荧光表达对小胶质细胞进行分选，以获得纯化的小胶质细胞(microglia-gfp)用于视网膜下腔联合移植。
78.图1中1示出了特异性荧光标记小胶质细胞特异性基因的多能干细胞构建。供体细胞荧光标记过程为利用crispr-cas9基因编辑工具构建荧光标记小胶质细胞特异性基因cx3cr1的多能干细胞(cx3cr1-gfp-pscs)；图1中2示出了多能干细胞诱导分化和分选小胶质细胞的过程。利用我们优化的小胶质细胞诱导分化技术，将cx3cr1-gfp-pscs诱导分化成可靠的荧光标记的小胶细胞。在以往研究的基础上极大改善了多能干细胞分化小胶质细胞的方法，可操作性强，分化效率高，能够在更短时间获得可靠充足的小胶质细胞。
79.实施例3、感光细胞群和小胶质细胞群的组合和应用
80.将一定阶段、恰当比例的感光细胞群和小胶质细胞群联合移植进入不同背景的视网膜变性小鼠的视网膜下腔。本发明用的是rd1和rd10。
81.人和小鼠的视网膜感光细胞与小胶质细胞的比例大约为3000:1，其中小鼠感光细胞大约为6.6*106个，感光细胞的移植量一般按照105量级配，考虑到按照此时小胶质细胞数量太少，因此我们在保证感光细胞数量一致的前提下，按照高中低三种比例(3000:100,3000:10,3000:1)去加入小胶质细胞，进行联合移植；
82.将不同比例的感光细胞群和小胶质细胞群单独或联合移植不同背景的视网膜变性小鼠的视网膜下腔。对移植后的视网膜变性小鼠进行功能和结构的评估发现，中浓度比例(3000:10)的小胶质细胞群和感光细胞群的联合移植对于视网膜变性小鼠视功能的挽救是最大的。
83.实施例4、联合移植感光细胞群和小胶质细胞群
84.图1中3示出了视网膜下腔联合移植感光细胞和小胶质细胞的过程。右侧图示视网膜变性小鼠的视网膜下腔的位置所在(rpe和神经上皮之间)，左侧为注射部位视网膜下腔放大图视网膜下腔移植过程为将一定阶段(分化45-77天的感光细胞和分化7-10天的小胶质细胞)、恰当比例(3000:10)的感光细胞和小胶质细胞(3-5*105/1ul/眼)联合移植进入视网膜变性小鼠rd10小鼠(出生后p15)的视网膜下腔(图2)。为更加真实反应移植后的效果，移植对照组设置为两组，一组是注射细胞稀释液的dpbs组，另一组是单独注射感光细胞组(图2)，移植量保持一致。以视网膜局部发生脱离、其余部位结构保存良好为注射成功的标志。
85.在注射后的不同时间点观察移植后小鼠视网膜功能和结构变化，以及移植后供体细胞存活、物质交换、整合或融合等情况。
86.图1中4示出了移植后的宿主视网膜功能和结构的评估。评估时间为移植后的30天。移植后效果评估过程为：首先是利用视网膜sd-oct、hrt、眼底照相(fp)、荧光血管造影(ffa)、全视网膜铺片等技术对移植后视网膜的整体结构分析；然后利用全视野erg、多焦erg、膜片钳或微电极阵列(mea)技术对移植后视网膜功能检查；同时，进一步用瞳孔对光反射(plr)、避光反射、视动反射okr等行为学检测对视觉通路的恢复进行评估；最后利用免疫染色技术、透射电镜技术等技术对移植后供体细胞状态和整合情况进行分析(参考以下文献中的方法：(1)jin z-b,gao m-l,deng w-l,et al.stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.progress in retinal and eye research 2019；69:38-56.(2)zhang c-j,ma y,jin z-b.the road to restore vision with photoreceptor regeneration.experimental eye research 2021；202:108283.)。
87.图2为中浓度比例(3000:10)的小胶质细胞和感光细胞的联合移植对于视网膜功能恢复的代表性结果。视网膜功能检测的金标准是视网膜电图(erg)。图中是利用erg检测移植后30天的宿主视网膜变性小鼠rd10的功能，与单独移植感光细胞组(sigle transplantation组)和假手术组(dpbs组)相比，无论是代表视杆细胞传递功能的暗适应erg的b波振幅(图2中a)，还是代表视锥细胞传递功能的明适应erg的b波振幅(图2中b)，联合移植组(combined transplantation)的小鼠视网膜erg均有所提高，表明其功能具有显著的恢复。细胞移植前后的视网膜微环境得以改善，联合移植策略显著恢复了视网膜变性小鼠的视网膜功能和结构。
88.图3为高浓度比例(3000:100)的小胶质细胞和感光细胞的联合移植对于视网膜功能恢复的结果。视网膜功能检测的金标准是视网膜电图(erg)。图中是利用erg检测移植后30天的宿主视网膜变性小鼠rd10的功能，与单独移植感光细胞组(sigle transplantation组)和假手术组(dpbs组)相比，联合移植组(combined transplantation)的小鼠视网膜erg未有明显恢复。
89.图4为低浓度比例(3000:1)的小胶质细胞和感光细胞的联合移植对于视网膜功能恢复的结果。视网膜功能检测的金标准是视网膜电图(erg)。图中是利用erg检测移植后30天的宿主视网膜变性小鼠rd10的功能，与单独移植感光细胞组(sigle transplantation组)和假手术组(dpbs组)相比，联合移植组(combined transplantation)的小鼠视网膜erg未有明显恢复。
90.比较例、单独移植感光细胞群
91.如图2中蓝色线所示为单独移植感光细胞群，结果显示：与单纯感光细胞移植治疗视网膜变性策略相比，本发明的感光细胞联合视网膜小胶质细胞共同移植治疗视网膜变性的技术体系，能够更加有效地提高感光细胞的存活和整合，从而显著提高联合移植对于视网膜变性小鼠视网膜功能的恢复作用。本发明创新性的提出以行使调控微环境作用的小胶质细胞联合移植，在改善微环境的基础上促进移植的光感受器细胞存活、整合及功能发挥，为此类中枢神经元变性疾病的细胞治疗应用提供方向。
92.上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。