异泽兰黄素在治疗肝纤维化药物中的应用

1.本发明涉及一种化学成分-异泽兰黄素(eupatilin)，具体涉及异泽兰黄素 在治疗肝纤维化药物中的应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理学基础，表现为肝内结缔组织异常增 生、细胞外基质(extracellular matrix,ecm)过度沉积。肝纤维化阶段是治 疗各种慢性肝病的关键时期，如果不进行及时的干预治疗，慢性肝病将进一步 发展为肝硬化导致肝功能全面衰退，甚至有可能转变为肝癌，给患者及其家庭 带来巨大的经济负担。近年来，尽管肝纤维化的研究取得较大进展，但临床上 仍缺乏有效的治疗药物和手段，因此，开发有效的抗肝纤维化药物具有重要的 临床价值和意义。
3.肝星状细胞是肝纤维化发生、发展的关键细胞，肝星状细胞活化是肝纤维 化发生的中心环节。因此，抑制肝星状细胞活性是肝纤维化防治的有效方法和 策略。肝星状细胞是位于肝细胞和肝窦内皮细胞之间的一种间质细胞，约占肝 内细胞总数的15％。在正常的肝组织中，肝星状细胞处于静息状态，主要作为维 生素a的储存和代谢场所，分泌胶原及其消化酶，维持ecm平衡。肝损伤后， 肝星状细胞邻近的肝细胞、肝窦内皮细胞、kupffer细胞等分泌多种细胞因子， 如tgf-β、pdgf、tnfα等，诱导并激活肝星状细胞。hsc活化后增殖能力增强， 维生素a储存能力消失，开始大量合成胶原蛋白等ecm成分，同时ecm消化酶 分泌减少，导致肝内ecm过度积累。过度沉积的ecm将破坏肝细胞正常结构与 代谢功能，加剧肝纤维化程度。因此，抑制肝星状细胞的ecm表达能够有效抑 制肝纤维化，肝星状细胞也成为治疗肝纤维化的关键靶标和研究热点。
4.越来越多的研究表明，中医药在改善肝纤维化病人临床症状方面疗效显著， 且具有副作用小、药品价格低廉等明显优势。但中药因其活性成分复杂、作用 靶点不明确，严重制约了抗肝纤维化的中药新药开发。近年来，大量的研究发 现，中药活性成分具有广泛的药理学活性，其中，青蒿素已成为全球广泛使用 的抗疟疾药物，千金藤素被发现具有高效的抗新型冠状病毒的药理学活性。异 泽兰黄素是从中药艾蒿中提取的一种黄酮类活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗 肿瘤、胃黏膜保护等生物学活性。目前，无任何技术及研究公开异泽兰黄素具 有预防或治疗肝纤维化的作用及应用的公开信息。


技术实现要素：

5.发明目的：针对肝纤维化治疗中的存在的问题，本发明提供了肝纤维化的 一种新的治疗策略，即异泽兰黄素在治疗肝纤维化药物中的应用。
6.本发明采用异泽兰黄素为原料，单用制备成口服的抗肝纤维化药物。
7.为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
8.异泽兰黄素(eupatilin)是一种提取于中药艾蒿中的黄酮类化合物，其cas 号为22368-21-4，化学式为c18h16o7，分子量为344.32，分子结构式如下：
[0009][0010]
本发明首次使用肝纤维化小鼠模型评估了异泽兰黄素对肝纤维化标志的影 响，探究了异泽兰黄素对人肝星状细胞系lx-2活性及增殖的影响。实验结果显 示，异泽兰黄素在整体动物和体外细胞水平都有较好的抗肝纤维化作用，表明 异泽兰黄素能够作为治疗肝纤维化的药物。
附图说明
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图1是对照组、模型组，异泽兰黄素低、中、高剂量组的小鼠肝组织he、 马松染色。
[0012]
图2是异泽兰黄素对ccl4诱导的肝纤维化小鼠肝组织的ecm表达的影响。 a-b分别为对照组、模型组，异泽兰黄素低、中、高剂量组的肝组织i型胶原 (col1a1)和纤连蛋白(fibronectin)的mrna相对表达量。*p≤0.05。
[0013]
图3是异泽兰黄素对ccl4诱导的肝纤维化小鼠肝组织纤维化标志物表达的 影响。a为对照组、模型组、异泽兰黄素高剂量组的肝组织i型胶原(col1a1)、 α平滑肌肌动蛋白(α-sma)和纤溶酶原激活物抑制剂(pai-1)的蛋白表达；b为图3a蛋白条带灰度值统计。***p≤0.001，****p≤0.0001。
[0014]
图4是异泽兰黄素对lx-2细胞增殖的影响。a-b为edu染色试剂盒检测检 测异泽兰黄素对lx-2细胞增殖的影响；c为cck8试剂盒检测异泽兰黄素对lx-2 细胞增殖的影响。*p≤0.05，**p≤0.01，****p≤0.0001。
[0015]
图5是转录组学分析异泽兰黄素对lx-2细胞中ecm成分胶原基因表达的影 响。
[0016]
图6是异泽兰黄素对lx-2细胞中肝纤维化标志物的影响。a-b为不同浓度 异泽兰黄素对肝纤维化标志物i型胶原(col1a1)和α平滑肌肌动蛋白(α-sma) 蛋白表达的western blot检测及条带灰度值统计。*p≤0.05，**p≤0.01， ***p≤0.001。图7是illumina truseqtm rna sample prep kit方法操作流程图。图8是illumina truseqtm rna sample prep kit方法分析流程图。
具体实施方式
[0017]
下面结合具体实施例及附图来进一步详细说明本发明。
[0018]
实施例一：异泽兰黄素在治疗ccl4诱导的小鼠肝纤维化中的应用
[0019]
1.实验方法：
[0020]
(1)ccl4诱导的肝纤维化小鼠与药物干预
[0021]
选择同批次体重16～18g的雄性小鼠30只，适应性饲养1周后，随机选取6 只为正常对照组，其它小鼠采用腹腔注射20％四氯化碳玉米油溶液的方法建立肝 纤维化模型，每隔三天注射一次，连续注射10次，共持续30天。通过对肝组 织苏木精-伊红(he)、马松(masson)染色确定模型构建成功。
[0022]
使用0.5％的cmc将异泽兰黄素制成悬浮口服制剂，以10mg/(kg
·
d)干预剂 量为低浓度，以其2倍、4倍为中、高浓度干预剂量。将小鼠随机分入各组并进 行相应的干预处理。小鼠各组及相应处理如下：个体实验组：正常对照组6只 (生理盐水灌胃)、肝纤维化模型组6只(生理盐水灌胃)、异泽兰黄素低剂量 组6只、异泽兰黄素中剂量组6只、异泽兰黄素高剂量组6只。各组小鼠实验 期间分笼饲喂，自由进水。
[0023]
(2)肝脏病理学检测
[0024]
末次小鼠药物干预后，断食不断水，共12小时。然后配置浓度为2％的戊 巴比妥钠并以0.25ml/100g剂量采用腹腔注射麻醉小鼠。轻夹小鼠脚蹼肉，如 小鼠无疼痛反射。打开小鼠腹腔，暴露肝脏，取左侧最大叶肝脏边缘约1cm宽 组织，切取其中1/3置于4％多聚甲醛溶液中固定，剩余2/3肝组织放入液氮速 冻后迅速转入-80℃冰箱保存备用。
[0025]
应用he、masson染色法观察正常对照组、肝纤维化模型组、异泽兰黄素干 预组的肝组织正常形态结构和病理形态变化。
[0026]
(3)肝组织中ecm表达的荧光定量pcr检测
[0027]
取冻存的不同干预组的肝组织30mg/样品，使用trizol试剂提取mrna，并 逆转录为cdna，并进行col1a1，fibronectin的荧光定量pcr检测。根据δδct 方法统计不同分组间的基因相对表达量。
[0028]
(4)肝组织中纤维化标志物表达的western blot检测
[0029]
取冻存的对照组、模型组和高浓度组的肝组织60mg/样品，提取总蛋白，使 用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，然后使用5
×
sds loading buffer 混匀，置于100℃条件下加热5min，使蛋白质变性，最后将处理好的蛋白样品 于-80℃冰箱中保存备用。使用10％sds-page凝胶，将目的条带转至pvdf膜上， 在5％脱脂奶粉中室温封闭2小时，然后将pvdf膜于4℃条件下一抗孵育过夜。 孵育结束后，使用pbst清洗5次，每次5分钟。在室温条件下孵育二抗1小时 后，使用pbst清洗5次，每次5分钟。在pvdf膜上加入超敏显色液，使用化 学发光成像系统观察目的蛋白条带。
[0030]
2.实验结果：
[0031]
(1)一般观察
[0032]
正常对照组小鼠食欲良好，活泼好动，体重不断增加；模型组小鼠随着造 模时间延长，逐渐出现食欲减退，运动减少，体重增加缓慢；加药组小鼠，食 欲和运动量都有所改善，体重增加。肉眼观察正常对照组小鼠肝脏呈现红褐色， 表明光滑柔软；模型组小鼠肝脏呈现暗红色，表明布满颗粒物；加药组小鼠肝 脏较模型组小鼠有较大改善，颗粒物明显减少。
[0033]
(2)异泽兰黄素明显缓解ccl4诱导的肝纤维化小鼠的纤维化程度
[0034]
通过he和masson染色方法检测体内实验各分组肝纤维化情况，组织切片 染色结果显示，正常对照组肝小叶结构完整，模型组肝小叶结构显著被破坏， 肝内胶原纤维组织明显增生，纤维间隔增厚，并连接成片，产生大量假小叶， 肝纤维化程度较高。各治疗组与模型组相比纤维沉积量显著减少，纤维化程度 明显缓解(图1)。表明异泽兰黄素能够显著改善肝纤维化小鼠模型的纤维化症 状，具有抑制肝纤维化作用。
[0035]
(3)异泽兰黄素显著下调肝纤维化小鼠肝组织中ecm的mrna表达
[0036]
定量pcr结果显示，不同剂量异泽兰黄素可以显著下调肝纤维化重要ecm 成分i型
胶原(col1a1)和纤连蛋白(fibronectin)的mrna表达，说明异泽 兰黄素具有治疗肝纤维化的作用(图2)。
[0037]
(4)异泽兰黄素显著下调肝纤维化小鼠肝组织中纤维化标志物蛋白表达
[0038]
western blot结果显示，高剂量异泽兰黄素能够显著下调肝纤维化标志物 col1a1、α-sma和pai-1蛋白表达，说明异泽兰黄素具有抑制肝纤维化的作用 (图3)。
[0039]
实施例二：异泽兰黄素对肝星状细胞lx-2增殖的影响
[0040]
1.实验方法
[0041]
(1)edu染色实验
[0042]
本实验使用碧云天的beyoclick
tm edu-594细胞增殖检测试剂盒，操作按其 说明书进行，具体如下：
[0043]
a.在6孔板中接种适当数量的lx-2细胞，细胞培养过夜后，加入0、20、 40、80μm的异泽兰黄素干预48小时。
[0044]
b.配制2x的edu工作液：由于edu工作液是与培养液等体积加入到孔板中， 所以需要配制成2x的工作液。使用的edu终浓度为10μm(1x)，用细胞培养液 1:500稀释edu(10mm)即可得到2x的edu工作液(20μm)。
[0045]
c.将37℃预热的2x的edu工作液，等体积加入6孔板中，使6孔板中的 edu终浓度变为1x，edu孵育lx-2细胞2.5小时。
[0046]
d.edu标记lx-2细胞完成后，去除培养液，并加入1ml 4％的多聚甲醛进行 固定。
[0047]
e.除去固定液，用pbs洗涤lx-2细胞3次，每次5分钟。
[0048]
f.除去pbs后，使用含0.3％triton x-100的pbs通透液进行细胞通透， 室温孵育15分钟。
[0049]
g.除去通透液后，使用pbs洗涤细胞2次，每次5分钟。
[0050]
h.按照操作说明配制click反应液。
[0051]
i.去除6孔板中的pbs，每孔加入0.5ml click反应液，轻轻摇晃培养板以 确保反应混合物可以均匀覆盖样品，室温避光孵育30分钟。
[0052]
j.吸除click反应液，用pbs洗涤3次，每次5分钟。
[0053]
k.去除pbs，加入hoechst33342，孵育10分钟。
[0054]
o.吸除1x hoechst 33342溶液，用洗涤液洗涤3次，每次5分钟。
[0055]
p.随后即可进行荧光显微镜观察。
[0056]
(2)cck8实验检测
[0057]
lx-2细胞的培养、药物处理及cck8检测：将lx-2细胞在含10％fbs的高 糖dmem培养基中，于37℃，5％co2条件下的培养箱中培养。
[0058]
标准曲线的制备：在96孔板中，按照每孔铺入不同个数的细胞(1
×
104、 2
×
104、4
×
104、8
×
104、1.6
×
105、3.2
×
105)，形成细胞密度梯度，过夜培养 后，每孔加入10μlcck8试剂，孵育1-4小时，使用酶标仪检测细胞od值，制 作不同细胞数量的od值标准曲线。
[0059]
lx-2细胞的药物处理：将lx-2细胞以1
×
104/孔的密度接种到96孔板中， 培养过夜后，配制含有不同浓度异泽兰黄素(0、10、20、40、60、80μm)的 完全培养基，将上述配制的含药培养基加入96孔板中，孵育48小时后，去除 旧培养基，每孔加入100μl新鲜完全培养基，然后每孔再加入10μl cck8试 剂，细胞培养箱孵育1-4小时，使用酶标仪检测细胞od值，
根据标准曲线计算 od值对应的细胞个数。
[0060]
2.实验结果
[0061]
(1)异泽兰黄素能够显著地减少edu阳性细胞比例，说明异泽兰黄素能够 抑制lx-2细胞增殖活性(图4a,b)。
[0062]
(2)异泽兰黄素能够浓度依赖性地抑制lx-2细胞增殖(图4c)。
[0063]
实施例三：异泽兰黄素对lx-2细胞中纤维化标志物表达的影响
[0064]
1.实验方法
[0065]
(1)高通量rna测序与分析
[0066]
本实验的mrna测序基于illumina novaseq 6000测序平台，对80μm异泽 兰黄素处理的lx-2细胞转录出来的total mrna进行测序，测序实验采用 illumina truseqtm rna sample prep kit方法进行文库构建，其操作流 程图如图7所示：
[0067]
测序完成后，对获得的数据进行质控及数据分析，分析流程如图8所示：
[0068][0069][0070]
(2)western blot检测
[0071]
使用不同浓度异泽兰黄素(0、20、40、80μm)干预lx-2细胞48小时后， 收集6孔板中lx-2细胞，每孔加100μl细胞裂解液，细胞充分裂解后，于4℃， 14000rpm离心10min，收集上清。使用bca蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度， 然后使用5
×
sds loading buffer混匀，置于100℃条件下加热5min，使蛋白 质变性，最后将处理好的蛋白样品于-80℃冰箱中保存备用。使用10％sds-page 凝胶，将目的条带转至pvdf膜上，在5％脱脂奶粉中室温封闭2小时，然后将 pvdf膜于4℃条件下一抗孵育过夜。孵育结束后，使用pbst清洗5次，每次5 分钟。在室温条件下孵育二抗1小时后，使用pbst清洗5次，每次5分钟。在 pvdf膜上加入超敏显色液，使用化学发光成像系统观察目的蛋白条带。
[0072]
2.实验结果
[0073]
(1)异泽兰黄素显著抑制lx-2细胞中ecm成分胶原蛋白基因(col1a1、 col1a2、col8a1、col9a2、col11a1、col12a1、col17a1)的mrna表达(图5)。
[0074]
(2)异泽兰黄素显著抑制lx-2细胞中肝纤维化标志物col1a1和α-sma 的蛋白表达(图6)。
[0075]
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具 体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只 适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依 据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述， 本说明书内容不应理解为对本发明的限制。