一种水凝胶敷料及其制备方法

1.本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种水凝胶敷料及其制备方法。


背景技术：

2.皮肤是人体的第一道屏障，对人体机制起保护作用，为了防止伤口细菌感染，促进伤口快速愈合，应选择合适的伤口敷料。传统的伤口敷料，如纱布、绑带等在去除时易造成伤口的二次伤害，且抗细菌感染效果不好。随着湿性伤口愈合理论被提出，水凝胶类敷料由于良好的渗透性、生物相容性和可提供利于伤口恢复的湿润环境而表现出很大的应用潜力。
3.微生物感染是影响急性和慢性伤口愈合的主要原因，为了防止伤口感染，以往的水凝胶敷料通常是在水凝胶中引入常规抗生素等各种抗菌剂，这会导致抗生素耐药性等问题。因此，研究人员专注于开发新的方法来产生具有抗菌特性的水凝胶，理想的伤口敷料应具有抗菌活性具有预防感染、吸收伤口液和提供气体交换等优点；还应具有可注射性，可注射性使得水凝胶敷料能够微创输送于伤口，甚至可以作用于深层伤口，为伤口愈合提供更好的环境；理想的伤口敷料还应具有很强的组织粘接性，紧密覆盖伤口，防止组织炎症，促进伤口愈合；此外，同时还应具有良好的细胞生物相容性，可促进细胞增殖和分化。因而，本发明旨在开发一种同时具备上述功能如抗菌性、注射性、黏附性、生物相容性以及促伤口愈合的多功能水凝胶敷料，具有重要应用价值。


技术实现要素：

4.本发明旨在提供一种同时具有注射性、黏附性、抗菌性和良好生物相容性的水凝胶敷料及其制备方法。本发明水凝胶能够通过注射方式，微创输送于伤口处并紧密黏附伤口，抑制细菌生长，促进伤口处细胞的增殖分化，以达到促进伤口愈合的效果。
5.基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.第一方面，本发明提供一种水凝胶敷料，本发明水凝胶敷料中含有共聚物p(vb-mv-hea)和共聚物p(vb-hpts-hea)；其中，共聚物p(vb-mv-hea)由n-(2-羟乙基)丙烯酰胺与1-甲基-1'-(4-乙烯苄基)-4,4'-联吡啶鎓盐聚合而成；共聚物p(vb-hpts-hea)由n-(2-羟乙基)丙烯酰胺与8-((4-乙烯苄基)氧)芘-1,3,6-三磺酸钠盐聚合而成。
7.优选地，水凝胶敷料中共聚物p(vb-mv-hea)与共聚物p(vb-hpts-hea)的重量比为(0.8～1.2):1。
8.优选地，水凝胶敷料中固形物含量为5wt％～30wt％。
9.优选地，共聚物p(vb-mv-hea)中n-(2-羟乙基)丙烯酰胺的摩尔分数为80wt％～95wt％；共聚物p(vb-mv-hea)中1-甲基-1'-(4-乙烯苄基)-4,4'-联吡啶鎓盐的摩尔分数为5wt％～20wt％。
10.优选地，共聚物p(vb-hpts-hea)中n-(2-羟乙基)丙烯酰胺的摩尔分数为80wt％～95wt％；共聚物p(vb-hpts-hea)中8-((4-乙烯苄基)氧)芘-1,3,6-三磺酸钠盐的摩尔分数
为5wt％～20wt％。
11.第二方面，本发明提供一种制备上述水凝胶敷料的方法，包括如下步骤：
12.将n-(2-羟乙基)丙烯酰胺与1-甲基-1'-(4-乙烯苄基)-4,4'-联吡啶鎓盐于反应溶剂中，在引发剂作用下发生共聚反应，经干燥制得共聚物p(vb-mv-hea)；
13.将n-(2-羟乙基)丙烯酰胺与8-((4-乙烯苄基)氧)芘-1,3,6-三磺酸钠盐于反应溶剂中，在引发剂作用下发生共聚反应，经干燥制得共聚物p(vb-hpts-hea)；
14.分别将共聚物p(vb-mv-hea)、共聚物p(vb-hpts-hea)配制为相应的水溶液，两种水溶液混合制得本发明水凝胶敷料。
15.优选地，共聚物p(vb-mv-hea)水溶液的质量浓度为32.1wt％～35.8wt％；共聚物p(vb-hpts-hea)水溶液的质量浓度为18.5wt％～21.1wt％。
16.优选地，引发剂包括但不限于4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)。
17.优选地，反应溶剂为体积分数为50％的乙醇水溶液。
18.优选地，共聚反应温度为70℃，共聚反应时间为48h。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
20.本发明水凝胶敷料由p(vb-mv-hea)和p(vb-hpts-hea)两种共聚物水溶液混合，经物理交联于室温条件即可快速成胶，制备方法简单，易于操作。
21.本发明水凝胶敷料具有可注射性、优良的黏附性能、抗菌抑菌性能和促进伤口愈合的效果。本发明水凝胶敷料可与皮肤组织紧密黏附并能维持至少6天，具有优良的黏附性能；本发明水凝胶敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌效果，抗菌性能优异；细胞毒性实验进一步证实本发明水凝胶敷料能够具有良好的生物相容性，不影响细胞增殖；皮肤愈合实验进一步证实本发明水凝胶敷料具有促进伤口愈合的能力和效果；对于深层伤口可采用将本发明水凝胶注射于伤口处使用，利用本发明水凝胶的黏附性、抑菌抗菌性以及促伤口愈合性能促使深层伤口的快速愈合。
附图说明
22.图1为两种聚合物的结构表征，其中，图1a为p(vb-mv
0.10-hea
0.90
)的氢谱，图1b为p(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)的氢谱；
23.图2为实施例3制备的水凝胶敷料常温注射效果图；
24.图3为实施例2～4制备的水凝胶敷料黏附性能效果图；
25.图4为实施例2～4制备的水凝胶敷料对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌性能评价；
26.图5为实施例2～4制备的水凝胶敷料细胞毒性效果图；
27.图6为实施例3制备的水凝胶敷料应用于皮肤愈合评价。
具体实施方式
28.为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
29.实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如
无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1
31.本实施例提供一种共聚物p(vb-mv-hea)和共聚物p(vb-hpts-hea)的制备方法，具体如下：
32.1、共聚物p(vb-mv-hea)的制备
33.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺(hea)、350mg的1-甲基-1'-(4-乙烯苄基)-4,4'-联吡啶鎓盐(vb-mv)、21.8mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和5.3ml、体积分数为50％的乙醇水溶液加入具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-mv-hea)。将p(vb-mv-hea)用氢谱表征结构，结果如图1a所示，可以看出共聚物p(vb-mv-hea)成功制备。
34.2、共聚物p(vb-hpts-hea)的制备
35.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺、499mg的8-((4-乙烯苄基)氧)芘-1,3,6-三磺酸钠盐(vb-hpts)、10.9mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和6.5ml、体积分数为50％的乙醇水溶液放于具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-hpts-hea)。将p(vb-hpts-hea)用核磁表征结构，结果如图1b所示，表明共聚物p(vb-hpts-hea)成功制备。
36.实施例2
37.本实施例提供一种共聚物p(vb-mv
0.05-hea
0.95
)、共聚物p(vb-hpts
0.05-hea
0.95
)的制备方法，并利用该两种共聚物制备本发明可注射抗菌水凝胶敷料，具体制备方法如下：
38.1、共聚物p(vb-mv
0.05-hea
0.95
)的制备，包括如下步骤：
39.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺(hea)、166mg的1-甲基-1'-(4-乙烯苄基)-4,4'-联吡啶鎓盐(vb-mv)、20.6mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和4.4ml、体积分数为50％的乙醇水溶液加入具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-mv
0.05-hea
0.95
)。
40.2、共聚物p(vb-hpts
0.05-hea
0.95
)的制备包括如下步骤：
41.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺、236mg的8-((4-乙烯苄基)氧)芘-1,3,6-三磺酸钠盐(vb-hpts)、10.3mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和5.2ml、体积分数为50％的乙醇水溶液放于具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-hpts
0.05-hea
0.95
)。
42.3、水凝胶敷料的制备，包括如下步骤：
43.称取66.8mg的p(vb-mv
0.05-hea
0.95
)溶于120μl超纯水，配制成p(vb-mv
0.05-hea
0.95
)水溶液；
44.称取58.2mg的p(vb-hpts
0.05-hea
0.95
)溶于255μl超纯水，配制成p(vb-hpts
0.05-hea
0.95
)水溶液；
45.将p(vb-mv
0.05-hea
0.95
)水溶液与p(vb-hpts
0.05-hea
0.95
)水溶液混合均匀形成固含为25wt％的水凝胶，即为本发明水凝胶敷料。
46.实施例3
47.本实施例提供一种共聚物p(vb-mv
0.10-hea
0.90
)、共聚物p(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)的制备方法，并利用该两种共聚物制备本发明可注射抗菌水凝胶敷料，具体制备方法如下：
48.1、共聚物p(vb-mv
0.10-hea
0.90
)的制备
49.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺(hea)、350mg的1-甲基-1'-(4-乙烯苄基)-4,4'-联吡啶鎓盐(vb-mv)、21.8mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和5.3ml、体积分数为50％的乙醇水溶液加入具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-mv
0.10-hea
0.90
)。
50.2、共聚物p(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)的制备
51.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺、499mg的8-((4-乙烯苄基)氧)芘-1,3,6-三磺酸钠盐(vb-hpts)、10.9mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和6.5ml、体积分数为50％的乙醇水溶液放于具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)。
52.3、水凝胶敷料的制备，包括如下步骤：
53.称取63.7mg的p(vb-mv
0.10-hea
0.90
)溶于120μl超纯水，配制成p(vb-mv
0.10-hea
0.90
)水溶液；
54.称取61.3mg的p(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)溶于255μl超纯水，配制成p(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)水溶液；
55.将p(vb-mv
0.10-hea
0.90
)水溶液与p(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)水溶液混合均匀形成固含为25wt％的水凝胶，即为本发明水凝胶敷料。
56.实施例4
57.本实施例提供一种共聚物p(vb-mv
0.15-hea
0.85
)、共聚物p(vb-hpts
0.15-hea
0.85
)的制备方法，并利用制备的共聚物p(vb-mv
0.15-hea
0.85
)和p(vb-hpts
0.15-hea
0.85
)制备本发明水凝胶敷料，具体制备方法如下：
58.1、共聚物p(vb-mv
0.15-hea
0.85
)的制备
59.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺(hea)、554mg的1-甲基-1'-(4-乙烯苄基)-4,4'-联吡啶鎓盐(vb-mv)、23.0mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和6.2ml、体积分数为50％的乙醇水溶液加入具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-mv
0.15-hea
0.85
)。
60.2、共聚物p(vb-hpts
0.15-hea
0.85
)的制备
61.将805mg的n-(2-羟乙基)丙烯酰胺、790mg的8-((4-乙烯苄基)氧)芘-1,3,6-三磺酸钠盐(vb-hpts)、11.5mg的4,4'-偶氮双(4-氰基戊酸)和8.0ml、体积分数为50％的乙醇水溶液放于具支试管，在氮气环境中70℃反应48h后转移至透析袋，在去离子水中透析2天，冷冻干燥得到蓬松状固体即共聚物p(vb-hpts
0.15-hea
0.85
)。
62.3、水凝胶敷料的制备，包括如下步骤：
63.称取56.8mg的p(vb-mv
0.15-hea
0.85
)溶于120μl超纯水，配制成p(vb-mv
0.15-hea
0.85
)水溶液；
64.称取68.2mg的p(vb-hpts
0.15-hea
0.85
)溶于255μl超纯水，配制成p(vb-hpts
0.15-hea
0.85
)水溶液；
65.将p(vb-mv
0.15-hea
0.85
)水溶液与p(vb-hpts
0.15-hea
0.85
)水溶液混合均匀形成固含为25wt％的水凝胶，即为本发明水凝胶敷料。
66.实施例5效果例
67.本实施例通过如下五方面对本发明水凝胶的性能进行分析，具体如下。
68.1、水凝胶敷料的注射性
69.本发明水凝胶敷料可在常温条件下进行注射操作，实施例2、3、4水凝胶均可采用常温注射方式使用，注射性如图2所示。
70.2、水凝胶的黏附性
71.本发明采用传统的拉伸试验机测量水凝胶的粘度，试验方法如下：
72.新鲜猪皮用乙醇冲洗后浸泡在pbs溶液中5min。将实施例2、3、4制得的水凝胶放置在两片猪皮(1
×
4cm2)之间，接触面积为1
×
1cm2。将该样品用50g的砝码压5min后立即以5mm/min的速度进行拉伸测试，直到被拉到失效状态，结果如图3所示。本发明的实施例2、3、4水凝胶敷料的粘附强度分别为4.7kpa、9.7kpa和13.7kpa，且在保存6天后仍保持在90.1％以上。
73.3、水凝胶的抗菌性
74.本发明以大肠杆菌(革兰氏阴性)和金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)为两种细菌模型，检测水凝胶的抗菌活性，具体试验方法如下：
75.实施例2、3、4制得的共聚物p(vb-mv-hea)和p(vb-hpts-hea)经紫外线照射30min消毒，在灭菌的pbs中溶解，然后在96孔板中混合成胶后再紫外消毒30min。在每孔的水凝胶表面加入10μl细菌悬液(1.0
×
10-6
cfu/ml)。37℃孵育4h后，每孔加入200μl灭菌的pbs，使活菌悬浮。取出100μl的悬液，用pbs稀释100倍。以直接稀释的菌悬液作为空白对照。每个稀释后的样品取100μl涂在lb琼脂平板上，在37℃下培养12h(大肠杆菌)或24h(金黄色葡萄球菌)。
76.结果如图4所示，结果表明本发明水凝胶敷料对两种细菌的抑菌率均为95％以上。
77.4、水凝胶的细胞毒性
78.用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的mem培养基溶解实施例2、3、4制得的共聚物p(vb-mv-hea)和p(vb-hpts-hea)，超声30min后混合形成水凝胶。这些水凝胶用紫外线辐射消毒至少2小时，然后在37℃含co2(5％)的湿化气氛中孵育3天得到水凝胶提取液。
79.将l929细胞播种到96孔板，每孔3.0
×
103个细胞。孵育一夜，将培养基从细胞中取出，用水凝胶提取液代替。空白组用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的mem培养基培养。孵育2、4天后，每孔加入cck-8溶液10μl，孵育2h后，将上述反应溶液100μl转移到新的96孔板上，用酶标仪测定450nm处的吸光度，细胞生存情况如图5a所示，可以看出，本发明提供的具有黏附性的可注射抗菌水凝胶敷料对细胞几乎无毒性且不影响细胞增殖。
80.将l929细胞播种到24孔板，每孔5.0
×
104个细胞。孵育过夜，将培养基从细胞中去除，用水凝胶提取液代替。空白组用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的mem培养基进行培养。孵育2天后，每孔加入2μm calcein-am和5μg/ml pi，黑暗孵育30min。然后用荧光显微镜对样品进行成像结果如图5b所示，活细胞显示calcein-am活性阳性(绿色荧光)，而死亡细胞显示pi阳性(红色荧光)，可以看出，本发明提供的具有黏附性的可注射抗菌水凝胶敷料在一个普通的二维培养系统中具有良好的体外细胞相容性。
81.用含有10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的mem培养基溶解p(vb-mv-hea)和p(vb-hpts-hea)，然后按上述方法进行溶解和灭菌。在水凝胶中进行3d培养前，l929细胞用细胞追踪器绿色(5μm)处理30min。然后，将5μl细胞悬液(5
×
104细胞)加入实施例3制得的p
(vb-hpts
0.10-hea
0.90
)水溶液中。在37℃下凝胶化3h后，在每个孔中加入2ml含10％胎牛血清的dmem，并放入培养箱(37℃，5％co2)中。经过1、2和3天的培养，样品在leica sp8 sted上成像，并使用imagej软件进行分析，结果如图5c所示，可以看出，本发明提供的具有黏附性的可注射抗菌水凝胶敷料具有良好的细胞相容性。
82.5、水凝胶敷料促进伤口愈合效果
83.糖尿病小鼠用异氟醚麻醉，冷冻麻醉后，剃除糖尿病小鼠的后毛，然后用0.45％的碘清洁。在小鼠的背部构建一个直径为1cm的全层伤口。然后将小鼠随机分为3组，进行不同的处理。伤口分别用pbs(模型组)、实施例3制得的水凝胶敷料和3m敷料(3m,1624w,tegaderm
tm
)覆盖。第0、10、20天拍摄伤面，用image j进行定量分析，结果如图6所示。
84.为了分析受伤表面细菌的菌落形成(cfu)，在伤口周围进行无菌交换，然后放入含有适当培养基的15ml离心培养管中。由图6可以看出，本发明提供的具有黏附性的可注射抗菌水凝胶敷料处理的创面愈合率与3m敷料阳性组相似，并明显快于模型组，特别是在治疗晚期(治疗后20天)，另外本发明提供的具有黏附性的可注射抗菌水凝胶敷料表现出更为优良的体内抗菌效果。
85.最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。