枳实提取物的应用、化妆品的制作方法

1.本发明涉及植物提取技术领域，更具体地说，涉及枳实提取物的应用、化妆品。


背景技术：

2.枳实，中药名，为芸香科植物酸橙citrus aurantium l.及其栽培变种或甜橙citrus sinensis osbeck的干燥幼果。5～6月收集自落的果实，除去杂质，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，较小者直接晒干或低温干燥。性味苦、辛、酸，微寒。归脾、胃经。具有破气消积，化痰散痞。用于积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通，痰滞气阻，胸痹，结胸，脏器下垂。目前，文献中报道枳实提取物具有改善胃肠道、抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗炎等方面的应用。
3.枳实提取物中的生物碱具有收缩血管、升高血压的作用，生物碱中最主要的物质辛弗林，具有强心、增加心血输出量、收缩血管、高总外周血管阻力而使左心室压力和动脉血压上升的作用、抗休克以及减肥的作用。目前枳实提取物在化妆品中的应用研究报道较少，没有相应的枳实提取物在抗压功效上的应用研究。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供枳实提取物的应用、化妆品，本发明的枳实提取物对压力指标皮质醇具有显著的抑制效果。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.枳实提取物在制备抑制细胞分泌皮质醇的产品中的应用。
7.在本发明中，上述枳实提取物的制备方法，包括：
8.用提取溶剂对枳实进行提取，提取的温度为60～80℃，料液比为1:(10～14)，提取的时间为30～90min。
9.在本发明中，所述提取溶剂为乙醇溶液或水；
10.所述乙醇溶液中，乙醇的体积分数为20％～80％；乙醇的体积分数优选为40％。
11.在本发明的一个实施例中，所述提取的温度为60℃，料液比为1:10，提取的时间为30min。
12.在本发明的一个实施例中，所述提取的温度为60℃，料液比为1:12，提取的时间为60min。
13.在本发明的一个实施例中，所述提取的温度为70℃，料液比为1:14，提取的时间为90min。
14.在本发明的一个实施例中，所述提取的温度为80℃，料液比为1:12，提取的时间为90min。
15.在本发明的一个实施例中，所述提取的温度为80℃，料液比为1:14，提取的时间为60min。
16.在本发明中，所述枳实优选为枳实药材；
17.在提取前，优选对枳实进行过筛处理；
18.所述过筛的目数优选为10目。
19.本发明优选用提取溶剂对枳实提取两次以上，合并每次获得的提取液；进一步优选为提取两次。
20.经过本发明的实验证明，枳实提取物的最佳提取条件为：提取的温度为80℃，料液比为1:14，提取的时间为60min，此时枳实提取物中的辛弗林的提取率为0.9821％。
21.在本发明中，所述细胞优选为皮肤细胞，进一步优选为人的皮肤细胞。细胞为角质形成的细胞。所述枳实提取物可作用于皮肤细胞的表皮层和真皮层。
22.在本发明中，所述枳实提取物以溶液的形式存在于上述产品中；枳实提取物溶液中，枳实提取物的浓度为0.02～2μg/ml，进一步优选为2μg/ml。
23.在本发明的一些实施例中，已证明0.02～2μg/ml的枳实提取物能够明显抑制hacat细胞分泌皮质醇。
24.在本发明中，所述枳实提取物中，辛弗林的含量为28～30μg/ml，优选为28.18μg/ml。
25.本发明还提供了化妆品，包括所述枳实提取物，以及化妆品上可接受的辅料。
26.在本发明中，所述枳实提取物的制备方法包括：
27.用提取溶剂对枳实进行提取，提取的温度为60～80℃，料液比为1:(10～14)，提取的时间为30～90min。
28.在本发明中，所述提取溶剂为乙醇溶液或水；
29.所述乙醇溶液中，乙醇的体积分数为20％～80％；乙醇的体积分数优选为40％；
30.提取的温度优选为80℃，料液比优选为1:14，提取的时间优选为60min；
31.所述枳实优选为枳实药材；
32.在提取前，优选对枳实进行过筛处理；
33.所述过筛的目数优选为10目。
34.本发明优选用提取溶剂对枳实提取两次以上，合并每次获得的提取液；进一步优选为提取两次。
35.本发明的化妆品优选为化妆水、乳液、肌底液、精华、面膜、防晒霜、面霜、眼霜、手霜或身体乳霜；面膜优选为贴片式面膜或涂抹式面膜；精华优选为精华水或精华油。
36.本发明的辅料为化妆品上可接受的辅料，优选为溶剂、增稠剂、保湿剂、成膜剂、脂质体、防腐剂、着色剂、ph调节剂和香精中的一种或多种；溶剂优选为水或醇类溶剂。
37.本发明的枳实提取物对压力指标皮质醇具有显著的抑制效果。经本发明的实施例证实，随枳实提取物的浓度升高，抗压效果越好。因此，本发明的枳实提取物后续可作为抗压活性成分广泛应用于各类化妆品中，缓解由工作压力、熬夜、电脑辐射以及负面情绪等引起的压力肌问题，由内而外的改善肤质，让肌肤重新饱满透亮。
38.本发明的枳实提取物制备方法工艺简单，无复杂仪器，辛弗林的提取率最高为0.9821％，活性物质提取效果较好，有利于节约工业应用成本。
附图说明
39.图1是本发明实施例中，枳实提取物的提取溶剂筛选结果图；
40.图2是本发明实施例中，枳实提取物对hacat细胞的cortisol转化量的影响图；
41.图3是本发明实施例中，枳实提取物对raw264.7细胞的炎症因子il-6的影响。
具体实施方式
42.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。本发明以下实施例所用的原料均为市售商品。
44.实施例1
45.设置不同溶剂(纯水、20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇、80％乙醇、无水乙醇)，取枳实药材1g，过10目筛，分别加入上述溶剂进行提取，提取温度60℃，料液比1:12，提取时间1h，提取2次，合并提取液，量取提取液体积，10倍稀释，过滤，进hplc分析辛弗林含量，筛选出最佳溶剂，结果如图1所示，由图1可知，在乙醇浓度为40％时，含量最高，因此选择40％乙醇作为后续实验溶剂。
46.取枳实药材1g，过10目筛，分别加入上述溶剂进行提取，提取温度60℃，料液比1:10，提取时间30min，提取2次，合并提取液，取1ml稀释10倍，过滤，进hplc分析辛弗林含量，辛弗林的提取率为0.7782％
47.实施例2
48.参照上述实验(1)中的提取步骤，将料液比设置为1：12，提取时间设置为60min，其余条件不变得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.7580％
49.实施例3
50.参照上述实验(1)中的提取步骤，将料液比设置为1：14，提取时间设置为90min，其余条件不变，得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.9480％
51.实施例4
52.参照上述实验(1)中的提取步骤，将提取温度设置为70℃，提取时间设置为60min，其余条件不变，得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.8676％
53.实施例5
54.参照上述实验(1)中的提取步骤，将提取温度设置为70℃，料液比设置为1：12，提取时间设置为90min，其余条件不变，得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.8898％
55.实施例6
56.参照上述实验(1)中的提取步骤，将提取温度设置为70℃，料液比设置为1：14，其余条件不变，得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.9485％
57.实施例7
58.参照上述实验(1)中的提取步骤，将提取温度设置为80℃，提取时间设置为90min，其余条件不变，得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.8885％
59.实施例8
60.参照上述实验(1)中的提取步骤，将提取温度设置为80℃，料液比设置为1：12，其
余条件不变，得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.9681％
61.实施例9
62.参照上述实验(1)中的提取步骤，将提取温度设置为80℃，料液比设置为1:14，提取时间设置为60min，其余条件不变，得到枳实提取物，其中，辛弗林的提取率为0.9821％，辛弗林在枳实提取物中的含量为28.18μg/ml，辛弗林在枳实提取物中的含量为28.18μg/ml。
63.实验例
64.1.枳实提取物(醇提)工艺验证
65.对上述实施例9进行3批验证实验。
[0066][0067]
由工艺验证实验结果可得，辛弗林浓度平均值为28.98μg/ml，与实施例9中的辛弗林浓度基本一致，平均提取率为1.0219％，与实施例9中的试验优化工艺结果基本一致，3批验证实验的rsd％值为2.84％，表明此提取工艺稳定。
[0068]
2.枳实提取物对压力指标皮质醇的影响
[0069]
2.1培养基及溶液配制
[0070]
(1)dmem完全培养基：向dmem培养基中加入fbs10％/双抗1％
[0071]
(2)lps：以1
×
pbs缓冲液为稀释液，配制1mg/ml的lps溶液
[0072]
2.2供试样品对hacat细胞分泌皮质醇(cortisol)的影响
[0073]
(1)细胞接种：将hacat细胞按10000个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h
[0074]
(2)实验分组：设置阴性对照组(nc)、激动剂阳性对照组、抑制剂阳性对照组(pc)和样品组。样品组中共设3个浓度梯度，各组均设2-6个复孔，样品组中的枳实提取物为上述实施例9提取的。
[0075]
(3)皮质醇转化反应：将50mm的cortisone溶液稀释至100μm，按50μl/孔加至孔板中，待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，加50μl/孔，共100μl/孔反应体系。阴性对照组加等量完全培养基，激动剂阳性对照组加100μm的cortisone 100μl/孔，抑制剂阳性对照组加200μm的metyrapone或bvt.2733 100μl/孔，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h后在显微镜下观察细胞形态。
[0076]
(4)取孔板中的上清，通过elisa法检测cortisol含量，操作步骤如下：
[0077]
a预先计算好所需的酶标条，实验前30min拿出试剂盒，恢复至室温
[0078]
b标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为200，100，50，12.5，0ng/ml
[0079]
c收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心(4℃，1000
×
g，20min)，取上清后，不需要检测样本
[0080]
d各反应孔中加入50μl标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，后向各反应孔中加入50μl生物素标记抗体工作液至反应孔，共100μl反应体系，于37℃孵箱孵育45min
[0081]
f弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μl洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次
[0082]
g各反应孔中加入100μl hrp标记链霉亲和素工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育30min
[0083]
h各反应孔中加入300μl洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次
[0084]
i各反应孔中加入90μl显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min左右
[0085]
j各反应孔中加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量od值，od值与cortisol含量成反比
[0086]
k根据标准品的已知浓度和所测od值计算标准曲线回归方程(r2》0.99)，将样品孔的od值代入计算所测样品的浓度，再乘稀释倍数即得到原样品的实际cortisol浓度，也可通过elisa calc软件回归拟合曲线，由y值计算x值得到样品试剂cortisol浓度。
[0087]
(5)统计分析：采用graphpad prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x
±
s表示，组间差异采用one-way anova分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义
[0088]
2.3elisa测试结果
[0089]
通过elisa检测各组压力指标cortisol含量，通过elisa calc软件回归拟合曲线根据实验结果得到标曲方程:y＝(a-d)/[1+(x/c)^b](a＝2.45750,b＝1.24243,c＝12.50668,d＝0.26975)，r2＝0.99991(横坐标x为样品cortisol含量，纵坐标y＝吸光度)，根据标曲的吸光度反推cortisol含量，其变化趋势如表所示。经cortisone转化后，阳性组cortisol含量较阴性组显著提高，实验结果如表1和图2所示；
[0090]
表1
[0091][0092]
2.4各样品测试结果
[0093]
(1)结果显示：与阳性组对比，枳实提取物样品在0.02-2ug/ml浓度范围内具有显著的降低cortisol转化量的效果，且随提取物浓度的提高抑制效率增强。与阳性药物对照组metyrapone(美替拉酮)对比，枳实提取物在0.02-2ug/ml浓度上对cortisol的抑制效果
均显著高于metyrapone(美替拉酮)，因此，枳实提取物在细胞解压效果上具有显著作用。
[0094]
注：metyrapone(美替拉酮)是一种有效且具有口服活性的11β-羟化酶(11β-hydroxylase)抑制剂，可抑制醛固酮(aldosterone)的产生，也是一种细胞自噬(autophagy)激活剂。metyrapone能抑制内源性肾上腺皮质激素的合成，也会影响行为和情绪。此外，metyrapone可通过下调mtor通路增加自噬过程的效率，也能与恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)细胞色素p-450(cyp450)相互作用。metyrapone可用于研究库兴氏综合征(cushing'ssyndrome)和抑郁症，对皮质醇的产生具有一定的抑制作用。
[0095]
3.枳实提取物对炎症指标il-6的影响
[0096]
3.1培养基及溶液配制
[0097]
(1)rpmi1640完全培养基：向rpmi1640培养基中加入fbs使其含量为10％
[0098]
(2)lps：以1
×
pbs缓冲液为稀释液，配制1mg/ml的lps溶液
[0099]
3.2供试样品对raw264.7细胞分泌il-6(白介素-6炎症因子)的影响
[0100]
(1)细胞接种：将raw264.7细胞按4500个/孔接种于96孔板，置于37℃，5％co2培养箱中培养24h
[0101]
(2)实验分组：设置阴性对照组(nc)、阳性对照组(pc)和样品组。样品组中共设3个浓度梯度，各组均设6个复孔，样品组中的枳实提取物为上述实施例9提取的。
[0102]
(3)lps诱导炎症反应：将1mg/ml的lps溶液稀释至3μg/ml，按50μl/孔加至孔板中，阴性对照组加等量培养基，置于37℃，5％co2培养箱中培养4h
[0103]
(4)待测样品稀释与加样：以完全培养基为稀释液，按照样品试验浓度表配制不同浓度的样品工作液，100μl/孔，阴性对照组和阳性对照组加等量完全培养基，置于37℃，5％co2培养箱内培养24h后在显微镜下观察细胞形态
[0104]
(5)取孔板中的上清，通过elisa法检测il-6含量，操作步骤如下：
[0105]
a预先计算好所需的酶标条，实验前30min拿出试剂盒，恢复至室温
[0106]
b标准品梯度稀释：用标准品&样品稀释液将标准品倍比稀释为500，250，125，62.5，0pg/ml
[0107]
c收集细胞培养上清液到无菌离心管中，离心(4℃，1000
×
g，20min)，取上清后，适当浓度稀释作为检测样本
[0108]
d各反应孔中加入100μl标准品工作液及检测样本，各组均设2个复孔，于37℃孵箱孵育90min
[0109]
e弃去液体，甩干，各反应孔中加入100μl生物素标记抗体工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育60min
[0110]
f弃去液体，甩干，各反应孔中加入300μl洗涤液，浸泡1-2min后甩干。重复4次
[0111]
g各反应孔中加入100μlhrp标记链霉亲和素工作液至反应孔中，于37℃孵箱孵育30min
[0112]
h各反应孔中加入300μl洗涤液，间隔30s，甩干洗涤液。重复4次
[0113]
i各反应孔中加入90μl显色剂至反应孔中，于37℃避光显色15min左右
[0114]
j各反应孔中加入50μl终止液，即刻用酶标仪450nm波长下测量od值
[0115]
k根据标准品的已知浓度和所测od值计算标准曲线回归方程(r2》0.99)，将样品孔的od值代入计算所测样品的浓度，再乘稀释倍数即得到原样品的实际tnf-α浓度
[0116]
(6)统计分析：采用graphpad prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，计量资料以x
±
s表示，组间差异采用one-way anova分析，以p＜0.05为差异具有统计学意义
[0117]
3.3elisa测试结果
[0118]
通过elisa检测各组炎症因子il-6含量，根据实验结果得到标曲y＝0.001x+0.0908，r2＝0.9986(横坐标x为样品il-6含量，纵坐标y＝吸光度)，根据标曲的吸光度反推il-6含量，其变化趋势如表2和图3所示。经lps诱导后，阳性组il-6含量较阴性组显著提高。
[0119]
表2
[0120][0121]
3.4各样品测试结果
[0122]
结果显示：与阳性组对比，枳实提取物样品在0.2-2ng/ml浓度范围内并不能显著降低炎症因子il-6的释放，因此，枳实提取物在细胞抗炎效果上并无显著作用。
[0123]
所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。