植物乳杆菌HFY05在制备缓解脑组织和胰腺组织损伤的药物中的应用

植物乳杆菌hfy05在制备缓解脑组织和胰腺组织损伤的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及植物乳杆菌hfy05在制备缓解脑组织和胰腺组织损伤的药物中的应用。


背景技术：

2.酒精性胰腺炎(alcoholic pancreatitis)属于一种比较严重的酒精性并发症。由于患者经常喝酒或者是短时间内大量饮酒，造成人体当中的酒精含量偏高，出现了一种胰腺功能损伤性改变。酒精性胰腺炎多发生在饮酒过量的人身上，因为酒精会刺激胰腺分泌，也会导致十二指肠的水肿和痉挛，久而久之会使胰管的压力增加，导致胰腺分泌的胰液外露，导致引发炎症，甚至还会使胰腺附近的器官发生损害，因为这类炎症大多都是酒精导致的，所以一般都称为酒精性胰腺炎。
3.过量饮酒使大脑额叶和边缘系统相关的记忆和高级精神功能的慢性损害被叫做酒精所致脑损伤(alcohol related brain damage)。因此，合并了酒精所致遗忘综合征和额叶综合征两个概念。遗忘综合征的主要表现为近记忆损害。大脑额叶受损有抽象思维、概念形成、制定计划、复杂信息加工的缺陷的现象，但其他认知功能相对保持完好，意识清晰。
4.乳酸菌具有调节肠道菌群，控制体内内毒素，抑制腐败微生物的生长和繁殖，提高免疫力，抗氧化，控制体内内毒素，抑制腐败微生物的生长和繁殖，降胆固醇等多种功能，某些乳酸菌还可以通过减轻氧化应激、改善肠道通透性和调节肠道菌群从而缓解酒精引起的肝功能的下降。乳酸菌是参与传统发酵食品发酵的主要微生物群，如发酵乳制品。乳酸菌产生的挥发性化合物包括醛、酸和酯的小分子，这些小分子促进了香味的形成。乳酸菌在自然界中分布广泛。目前，多项研究结果证实：通过补充益生菌改善肠道菌群紊乱，修复肠黏膜屏障，减少内毒素等有毒物质渗漏入血的方式，从而延缓酒精性肝损伤进程。其中，乳酸菌能通过保护胃粘膜减少酒精从胃内的吸收，从而降低了乙醛和自由基生成，并通过降低循环血中内毒素含量，起到预防酒精造成的肝损伤问题。其他研究表明乳酸菌在人体中具有多种重要的生理功能，如维持微生态平衡、产生营养、促进组织的发育等。当益生菌数量减少，有害菌增多时，机体许多反应缓慢，如免疫反应，炎症细胞增多，从而引起一系列代谢紊乱。但是，目前鲜有乳酸菌用于脑组织损伤和胰腺组织损伤中的相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hfy05在制备缓解脑组织和胰腺组织损伤的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过实验验证发现植物乳杆菌hfy05对酒精性肝损伤实验小鼠胰腺和脑组织具有保护作用。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供植物乳杆菌在制备缓解脑组织和胰腺组织损伤的药物中的应用。
8.本发明还提供植物乳杆菌hfy05在制备预防和/或治疗脑组织和胰腺组织损伤的
药物中的应用。
9.优选的是，所述植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)hfy05的保藏编号为cgmccno.16635，已于2018年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
10.优选的是，所述脑组织和胰腺组织损伤是由乙醇导致。
11.本发明还提供一种缓解脑组织和胰腺组织损伤的药物，包含植物乳杆菌hfy05，所述植物乳杆菌hfy05的保藏编号为cgmcc no.16635。
12.本发明还提供一种预防和/或治疗脑组织和胰腺组织损伤的药物，包含植物乳杆菌 hfy05，所述植物乳杆菌hfy05的保藏编号为cgmcc no.16635。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.本发明通过体外分解乙醇以及动物实验验证发现：植入乳杆菌hfy05(lps-hfy05) 能有效抑制乙醇导致小鼠脑组织和胰腺组织损伤所致血清中氧化相关酶(sod、cat、 gsh等)和adh的降低，提高mda、ins、lps含量。lps-hfy05能缓解乙醇导致脑损伤小鼠γ－氨基丁酸(gaba)水平降低和乙醇导致胰腺损伤小鼠淀粉酶(ams)水平减少；下调乙醇导致的胰腺损伤小鼠脂多糖(lps)水平。pcr检测进一步显示lp
‑ꢀ
hfy05上调pi3k，irs，glut-4的表达。可见，lp-hfy05是一种对酒精诱导的小鼠胰腺和脑组织损伤具有保护作用的优质微生物菌株，能够为乙醇诱导的胰腺和脑组织损伤的预防和治疗提供新的方向。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为小鼠体重和胰腺组织重量；
17.图2为小鼠胰腺组织切片染色结果；
18.图3为小鼠脑组织切片染色结果；
19.图4为小鼠脑组织指标γ－氨基丁酸测定结果；
20.图5为小鼠胰腺组织测定指标淀粉酶(ams)和细菌脂多糖(lps)测定结果；
21.图6为小鼠血清细胞因子il-1β，il-6，il-10，tnf-α和ifn-γ水平测定结果；
22.图7为小鼠血清中adh，aldh，ast/got，alt/gpt，ins，ros，t-sod， cat，gsh，mda，t-cho和tg水平测定结果；
23.图8为mrna水平上qpcr检测乙醇诱导脑组织和胰腺组织中不同基因表达的结果。
具体实施方式
24.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
25.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
26.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
27.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
28.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
29.以下实施例中的植物乳杆菌hfy05已在文献“isolation and identification oflactobacillus plantarum hfy05 from natural fermented yak yogurt and its effect onalcoholic liver injury in mice”公开，也已保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心，以下所用植物乳杆菌hfy05为重庆第二师范学院实验室保藏传代的菌株。
30.实施例1乳酸菌体外分解乙醇能力的测定
31.1、筛选能在乙醇中存活的乳酸菌
32.液体富集培养基：将mrs液体培养基121℃，15min灭菌后，添加22μm滤膜的滤过的无水乙醇，添加量为8％(v/v)。
33.向5ml含乙醇mrs培养基中接入200μl活化好的乳酸菌，并在0h时用平板计数法计算活菌数，共同培养24h后再次计算活菌数。最终乳酸菌在含乙醇的培养基中的存活率＝24h存活率/0h存活率
34.2、乳酸菌对乙醇的体外降解作用
35.重铬酸钾-硫酸溶液的配制：取重铬酸钾1g溶于25ml水中，边搅拌边小心加入 4ml浓硫酸。配制好后放置待用。
36.乙醇标准溶液的配制：向玻璃试管中加入体积浓度分别为0％，2％，4％，6％，8％， 10％的乙醇标准溶液0.1ml，每个试管中1.0ml重铬酸钾-硫酸溶液，充分摇匀，盖好盖子将试管置于沸水浴中10min，使乙醇充分挥发，并被重铬酸钾-硫酸溶液氧化，取出试管，于波长610nm处测定重铬酸钾-硫酸溶液的吸光度值。以乙醇体积浓度(v/v) 为横坐标，吸光度为纵坐标，制作乙醇标准曲线。
37.乙醇降解能力的测定：以mrs液体培养基为溶剂，配制乙醇浓度(v/v)为20％、 40％的mrs乙醇培养液，现配现用。分别取在上一步验证对乙醇有耐受作用的乳酸菌 200μl，加入不同浓度的含20％和40％乙醇的mrs液体培养基中，37℃培养24h后，以未加入乳酸菌的含乙醇培养基为对照，利用重铬酸钾-浓硫酸发及标准曲线，测定乙醇残留量，比较各乳酸菌对酒精的分解能力。
38.3、乳酸菌体外分解乙醇能力测定
39.将上述经过乙醇二次活化的乳酸菌4000rpm离心后收集菌体，用1-2ml灭菌的超纯水重悬，再向其中加入相应体积的乙醇，使其成为10％(v/v)的乙醇溶液，置于37℃环境培
养3、6、9、12小时后，使用重铬酸钾浓硫酸法测定上清液的乙醇含量。
40.结果如表1所示，植物乳杆菌hfy05不仅能在乙醇中存活下来且还具有一定体外分解乙醇的能力，约为60％。如表2所示，植物乳杆菌的体外存活率约为67％。
41.表1植物乳杆菌hfy05体外分解乙醇
[0042][0043]
表2植物乳杆菌hfy05体外存活率
[0044][0045]
实施例2动物水平验证实验
[0046]
icr小鼠，分组为正常组、急性酒精模型、药物组(异甘草酸镁，150mg/kg.bw)、植物乳杆菌hfy05(1
×
109cfu/ml)组、保加利亚乳杆菌(l.delbruechii subsp.bulgaricus， 1
×
109cfu/ml)组。样品组每天给予1
×
109cfu/ml剂量的乳酸菌，阳性对照组给予异甘草酸镁，空白组和急性酒精模型组给予等体积的蒸馏水、连续30天，第27天灌胃1 小时后除空白组给予蒸馏水外，其他组均给予50％乙醇6.0g/kg.bw，连续3天以诱导急性酒精性脑损伤和胰腺组织损伤。最后一天眼球取血并处死小鼠。
[0047]
(1)每日测量小鼠体重，观察行为
[0048]
结果如图1所示，与正常组相比，对照组小鼠体重平均偏小，药物组和植物乳杆菌 hfy05组小鼠平均体重相差不大。正常组胰腺组织重量也平均偏大，植物乳杆菌hfy05 组胰腺组织重量平均偏小，对照和药物组相差不大。可以看出，除正常组外的其他组都对小鼠胰腺组织造成了伤害。
[0049]
(2)小鼠胰腺组织中ams、lps和小鼠脑组织中gaba水平测定
[0050]
①
解剖时称量胰脏重量，用生理盐水洗净肝脏、胰脏的血液，取部分用组织固定液固定；完整的取出脑组织并称重，取左脑或右脑放入组织固定液中。将所有样品送样进行切片制作。
[0051]
如图2所示，可以看出正常组胰腺细胞完整，细胞核排列整齐，结构清楚，分布均匀。对照组出现严重的胰腺细胞变性、细胞损伤、细胞核凝聚以及大量炎症细胞浸润。在药物组、植物乳杆菌hfy05组中，肝细胞变性减少，细胞核排列较整齐，损伤细胞较少、细胞核较为分散及轻微炎症细胞浸润。
[0052]
如图3所示，观察小鼠脑组织切片发现，肉眼观察结果可见组织展片良好，形态均匀完整，分布均匀紧凑。药物组、对照组和植物乳杆菌hfy05组细胞分布更分散，细胞核更明显，颜色更暗沉，细胞炎症更严重。
[0053]
②
解剖后的胰腺组织和脑组织采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒及说明书检测胰腺组织中淀粉酶(ams)、脂多糖(lps)、γ－氨基丁酸(gaba)水平测定。
[0054]
如图4所示，γ－氨基丁酸含量从大到小是药物组、植物乳杆菌hfy05组、对照组和正常组、由此可见正常组的脑神经是最放松的，药物组和植物乳杆菌hfy05组的γ－氨基丁酸相对来说是比较高的。由此可见，植物乳杆菌hfy05对乙醇诱导的小鼠脑组织损伤有缓解作用。
[0055]
小鼠胰腺组织中淀粉酶(ams)和细菌脂多糖(lps)水平如图5所示。小鼠胰腺组织中的淀粉酶含量从大到小为植物药物组、植物乳杆菌hfy05组、正常组和对照组，其中植物乳杆菌hfy05组和药物组的含量稍高。细菌脂多糖(英文名： lipopolysaccharide,lps)是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，是由脂质和多糖构成的物质(糖脂质)，有助于免疫系统的成熟和调节。小鼠胰腺损伤会导致细菌脂多糖含量增多，故如图所示药物组和植物乳杆菌hfy05组的细菌脂多糖的含量更多一点。由此可得植物乳杆菌hfy05对乙醇诱导的小鼠胰腺损伤有缓解作用。
[0056]
(3)血清细胞因子il-1β，il-6，il-10，tnf-α和ifn-γ水平测定
[0057]
根据上海酶联生物科技有限公司生产的白细胞介素-6(il-6)、白细胞介素-10(il
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10)、白细胞介素1β(il-1β)、肿瘤坏死因子-α(tnf-a)和干扰素-γ(ifn-γ)细胞因子检测试剂盒检测血清细胞因子水平。
[0058]
如图6所示，小鼠血清细胞因子il-1β，il-6，il-10，tnf-α和ifn-γ水平测定血结果显示：植物乳杆菌hfy05组的il-1β，il-6，il-10，tnf-α和ifn-γ水平分别为 10.3pg/ml、8.9pg/ml、22.6pg/ml、54.4pg/ml和71.3pg/ml。对照组il-1β，il-6，il
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10，tnf-α和ifn-γ水平显著高于正常组。而与对照组相比，植物乳杆菌hfy05组、正常组和药物组il-6、tnf-α和ifn-γ水平显著降低。
[0059]
(4)小鼠血清中adh，aldh，ast/got，alt/gpt，ins，ros，t-sod，cat， gsh，mda，t-cho和tg水平测定
[0060]
采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒及说明书检测血清中乙醇脱氢酶 (adh)、乙醛脱氢酶(aldh)、谷丙转氨酶(alt)、胰岛素(ins)、活性氧(ros)、总超氧化物歧化酶(t-sod)、过氧化氢酶(cat)、谷胱甘肽(gsh)、丙二醛(mda)总胆固醇(t-cho)和甘油三酯(tg)水平。
[0061]
结果如图7所示，小鼠血清中adh，aldh，ast/got，alt/gpt，ins，ros， t-sod，cat，gsh，mda，t-cho和tg水平测定结果显示：正常组小鼠血清中mda 和ast、alt、adh的水平在5组中最低，而sod、t-cho、gsh和cat的水平在 5组中相对较高。正常组小鼠sod、cat、gsh-px活性显著高于其他各组(p﹤0.05)，而no、mda含量显著低于其他各组(p﹤0.05)。酒精所致脑损伤和胰腺组织损伤(模型组)使小鼠血清中sod、cat、gsh-px活性降低，no、mda含量升高。植物乳杆菌 hfy05能有效抑制肝损伤所致血清中氧化相关酶(sod、cat、gsh-px)的降低，提高 no、mda含量。植物乳杆菌hfy05的效果优异，且与异甘草酸镁相似。
[0062]
实施例3小鼠胰腺组织中mrna表达测定(qpcr测定)
[0063]
小鼠胰腺组织在含有trizol
tm reagent(invitrogen,carlsbad,ca,usa)的匀浆器中粉碎，从组织中提取总rna。将提取的总rna稀释为1μg/μl。用逆转录酶试剂盒 (thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)对稀释后的总rna溶液进行1μl的逆转录，得到cdna模板。1μl cdna模板，10μl sybr绿色pcr反应混合液(thermo fisherscientific,waltham,ma,usa)，1μl的上游和下游引物(表3)和7μl无菌蒸馏水混合；反应在95℃预热
5min；95℃15s，55℃30s，72℃35s，40个循环。使用steponeplus 实时pcr系统(thermo fisher scientific,waltham,ma,usa)在95℃30s和55℃35s下测试结果。以gapdh为内标准，通过公式2-δδct
计算各目的基因的mrna相对表达量。
[0064]
表3 qpcr引物序列
[0065][0066][0067]
qpcr结果如图8所示，酒精降低了pi3k，irs，glut-4等基因表达。与对照组相比，植物乳杆菌hfy05可显著提升pi3k，irs，glut-4基因表达。表明植物乳杆菌hfy05对小鼠酒精性胰腺损伤和脑损伤有缓解作用。
[0068]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。