水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的应用

水溶性阴离子-π
型芳基偶氮化合物的应用
技术领域
1.本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，特别涉及水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的应用。


背景技术：

2.癌症是威胁人类健康的常见疾病之一，对全球公共卫生构成严重威胁。手术治疗、放射治疗以及化学治疗作为传统的肿瘤治疗手段存在风险大、易感染、毒副作用大、创伤大等缺陷。光动力疗法(pdt)因其无创性、时空可控性、可忽略的耐药性、低全身毒性和免疫刺激活性等独特优点，成为癌症治疗的一种开创性临床方法。多重耐药(mdr)细菌感染也是十分紧迫的全球公共卫生问题。开发针对mdr细菌感染的替代治疗方法和治疗药物仍然面临诸多挑战。光动力疗法因具有抗菌谱广、不易产生耐药性、安全高效等优点，也被认为是治疗细菌感染的有效策略。此外，肿瘤合并致病菌感染是导致癌症治疗效果不佳的原因之一。
3.pdt利用光激活光敏剂(pss)通过i型(电子转移)或ii型(能量转移)光化学机制产生高毒性活性氧(ros)，从而诱导细菌或肿瘤细胞死亡。i型反应的途径通常是通过电子从激发三重态转移到生物底物分子来生成活性自由基。ii型反应途径是激发三重态光敏剂与氧气发生能量转移从而形成单线态氧。因此，ii型反应途径对于氧气存在高度依赖性。迄今为止，大多数与临床应用相关的pdt-pss是通过ii型反应途径产生ros。不幸的是，肿瘤细胞异常增殖和凋亡以及肿瘤血管畸形导致的肿瘤缺氧被认为是许多肿瘤治疗方案治疗效果有限和预后不良的主要因素之一。此外，光动力治疗消耗氧气加重了肿瘤缺氧，进一步降低了其治疗效果，这已成为乏氧肿瘤对pdt产生耐药性的一个重要限制。
4.近年来，一些i型聚集诱导光(aie)特性的光敏剂已经开发出来，并在生物医学领域显示出独特的实际应用优势。aie光敏剂即使在生理介质中发生聚集，仍可以产生强的荧光和高的ros效率，参见photosensitizers with aggregation-induced emission:materials and biomedical applications,advanced materials,2018-07-31,doi:10.1002/adma.201801350。然而，aie-pss的疏水性限制了分子在水环境体系中的应用，因此很难直接应用于生物体系中。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明目的在于提供水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的应用，本发明提供的具有式a所示结构的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物具有良好的水溶性以及细菌、肿瘤细胞的成像、杀伤作用。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
7.本发明提供了水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在制备抗菌药物或抗肿瘤药物中的应用；
8.所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物具有式a所示结构：
[0009][0010]
优选的，所述药物为光动力疗法光敏剂。
[0011]
优选的，所述抗菌药物为抗革兰氏阳性菌药物。
[0012]
本发明提供了水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在非诊断目的细胞成像中的应用；所述细胞为细菌细胞或肿瘤细胞；
[0013]
所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物具有式a所示结构：
[0014][0015]
优选的，所述细菌为革兰氏阳性菌。
[0016]
本发明提供了水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在制备抗菌药物或抗肿瘤药物中的应用；所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物具有式a所示结构：
[0017][0018]
优选的，所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的工作浓度为1～5μm。
[0019]
本发明提供了水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在制备细菌或肿瘤诊断试剂中的应用；
[0020]
所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物具有式a所示结构：
[0021][0022]
在本发明中，此水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物分子间内存在阴离子-π相互作用，这些相互作用不仅可以防止分子间发生π-π堆积，还可以限制苯环的转动。本发明以br-作为阴离子，其阴离子-π相互作用赋予化合物固有电荷，不仅能改善化合物的水溶性，无需有机溶剂助溶即可直接溶于水中，可避免水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在生理环境中聚集而对生物体产生潜在的毒性；还能够通过静电相互作用增加化合物与细菌、肿瘤细胞结合作用，这为后续的高效杀伤奠定了基础。此外，阴离子-π型芳基偶氮化合物还可利用癌细胞比正常细胞膜电位高的差异识别癌细胞，从而提高肿瘤的选择性。
[0023]
在本发明中，由于水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物分子的固有电荷，增加了芳基偶氮化合物与亚细胞器的靶向能力。本发明通过调控水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的浓度可实现从溶酶体到线粒体的靶向成像；具体的，当浓度为1μm时主要定位溶酶体；当浓度为5μm时，可以同时定位线粒体和溶酶体。
[0024]
本发明提供的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物有较大的斯托克斯位移、优异的抗光漂白性能以及近红外发光能力，适用于革兰氏阳性菌及相关耐药菌、肿瘤细胞的近红外荧光成像；此外，本发明提供的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物还具有超强的i型ros产生能力，可对革兰氏阳性菌及相关耐药菌、肿瘤细胞实现高效的杀伤，构建兼具诊断与治疗功能于一身的诊疗试剂；其对正常细胞不管是光照还是黑暗条件下均无损伤，具有良好的安全性。
附图说明
[0025]
图1为dpbc-br在不同甲苯体积分数的dmso/甲苯体系中的荧光谱图；
[0026]
图2为dpbc-br在dmso/甲苯混合溶液中在720nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值随甲苯体积分数变化的曲线图；
[0027]
图3为dpbc-br在正辛醇/水体系中的平衡分布以及脂水分配系数；
[0028]
图4为dmpo与dpbc-br以及tmpo与dpbc-br在黑暗以及光照条件下，超氧阴离子、羟基自由基以及单线态氧的电子自旋共振信号；
[0029]
图5为在hela细胞中，激光连续扫描dpbc-br与线粒体商业染料不同时间，细胞中实时荧光强度与初始荧光强度的比值；
[0030]
图6为dpbc-br对金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的近红外成像；
[0031]
图7为不同浓度的dpbc-br在hela细胞中的共定位成像；
[0032]
图8为dpbc-br对正常细胞lo2、293a及癌细胞4t1、mcf-7及hela细胞的荧光成像情况；
[0033]
图9为在常氧条件以及乏氧条件下，dpbc-br在hela细胞中的超氧阴离子、羟基自由基以及单线态氧产生情况的倒置荧光显微镜成像图；
[0034]
图10为不同浓度的dpbc-br对金黄色葡萄球菌的光动力杀伤情况；
[0035]
图11为不同浓度的dpbc-br对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的光动力杀伤情况；
[0036]
图12为不同浓度的dpbc-br在常氧、乏氧条件下对hela细胞的光动力杀伤情况；
[0037]
图13为不同浓度的dpbc-br对正常细胞lo2、293a的暗毒性和光毒性。
具体实施方式
[0038]
本发明提供了水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在制备抗菌药物或抗肿瘤药物中的应用；
[0039]
所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物具有式a所示结构：
[0040][0041]
在本发明中，所述药物优选为光动力疗法光敏剂，具体优选为i型反应光动力疗法光敏剂。
[0042]
在本发明中，所述抗菌药物优选为抗革兰氏阳性菌药物。在本发明中，所述革兰氏阳性菌优选为金黄葡萄球菌及其耐药菌。
[0043]
在本发明中，由于癌细胞和正常细胞存在膜电位差，本发明提供的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物对于肿瘤细胞的荧光成像和杀伤具有普适性。作为本发明的具体实施例，所述抗肿瘤药物优选为抗宫颈癌药物或抗乳腺癌药物。
[0044]
本发明提供的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物有较大的斯托克斯位移、优异的抗光漂白性能以及近红外发光能力，适用于革兰氏阳性菌及相关耐药菌、肿瘤细胞的近红外荧光成像；此外，本发明提供的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物还具有超强的i型ros产生能力，可对革兰氏阳性菌及相关耐药菌、肿瘤细胞实现高效的杀伤，构建兼具诊断与治疗功能于一身的诊疗试剂。
[0045]
在本发明中，所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的制备方法，优选包括以下步骤：
[0046]
在催化剂的作用下，在冰醋酸和三氟乙醇体系中，具有式1所示结构的化合物和偶氮苯进行成环反应，得到具有式2所示结构的中间体dpbc-ots；
[0047][0048]
具有式2所示结构的中间体与溴化钠进行置换反应，得到具有式a所示结构的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物。
[0049]
在本发明中，所述催化剂为(cp
*
ircl2)2、agsbf6和ag2co3；在本发明中，所述(cp
*
ircl2)2、agsbf6和ag2co3的摩尔比优选为0.025:0.1:2。
[0050]
在本发明中，所述具有式1所示结构的化合物和偶氮苯的摩尔比优选为5:2。在本发明中，所述偶氮苯与agsbf6的摩尔比优选为1:0.1。
[0051]
在本发明中，所述偶氮苯与冰醋酸的摩尔比优选为1:2.5。
[0052]
在本发明中，所述成环反应优选在氮气氛围下进行；所述成环反应的温度优选为80℃，时间优选为24h。
[0053]
在本发明中，所述成环反应后，本发明优选对所得成环反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0054]
对所述成环反应液依次进行过滤、洗涤，所得洗脱液依次进行浓缩和柱层析分离。
[0055]
在本发明中，所述过滤优选为硅藻土过滤；所述洗涤优选为ch2cl2洗涤。在本发明中，所述浓缩优选为真空浓缩；所述柱层析分离优选为硅胶柱层析分离。
[0056]
在本发明中，所述置换反应中，溴化钠的用量为过量。在本发明中，所述置换反应优选在甲醇中进行，所述置换反应的温度优选为室温。
[0057]
在本发明中，所述置换反应后，本发明优选对所得置换反应液依次进行萃取和浓缩。在本发明中，所述萃取使用的萃取剂优选为二氯甲烷和蒸馏水。本发明对所述浓缩的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的浓缩方式即可。
[0058]
本发明对所述制备抗菌药物或抗肿瘤药物的剂型没有特殊的要求，本技术水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物可制备成针剂、片剂、胶囊剂、注射剂。
[0059]
在本发明中，所述抗菌药物或抗肿瘤药物包括活性成分水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物，还优选包括辅料。本发明对所述辅料没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的辅料即可。
[0060]
本发明提供了上述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在非诊断目的细胞成像中的应用；所述细胞为细菌细胞或肿瘤细胞。
[0061]
在本发明中，所述细菌优选为革兰氏阳性菌；在本发明中，所述革兰氏阳性菌优选为金黄葡萄球菌及其耐药菌。
[0062]
在本发明中，所述肿瘤细胞优选为宫颈癌细胞和乳腺癌细胞。
[0063]
在本发明中，所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的工作浓度优选为1～5μm。在本发明中，由于水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物分子的固有电荷，增加了芳基偶氮化合物与亚细胞器的靶向能力。本发明通过调控水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的浓度可实现从溶酶体到线粒体的靶向成像；具体的，当浓度为1μm时主要定位溶酶体；当浓度为5μm
时，可以同时定位线粒体和溶酶体。
[0064]
本发明提供了上述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物在制备细菌或肿瘤诊断试剂中的应用。
[0065]
下面结合实施例对本发明提供的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0066]
实施例1
[0067]
水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物(简称dpbc-br)的制备：
[0068][0069]
在100ml圆底烧瓶中分别加入偶氮苯(182.2mg，1mmol)，化合物a(1310.1mg，2.5mmol)，(cp
*
ircl2)2(19.9mg，0.025mmol)，agsbf6(34.4mg，0.1mmol)，ag2co3(551.5mg，2mmol)，冰醋酸(142.7μl，2.5mmol)和三氟乙醇(8ml)。在n2保护下，将圆底烧瓶放置在80℃下搅拌24h。反应完毕用硅藻土过滤溶液，用80～100ml ch2cl2洗涤。滤液在真空下浓缩，经硅胶柱层析纯化，得到目标产物dpbc-ots，收率50％。将化合物溶解在甲醇中，加入过量溴化钠，然后用二氯甲烷和蒸馏水萃取，最后分离浓缩有机相得到dpbc-br。
[0070]1h nmr(500mhz,meod):δ＝9.32(d,j＝9.4hz,1h),9.15-9.06(m,1h),8.54(dd,j＝8.5,7.4hz 1h),8.27(dd,j＝7.3,0.9hz 1h),8.07(dd,j＝9.4,2.4hz,1h),7.98-7.88(m,2h),7.88-7.79(m,3h),7.79-7.71(m,2h),7.36(d,j＝2.4hz,1h),7.14-7.01(m,2h),3.97(s,3h),3.87(s,3h)；
13
c nmr(126mhz,meod):δ＝163.65,160.91,144.63,143.16,141.51,140.52,139.83,132.34,131.92,131.81,130.11,128.15,127.91,127.05,126.16,125.88,125.00,120.42,113.65,99.53,55.76,54.49；精确分子量计算值为393.1598，高分辨质谱测得分子量为：393.1599。
[0071]
性能测试
[0072]
(1)dpbc-br的聚集诱导发光性质(aie)测定
[0073]
在不同甲苯体积分数(0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、99％)的二甲基亚砜/甲苯混合溶液中分别加入dpbc-br的二甲基亚砜溶液(1mm)，得到浓度为10μm的dpbc-br溶液，分别测定不同甲苯体积分数的混合溶液中dpbc-br的荧光强度，所得结果如图1所示。
[0074]
分析不同甲苯体积分数的二甲基亚砜/甲苯混合溶液中的荧光光谱在720nm处的实时荧光强度与初始荧光强度的比值随甲苯体积分数的变化，所得结果如图2所示。由图1、2可以看出，随着甲苯体积分数的增大，dpbc-br的荧光强度逐渐增强，说明dpbc-br具有aie特性。
[0075]
(2)脂水分配系数测试
[0076]
将dpbc-br溶解在等体积的正辛醇和水混合溶剂中，超声30min，使两相达到平衡分布。离心后，通过测试吸收光谱或荧光光谱计算两相化合物的平衡浓度。脂水分配系数用log p表示，p＝co/cw。所得结果如图3所示。
[0077]
由图3可以看出，dpbc-br脂水分配系数值为-0.47，表明dpbc-br具有优异的水溶性。
[0078]
(3)电子自旋共振(esr)测试
[0079]
以二甲基吡啶n-氧化物(dmpo)为羟基自由基和超氧阴离子自由基捕获剂，以2,2,6,6-四甲基-4-哌啶酮(tmpo)作为1o2捕获剂，进行电子自旋共振(esr)测试。将20μl的dpbc-br与200μl的dmpo或者tmpo(100mm)混合在水中制备样品。通过毛细管在30mw/cm2白光下加入样品3min，记录esr信号。
[0080]
电子自旋共振(esr)测试结果如图4所示。由图4可以看出，在黑暗条件下，dmpo和tmpo都没有信号，而在光照条件下，tmpo没有明显变化，而dmpo产生了明显的esr信号，说明在光照条件下dpbc-br能产生i型ros。
[0081]
(4)光稳定性测试
[0082]
使用蔡司激光扫描共聚焦显微镜对细胞进行成像，并使用zen 2009软件(carl zeiss)进行分析。dpbc-br激发波长为543nm，线粒体商业染料mito-tracker green激发波长为488nm。用激光连续扫描细胞，收集dpbc-br与mito-tracker green的信号强度。将mito-tracker green和dpbc-br的第一次扫描强度设置为100％，然后根据扫描时间绘制它们的像素平均强度值。得到的曲线表示光漂白率。
[0083]
dpbc-br在hela细胞中的稳定性成像如图5所示。由图5可以看出，激光扫描22min，dpbc-br仍有80％以上的信号，而线粒体商业染料mito-tracker green用激光扫描2.5min，只剩下25％左右的信号，说明dpbc-br具有较强的抗光漂白能力。
[0084]
(5)dpbc-br的细菌成像
[0085]
取1ml培养得到的金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(2
×
109cfu/ml)，用pbs溶液清洗2遍(每次1ml)。用pbs稀释至2
×
108cfu/ml，加入20μl dpbc溶液(1mm)，在37℃、220r/min的摇床中孵化2h。取2μl菌液制片并用倒置荧光显微镜成像。
[0086]
dpbc-br对金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的成像图如图6所示。由图6可以看出，金黄色葡萄球菌以及耐药金黄色葡萄球菌表现出明显的红色荧光信号，且图像背景对比度良好。因此dpbc-br可与细菌结合，用于细菌的近红外成像。由于dpbc-br具优异的水溶性以及细菌结合能力，在细菌成像以及抗菌方面有巨大的应用潜力。
[0087]
(6)dpbc-br的细胞共定位成像
[0088]
将hela细胞铺在共聚焦皿中放置在二氧化碳培养箱(37℃，5％co2)中培养过夜。在hela细胞中加入不同的商业染料：lyso-tracker blue(1μm)或mito-tracker green(500nm)，孵化30min，pbs冲洗三次后加入不同浓度的dpbc-br(1μm、5μm)孵化30min，使用
clsm对细胞进行成像。dpbc-br的激发波长为543nm，发射接收波长》570nm；mito-tracker green的激发波长为488nm，发射接收波长为》525nm；lyso-trackerblue的激发波长为405nm，发射接收波长为495～550nm。
[0089]
dpbc-br在hela细胞中的共定位成像如图7所示。结果表明，在低浓度(1μm)下，dpbc-br主要定位于溶酶体，而随着浓度的增加，dpbc-br主要定位溶酶体和线粒体。说明通过调控dpbc-br的浓度能够实现从溶酶体到线粒体的双靶向成像。
[0090]
(7)dpbc-br对正常细胞和癌细胞的成像能力
[0091]
将癌细胞(hela、4t1和mcf-7)和正常细胞(lo2和293a)在35mm带盖的培养皿中共培养。然后用dpbc-br(1μm)处理细胞30min，用倒置荧光显微镜进行成像。
[0092]
dpbc-br对正常细胞lo2、293a及癌细胞4t1、mcf-7及hela细胞的荧光成像情况如图8所示。从图8中可以看出癌细胞呈强烈的红色荧光，与此形成鲜明对比的是，lo2细胞和293a细胞几乎没有荧光。说明dpbc-br可以区分正常细胞与癌细胞。
[0093]
(8)细胞内ros成像
[0094]
在hela细胞中加入5μm dpbc-br，孵化30min，再加入10μm单线态氧探针(sosg)或10μm羟基自由基探针(apf)孵化30min，分别用于单线态氧成像、羟基自由基成像。用pbs缓冲液冲洗三遍后，将细胞暴露在白光(10mw/cm2)下光照1min、3min、5min。然后在倒置荧光显微镜下用426-466nm波长激发，采集500～550nm的发光。超氧阴离子成像：在hela细胞中加入5μm dpbc-br，孵育30min，然后与10μm的超氧阴离子探针(dhe)孵育30min。pbs缓冲液洗涤三次后，细胞暴露在白光(10mw/cm2)下光照1min、3min、5min，然后在倒置荧光显微镜下用511-551nm波长激发，采集573～613nm的发光。
[0095]
为了模拟肿瘤的缺氧环境，用去铁胺(dfo)药物刺激细胞构建缺氧模型。dfo可以抑制脯氨酸羟化酶的活性，从而稳定hif-1α的蛋白水解，进而降低氧气运输的潜力。缺氧模型建立：用含20μldfo的1ml新鲜培养基代替原培养基(工作浓度为100μm)。再将细胞置于37℃，5％co2培养箱中孵育8h，然后用pbs洗涤3次。使用ros-id
tm
缺氧/氧化应激试剂盒评价细胞的缺氧情况，根据细胞荧光来判断缺氧状态。当活细胞在含氧量正常的环境中是没有荧光的，当含氧量降低时会产生红色荧光。最后，在缺氧细胞的ros成像中，将5μm的dpbc-br和ros检测探针加在用dfo处理过的细胞中，其他操作与常氧条件相同。
[0096]
在常氧条件以及乏氧条件下，dpbc-br在hela细胞中的超氧阴离子、羟基自由基以及单线态氧产生情况的倒置荧光显微镜成像图如图9所示。ros-id
tm
探针出现强荧光信号表明乏氧模型的成功建立。成像结果表明，dpbc-br在常氧、乏氧条件下都能在肿瘤细胞中产生大量的超氧阴离子和羟基自由基，而单线态氧探针不论是在常氧条件还是乏氧条件下都没有信号产生，说明dpbc-br是典型的i型光敏剂，即使在缺氧条件下也能产生大量活性氧。
[0097]
(9)dpbc-br对金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的光动力杀伤测试
[0098]
将金黄色葡萄球菌或耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株复苏接种于lb液体培养基中，在37℃、220r/min的摇床中培养16h。此时得到的细菌悬浮液中细菌浓度约为2
×
109cfu/ml。取1ml培养得到的细菌，移除培养基，用pbs溶液(5mm，ph值为7.4)稀释至2
×
107cfu/ml。加入不同体积的dpbc-br溶液(1mm)使dpbc-br终浓度依次为0μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm。菌液在37℃、220r/min的摇床中孵化30min后，用太阳能模拟器对菌液光照30min(光功率密度100mw/cm2)。光照结束后，将菌液浓度梯度稀释1
×
105倍并涂布在lb琼脂固体
培养基上。在37℃培养箱中培养16h后进行菌落计数并计算存活率。
[0099]
图10和图11分别为不同浓度的dpbc-br对金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的光动力杀伤测试。结果表明，随着dpbc-br浓度的增大，光毒性组的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的存活率都迅速下降，在5μm时存活率已不足1％，暗毒性组的金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的存活率无明显变化，说明dpbc-br对金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌有较强光动力杀伤作用。
[0100]
(10)细胞毒性测试
[0101]
取对数生长期的细胞，以5
×
103细胞/孔的密度接种于96孔板，放置在二氧化碳培养箱中(37℃，5％co2)培养24h。随后，用含有不同浓度dpbc-br的新鲜培养基替换培养基。进一步孵育20h后，将细胞置于白光(30mw/cm2)下光照30min或在黑暗条件下放置30min，进一步孵育4h。取出96孔板，在孔中加入10μl cck-8孵化1h。每一组试验留一个孔不加cck-8作为空白对照。最后用酶标仪在450nm波长下测定产物的吸光度。结果表示为处理后的细胞相对于未处理的对照组细胞的活细胞百分比。相对细胞活力按以下公式计算：
[0102]
细胞活力(％)＝(od
sample-od
background
)/(od
control-od
background
)
×
100％。
[0103]
缺氧条件下的细胞毒性测试：用含有2μl dfo(工作浓度为100μm)的100μl新鲜培养基和不同浓度的dpbc-br代替各孔的原培养基。再孵育20h后，将细胞置于白光(30mw/cm2)下光照30min或在黑暗条件下放置30min，再放进二氧化碳培养箱中孵育4h。取出96孔板，在孔中加入10μl cck-8孵化1h，每一组试验留一个孔不加cck-8作为空白对照。
[0104]
图12为不同浓度的dpbc-br在常氧或者乏氧条件下对hela细胞的毒性测试，结果表明，在常氧或者乏氧条件下，dpbc-br对光照组hela细胞都有较好的光动力杀伤效果。
[0105]
(11)dpbc-br对正常细胞的毒性测试
[0106]
具体方法与上述(10)细胞毒性测试相同。
[0107]
不同浓度的dpbc-br对正常细胞lo2、293a的暗毒性和光毒性如图13所示。由图13可以看出，不管是在光照条件下还是在黑暗条件下，dpbc-br对细胞的存活率都影响不大，证明dpbc-br对正常细胞的生物安全性。
[0108]
由以上测试可知，本发明提供的兼具抗癌与抗菌活性的水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物具有aie性质且水溶性优异，其在生物环境中的应用无需有机溶剂助溶或者聚合物包覆处理，提高了化合物的生物兼容性；具有大的斯托克斯位移(216nm)，能够有效避免自吸收，降低背景干扰；具有近红外荧光发射(734nm)、强的光稳定性以及抗光漂白性能，适用于革兰氏阳性菌及其相关耐药菌、肿瘤细胞、肿瘤组织的长时间近红外荧光成像；调控化合物的浓度可实现从溶酶体到线粒体的靶向成像；同时，本发明所述水溶性阴离子-π型芳基偶氮化合物还具有高效的i型ros产生能力，可对革兰氏阳性菌及其相关耐药菌、肿瘤细胞实现良好的光动力杀伤效果，构建兼具诊断与治疗于一身的诊疗试剂。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。