曲札茋苷在制备逆转铂类耐药肺癌药物中的应用的制作方法

1.本技术涉及曲札茋苷在制备逆转肺癌铂类药耐药性药物中的应用，属于医药领域。


背景技术：

2.据中国肿瘤登记中心2018年发布的数据显示，肺癌在我国男性肿瘤发病患者中占首位，在女性中位列第三。按照病理类型，肺癌可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，nsclc)约占80％。靶向治疗、细胞治疗和免疫治疗的快速发展为患者带来了希望，但目前化疗仍然是nsclc治疗的主要手段。化疗是肿瘤治疗的重要方法，而肿瘤细胞的多药耐药性极大地限制了化疗的效果，甚至使化学药物作用完全丧失，是导致化疗失败的重要原因。
3.多药耐药性(multidrug resistance,mdr)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对结构和作用机制不同的抗癌药物产生交叉抗药性，是肿瘤化疗失败的主要原因,也是长久以来困扰着肿瘤治疗的临床难题。mdr机制的形成是一个多基因、多因素、多水平、多结构和多步骤的复杂过程。克服肿瘤细胞mdr，提高抗癌药物疗效已成为当今肿瘤研究的重点与关键课题。目前多数化学药逆转剂往往只针对单一的耐药机制，且逆转剂本身不良反应较大，制约着临床的使用。天然药物成分治疗恶性肿瘤有其独特的优势，在临床上亦取得了可喜的成绩，越来越多的天然药物成分正在被挖掘、被研究、被使用。中药治疗疾病具有多途径、多环节、多靶点的特点，能明显提高化疗药物对肿瘤的细胞毒作用。
4.目前，已经批准上市的铂类抗癌药物，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等，临床用于卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、恶性淋巴瘤、头颈部癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤。虽然铂类作为化疗效果最好抗癌药物之一，并得到广泛应用，但其毒副作用以及肿瘤细胞的耐药性限制了其进一步的应用。因此，研发逆转铂类药物耐药性、高效低毒的新药具有中药现实意义和应用价值。
5.曲札茋苷是从大黄属植物如拉萨大黄、食用大黄等大黄属植物种中分离得到的天然化合物，具有广泛的生理活性和较好安全性。但现有技术中尚无曲札茋苷在逆转肿瘤耐药性作用的相关研究和应用。


技术实现要素：

6.本技术提供了一种用于改善上述技术问题的技术。提供曲札茋苷在制备逆转铂类耐药肺癌药物中的应用价值。
7.具体地，曲札茋苷化学式为(e)-1-(3,5-二羟苯基)-2-(3-羟基-4-o-d-吡喃葡萄糖苯基)乙烯或3,5,3
′
,4
′‑
四羟基茋-3
′‑
o-β-葡萄糖苷，结构式如式i：
[0008][0009]
曲札茋苷可作为天然化合物从野生或种植的廖科植物，如拉萨大黄(rheum lhasaense)、食用大黄(rheum rhaponticum)或虎杖(polygonum cuspidatum) 的根茎中提取及分离纯化获得，也可通过化学或生物合成方法获得。曲札茋苷中的成分也可由其它植物材料食用大黄及制备或进行化学合成获得。
[0010]
本发明提供在制备逆转铂类耐药肺癌药物中的应用。
[0011]
优选地，铂类药物为顺铂、卡铂和奥沙利铂。
[0012]
上述药物的剂型为口服剂、吸入剂和注射剂。曲札茋苷可按现有方法将其制成口服剂、吸入剂或注射剂。
[0013]
优选地，药物为注射液。注射液吸收快，作用迅速。特别是静脉注射，药液可直接进入血循环，更适于抢救危重病症之用。
[0014]
本发明还提供了一种治疗如肺癌的药物组合物，包括曲札茋苷、ddp及药学上可接受的辅料。
[0015]
优选的所述药物组合物的剂型为注射剂，所述曲札茋苷和ddp在药物组合物中所使用的浓度比为：50～400:0.125～32。
[0016]
本技术能产生的有益效果包括：
[0017]
1)实验显示，曲札茋苷能明显增加a549/ddp耐药细胞对ddp的敏感性，耐药逆转倍数在400g/ml，ddp为0.25g/ml时可达到2.96。
[0018]
2)曲札茋苷与顺铂合用可显著引起耐药细胞凋亡。
[0019]
3)在小鼠体内荷瘤实验中，曲札茋苷各剂量组显著增加顺铂对耐药细胞移植瘤的生长抑制。
[0020]
本技术提供的曲札茋苷在逆转铂类药耐药性肺癌方面具有应用价值和前景。
[0021][0022]
具体实施方法
[0023]
下面结合实施例详述本技术，但本技术并能不局限与这些实施例。
[0024]
实施例如无特别说明，本技术的实施例的原料、溶剂和助剂均通过商业途径购买，不进行处理。
[0025]
实施例1：制备曲札茋苷样品
[0026]
曲札茋苷的制备参见发明专利“曲札茋苷及其在制备预防和/或治疗病毒性肺炎的药物的应用(申请号：202010089195.7)”由拉萨大黄的根茎提取并纯化获得，或者由市场购买，hplc≥98％。
[0027]
实施例2：制备曲札茋苷样品注射液
[0028]
曲札茋苷注射液的制备参见发明专利“曲札茋苷及其在制备预防和/或治疗病毒性肺炎的药物的应用实施例4(申请号：202010089195.7)”。
[0029]
实施例3：制备曲札茋苷片剂样品
[0030]
材料：曲札茋苷、乙基纤维素(上海卡乐康，批号：sh312566)、hpmc(型号k100m，上海卡乐康，批号：pd315469)、预胶化淀粉(日本旭化成，批号： 6013)、胶体二氧化硅(湖州展望药业有限公司，批号：1011003)、硬脂酸镁 (湖南尔康制药有限公司，批号：1100018).
[0031]
制备方法：(1)预处理：曲札茋苷、乙基纤维素预胶化淀粉和hpmc分别过100目筛，备用；(预混合)：曲札茋苷加等量的乙基纤维素混合均匀，按等量递加法逐步加入其余乙基纤维素，并混匀；(3)总混合：上述混合物逐步加入预胶化淀粉、胶体二氧化硅和hpmc混合均匀，最后加入硬脂酸镁混匀； (4)压片：压片机压制成6kg/cm2～10kg/cm2之间的片剂。如表1。
[0032]
表1：曲札茋苷片剂样品的组分组成
[0033]
成分含量(mg)/片百分含量(％)/片曲札茋苷3510乙基纤维素133.738.2羟丙基甲基纤维素(hpmc)10530预胶化淀粉7020胶体二氧化硅3.51硬脂酸镁2.80.8
ꢀꢀ
片重：350mg
[0034]
实施例4：制备曲札茋苷吸入剂样品
[0035]
制备方法：将曲札茋苷采用气流粉碎至d
50
＝6微米以下，与粒径在75
·
100 微米的乳糖按质量比1：9进行混合，将药物粉末包装入胶囊或泡罩或干粉吸入器内，获得吸入剂。
[0036]
实施例5：曲札茋苷对耐顺铂人肺腺癌细胞a549/ddp耐药逆转作用实验
[0037]
1实验材料：人肺腺癌耐药细胞株a549/ddp购自上海拜力生物科技有限公司。曲札茋苷为自制，顺铂(ddp)，rpmi-1640培养基和12％小牛血清，mtt， annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒，鼠抗人lrp单克隆抗体。
[0038]
2实验仪器：el340i酶标仪，facs calibur流式细胞仪，lsm510型激光共聚焦显微镜。
[0039]
3实验方法：
[0040]
3.1细胞培养：a549/ddp细胞用12％小牛血清培养，用2μg/ml的ddp维持其耐药性；在37℃、5％co2的培养箱中培养，2d传代1次。实验前2周将 a549/ddp细胞换用无ddp的培养基培养，选取对数生长期的细胞进行实验。
[0041]
3.2mtt法检测曲札茋苷对a549/ddp细胞的细胞毒作用：将处于对数生长期的 a549/ddp，用胰蛋白酶、edta消化后计数；用含12％胎牛血清在rpmi-1640 培养基配成一定浓度，以5
×
103/孔接种96孔板；细胞贴壁后，实验组加入终质量浓度分别为50、100、200、400、800μg/ml的曲札茋苷药液20μl，置37℃、5％co2的培养箱中培养；对照组加药物溶解溶剂20μl，每个浓度设3 个平行孔。培养48h后，每孔分别加入20μl的mtt溶液(5mg/ml)，继续培养4h。然后以1000r/min离心3min，弃上清；每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振
荡10min，使结晶物充分溶解。全自动酶标仪于570nm处测定各孔吸光值(a值)，参比波长为630nm。实验重复3次，取平均值。细胞增殖抑制率＝(1－实验组a值/对照组a值)
×
100％。
[0042]
3.3曲札茋苷对a549/ddp细胞耐ddp药性逆转作用：将处于对数生长期的 a549/ddp细胞，消化、接种同3.2。对照组分别加入终质量浓度为0.125、 0.25、0.5、1、2、4、8、16、32μg/ml的ddp，实验组在对照组基础上再加入逆转浓度的曲札茋苷。置37℃、5％co2的培养箱中培养；对照组加相同浓度的药物溶解介质，每个浓度设3个平行孔。培养48h后，每孔分别加入20μl的 mtt溶液(5mg/ml)，继续培养4h。然后以1000r/min离心3min，弃上清；每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。全自动酶标仪于570nm处测定各孔吸光值(a值)，参比波长为630nm。实验重复 3次，取平均值。细胞增殖抑制率＝(1－实验组a值/对照组a)
×
100％。耐药逆转倍数＝逆转剂加抗癌药物组细胞死亡率/抗癌药物组细胞死亡率。
[0043]
3.4统计学方法：结果以表示，使用spss 11.5软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。
[0044]
4实验结果
[0045]
4.1曲札茋苷对a549/ddp细胞的细胞毒作用
[0046]
实验结果如表2所示。
[0047]
表2：曲札茋苷对a549/ddp细胞增值的影响(n＝3)
[0048][0049]
实验结果提示，随着曲札茋苷浓度的升高，药液对耐药性a549/ddp细胞的抑制作用逐渐增强。确定细胞增殖抑制率≤5％的药物浓度(400μg/ml)为该药的非细胞毒性浓度，并作为最佳逆转耐药浓度进行试验。
[0050]
4.2曲札茋苷对a549/ddp细胞耐ddp药性逆转作用
[0051]
实验结果见表3及表4。
[0052]
表3：曲札茋苷对暴露于不同浓度ddp中a549/ddp细胞增值抑制率的影响
[0053][0054]
与对照组比较，*p＜0.05，**p＞0.05
[0055]
表4：曲札茋苷对暴露于不同浓度ddp中a549/ddp细胞耐药逆转倍数的影响
[0056][0057]
实验结果提示，曲札茋苷+ddp实验组能显著提高a549/ddp细胞耐各剂量 ddp的细胞增殖抑制率，表明其显著增加a549/ddp细胞暴露于各浓度ddp药液中的敏感性，显著逆转了细胞对ddp的耐药性,耐药逆转倍数在ddp浓度为 0.25μg/ml时最优，为2.96倍。
[0058]
实施例6：曲札茋苷注射液对人肺腺癌耐顺铂细胞株移植瘤小鼠的影响 1实验材料：c57bl/6j小鼠50只，体质量(20g
±
2)g购于中国医学科学院肿瘤医院实验动物中心。人肺腺癌耐药细胞株a549/ddp购自上海拜力生物科技有限公司。
[0059]
2实验设备：万分之一电子天平
[0060]
3实验方法：以渐进式给药法，将a549/ddp细胞依次培养于含0.02、0.03、 0.05、0.08、0.12、0.20、0.30、0.40mg/l顺铂(ddp)的1640培养液中，筛选出能在0.4mg/l ddp中稳定生长传代的耐药细胞。收集生长良好的耐药细胞，0.9％氯化钠溶液洗涤，调整细胞浓度为1
×
106/ml，取雌雄性小鼠各1 只，接种于c57bl/6j小鼠后肢皮下，每只小鼠接种0.2ml。10天后取有实体瘤生长的c57bl/6j小鼠，断颈椎处死两只荷瘤种鼠，无菌条件下剥离皮下瘤体，剪去瘤体表面的血管、结缔组织以及内部坏死组织，0.9％氯化钠溶液冲洗，剪碎后放入匀浆器，研磨瘤组织成为细胞悬液，滴加0.9％氯化钠溶液调节细胞密度至1
×
107/ml，各小鼠右腋下每天接种0.2ml细胞悬液形成小鼠获得耐顺铂人肺腺癌动物肿瘤模型。
[0061]
48只造模成功小鼠，接种后第4天开始药物干预。将48只c57bl/6j小鼠随机分为5组，各组间小鼠体重及瘤体积无显著性差异。分组为:荷瘤对照组、顺铂(ddp)组、曲札茋苷注射液高剂量(20mg
·
kg
－1
·d－1
)组、曲札茋苷高剂量注射液(20mg
·
kg
－1
·d－1
)联合顺铂(4mg
·
kg
－1
·d－1
)组、曲札提取注射液中剂量注射液(10mg
·
kg
－1
·d－1
)联合顺铂(4mg
·
kg
－1
·d－1
)组和曲札茋苷低剂量(5mg
·
kg
－1
·d－1
)联合顺铂(4mg
·
kg
－1
·d－1
)组每组8 只，雌雄各半。对照组：0.9％氯化钠溶液0.2ml/只腹腔注射(ip)，隔天各腹腔注射1次；顺铂(ddp)组：顺铂(4mg
·
kg
－1
·d－1
)0.9％氯化钠溶液0.2ml，隔天各腹腔注射1次。高、中、低剂量曲札茋苷联合顺铂实验组：各剂量曲札注射液+顺铂0.9％氯化钠溶液0.2ml，隔天各腹腔注射1次，共给药28天。
[0062]
肿瘤生长情况的观察，用药期间每隔3天测量小鼠皮下肿瘤最大长径 (a)；和横径(b)，计算肿瘤体积，平均瘤体积＝a
×
b2/2，实验结束后，完整剥取移植瘤称重，计算各组药物的抑瘤率:抑瘤率＝(1－治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)
×
100％。如表5。
[0063]
4统计学方法：结果以表示，使用spss 11.5软件进行统计学处理，组间比较采用t检验。
[0064]
5实验结果：
[0065]
表5：小鼠皮下肿瘤的体积、重量和抑制率
[0066]
组别动物数(只)抑瘤率(％)对照组80.0ddp组830.1
*
曲札茋苷高剂量组82.1曲札茋苷低剂量+ddp组848.3
**##
曲札茋苷中剂量+ddp组857.2
**##
曲札茋苷高剂量+ddp组858.1
**##
[0067]
与对照组比较，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01；与ddp组比较，
#
p＜0.05，
##
p＜0.01
#
[0068]
实验结果：实验结果表明，与对照组及顺铂组比较，曲札茋苷联合顺铂组的抑瘤率均明显升高，差异均有统计学意义(p＜0.01)。表明曲札茋苷曲札茋苷各剂量组显著增加顺铂对耐药细胞移植瘤的生长抑制。
[0069]
说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”、“优选实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本技术概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实
现这种特征、结构或者特点也落在本技术的范围内。
[0070]
这里参照本技术的多个解释性实施例对本技术进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本技术公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本技术公开和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变形和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。