一种自组装多肽微球的微流控制备方法

1.本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种自组装多肽微球的微流控制备方法。


背景技术：

2.自组装多肽是一种亲水和疏水氨基酸交替出现的短肽片段，目前常作为功能性药物递送材料。自组装多肽可以在ph值接近其等电点的电解质溶液中迅速自发形成交联的纳米纤维，然后转化为三维纤维网络水凝胶。基于这一特点，将酶解底物序列，肿瘤靶向序列插入自组装多肽序列中即可形成一种具备酶反应性，肿瘤靶向性的控释材料。在载药材料的给药形式上，相对于散装凝胶或支架需要手术植入，可注射的微球更为方便且微创。而目前微球的制备方法上，传统的乳剂化学交联法固化微球存在结块和尺寸不均匀的缺陷，而且容易造成生物活性功能性药物的失活。
3.微流控技术可以便捷控制微米级液滴生成，是一种高效制备均一尺寸的水凝胶微球的有效方法。将可编辑的自组装多肽与微流控技术相结合，有利于形成智能功能性药物递送平台。然而，自组装多肽的自发交联决定了它不能利用微流控技术长期制备微球。因为它交联成凝胶后，会阻塞微流控通道，且很难长时间保持微球的形状。
4.因此，针对现有技术不足，提供一种自组装多肽微球的微流控制备方法以解决现有技术不足甚为必要。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种自组装多肽微球的微流控制备方法。该自组装多肽微球的微流控制备方法能长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，得到形状均一的微球。
6.本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
7.提供一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
8.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
9.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
10.所述水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。
11.所述油相溶液含有司班80和矿物油。
12.优选的，上述水相溶液的制备步骤包括如下：
13.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入去离子水中，搅拌，得到成胶前体水溶液；
14.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，过滤，静置后得到水相溶液。
15.优选的，上述油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置得到油相溶液。
16.优选的，上述步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
17.优选的，上述步骤a1具体为将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至50℃～70℃去离子水中，搅拌10min～50min，得到成胶前体水溶液。
18.优选的，上述步骤a2具体为将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1h～2h，得到水相溶液。
19.优选的，上述油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置0.5h～2h得到油相溶液。
20.在所述成胶前体水溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂的质量百分比为0.25～2.00:5.00～20.00:0.10～0.30。
21.所述功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为20mg/ml～500mg/ml。
22.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为1～2:8～10。
23.优选的，上述水相溶液与油相溶液相对压力值比20～100：70～140。
24.优选的，上述滤膜为0.22μm滤膜。
25.优选的，上述微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
26.优选的，上述自组装多肽为基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽、自组装kldl-12肽、自组装rada-16肽、自组装ieik-13肽、自组装kldl-12肽衍生物、自组装rada-16肽衍生物或者自组装ieik-13肽衍生物中至少一种。
27.优选的，上述光交联水凝胶为甲基丙烯酸酰化明胶冻干粉、甲基丙烯酰化透明质酸冻干粉、甲基丙烯酰化丝素蛋白冻干粉、甲基丙烯酰化硫酸软骨素冻干粉、甲基丙烯酰化丝胶蛋白冻干粉或者聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉中至少一种。
28.优选的，上述功能性药物为外泌体、载药脂质体或者高分子功能性药物中至少一种。
29.优选的，上述光引发剂为lap光引发剂。
30.优选的，上述自组装多肽微球的直径为50μm～200μm。
31.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，其中微流控制备方法的步骤如下：步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球；所述水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂；所述油相溶液含有司班80和矿物油。该微流控制备方法能长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，得到形状均一的微球。该自组装多肽微球具备自组装特性，能够在微流控芯片中自组装形成微球，而且能够实现治疗功能性药物长效缓释。
附图说明
32.利用附图对本发明作进一步的说明，但附图中的内容不构成对本发明的任何限制。
33.图1为本发明的一种自组装多肽微球的微流控制备方法制备图。
34.图2为自组装多肽的成胶点曲线。
35.图3为自组装多肽的剪切变稀曲线。
36.图4为实施例4-9自组装多肽微球粒径分布图。
37.图5为实施例4的自组装多肽微球的扫描电镜图。
38.图6为实施例4的自组装多肽微球流变学特征曲线图。
39.图7为实施例4自组装多肽微球的体外释放图片。
40.图8为应用实施例4自组装多肽微球的成熟成骨细胞的图片。
具体实施方式
41.结合以下实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
42.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均可自常规生化试剂商店或药品经营企业购买得到。其中，本发明的基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽、rada-16肽、rada-12肽、kldl-12肽衍生物、ieik-13肽衍生物购自上海波泰生物科技有限公司，基质金属蛋白酶1(简称mmp1酶)购自sigma公司。司班80和矿物油均购自sigma公司。甲基丙烯酸酐化明胶购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。甲基丙烯酰化透明质酸冻干粉、甲基丙烯酰化丝素蛋白冻干粉、甲基丙烯酰化硫酸软骨素冻干粉、甲基丙烯酰化丝胶蛋白冻干粉、聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉均购自苏州永沁泉智能设备有限公司。
43.实施例1。
44.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
45.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
46.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
47.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
48.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
49.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入去离子水中，搅拌，得到成胶前体水溶液；
50.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，过滤，静置后得到水相溶液。
51.更具体地，步骤a1具体为将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至50℃～70℃去离子水中，搅拌10min～50min，得到成胶前体水溶液。
52.更具体地，步骤a2具体为将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1h～2h，得到水相溶液。
53.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置得到油相溶液。
54.更具体地，油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置0.5h～2h得到油相溶液。
55.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，
得到自组装多肽微球。
56.在所述成胶前体水溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂的质量百分比为0.25～2.00:5.00～20.00:0.10～0.30。
57.所述功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为20mg/ml～500mg/ml。
58.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为1～2:8～10。水相溶液与油相溶液相对压力值比20～100：70～140。
59.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
60.自组装多肽为基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽、自组装kldl-12肽、自组装rada-16肽、自组装ieik-13肽、自组装kldl-12肽衍生物、自组装rada-16肽衍生物或者自组装ieik-13肽衍生物中至少一种。光交联水凝胶为甲基丙烯酸酰化明胶冻干粉、甲基丙烯酰化透明质酸冻干粉、甲基丙烯酰化丝素蛋白冻干粉、甲基丙烯酰化硫酸软骨素冻干粉、甲基丙烯酰化丝胶蛋白冻干粉或者聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉中至少一种。功能性药物为外泌体、载药脂质体或者高分子功能性药物中至少一种。光引发剂为lap光引发剂。
61.一种自组装多肽微球因具备自组装特性，所以能够在微流控芯片中自组装形成微球的骨架结构，而且能够长效缓释具备治疗功能的药物。
62.实施例2。
63.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
64.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
65.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
66.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
67.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
68.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至60℃去离子水中，搅拌30min，得到成胶前体水溶液。
69.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1.5h，得到水相溶液。
70.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1h得到油相溶液。
71.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
72.在所述成胶前体水溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.50～1.00:7.50～15.00:0.14～0.25。
73.所述功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为30mg/ml～300mg/ml。
74.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为1:9。水相溶液与油相溶液相对压力值比40～80：90～120。
75.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
76.自组装多肽为基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽、自组装kldl-12肽、自组装rada-16肽、自组装ieik-13肽、自组装kldl-12肽衍生物、自组装rada-16肽衍生物或者自组装ieik-13肽衍生物中至少一种。光交联水凝胶为甲基丙烯酸酰化明胶冻干粉、甲基丙烯酰化透明质酸冻干粉、甲基丙烯酰化丝素蛋白冻干粉、甲基丙烯酰化硫酸软骨素冻干粉、甲基丙烯酰化丝胶蛋白冻干粉或者聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉中至少一种。功能性药物为外泌体、载药脂质体或者高分子功能性药物中至少一种。光引发剂为lap光引发剂。
77.本发明的自组装多肽微球通过编辑自组装多肽结构，赋予微球复杂功能，包括但不限于酶响应性，温敏性，肿瘤靶向性，可用于组织工程及癌症治疗，有效促进了组织修复能力。
78.该微流控制备方法能长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，得到形状均一的微球。该自组装多肽微球具备自组装特性，能够在微流控芯片中自组装形成微球，而且能够实现治疗功能性药物长效缓释。
79.实施例3。
80.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
81.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
82.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
83.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
84.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
85.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至60℃去离子水中，搅拌30min，得到成胶前体水溶液。
86.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1.5h，得到水相溶液。
87.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1h得到油相溶液。
88.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
89.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.50～1.00:7.50～15.00:0.14～0.25。
90.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为50mg/ml～200mg/ml。
91.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为1:9。水相溶液与油相溶液相对压力值比40～80：90～120。
92.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
93.自组装多肽为基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽、自组装kldl-12肽、自组装rada-16肽、自组装ieik-13肽、自组装kldl-12肽衍生物、自组装rada-16肽衍生物或者自组装ieik-13肽衍生物中至少一种。光交联水凝胶为甲基丙烯酸酰化明胶冻干粉、甲基丙烯酰
化透明质酸冻干粉、甲基丙烯酰化丝素蛋白冻干粉、甲基丙烯酰化硫酸软骨素冻干粉、甲基丙烯酰化丝胶蛋白冻干粉或者聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉中至少一种。功能性药物为外泌体、载药脂质体或者高分子功能性药物中至少一种。光引发剂为lap光引发剂。
94.需要说明是，本发明的自组装kldl-12肽衍生物、自组装rada-16肽衍生物自组装ieik-13肽衍生物是指含有对应的功能性肽的系列物质。
95.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
96.实施例4。
97.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
98.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
99.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
100.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
101.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
102.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至50℃去离子水中，搅拌50min，得到成胶前体水溶液。
103.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置2h，得到水相溶液。
104.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1h得到油相溶液。
105.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
106.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.25:20.00:0.30。
107.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为0.1:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比20：70。
108.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
109.自组装多肽为基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽。光交联水凝胶为甲基丙烯酸酰化明胶冻干粉。功能性药物为载药脂质体。光引发剂为lap光引发剂。
110.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
111.实施例5。
112.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
113.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
114.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
115.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
116.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
117.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至70℃去离子水中，搅拌10min，得到成胶前体水溶液。
118.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1h，得到水相溶液。
119.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1h得到油相溶液。
120.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
121.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为2.00:5.00:0.10。
122.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为50mg/ml～200mg/ml。
123.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为2:10。水相溶液与油相溶液相对压力值比100：140。
124.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
125.自组装多肽为基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽，其氨基酸序列为kldlvpmsmrggkldl。光交联水凝胶为甲基丙烯酸酰化明胶冻干粉。功能性药物为高分子功能性药物。光引发剂为lap光引发剂。
126.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
127.实施例6。
128.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
129.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
130.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
131.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
132.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
133.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至65℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
134.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1，5h，得到水相溶液。
135.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
136.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应
管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
137.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.50:5.00:0.20。
138.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为50mg/ml。
139.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为2:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比70：100。
140.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
141.其中，自组装多肽为自组装kldl-12肽衍生物。光交联水凝胶为甲基丙烯酸酰化明胶冻干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
142.需要说明的是，本发明的甲基丙烯酰酸酯化明胶(gelma)是一种光敏性生物材料，具有生物相容性、可降解性、硬度以及促进细胞附着和生长的能力。gelma结构中含有甲基丙烯酰化取代基，这导致其可在光引发剂和紫外光条件下引发自由基聚合交联反应形成复杂的水凝胶三维网络。
143.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
144.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
145.实施例7。
146.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
147.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
148.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
149.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
150.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
151.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至65℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
152.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1，5h，得到水相溶液。
153.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
154.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
155.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为1.00:10.00:0.20。
156.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为100mg/ml。
157.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为2:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比70：100。
158.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
159.其中，自组装多肽为kldl-12肽衍生物。光交联水凝胶为甲基丙烯酰化透明质酸冻干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
160.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
161.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
162.实施例8。
163.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
164.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
165.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
166.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
167.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
168.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至65℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
169.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1，5h，得到水相溶液。
170.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
171.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
172.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.50:5.00:0.20。
173.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为150mg/ml。
174.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为2:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比70：100。
175.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
176.其中，自组装多肽为kldl-12肽衍生物。光交联水凝胶为甲基丙烯酰化丝素蛋白冻
干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
177.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
178.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
179.实施例9。
180.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
181.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
182.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
183.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
184.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
185.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至65℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
186.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1，5h，得到水相溶液。
187.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
188.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
189.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.75:5.00:0.30。
190.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为200mg/ml。
191.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为2:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比70：100。
192.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
193.其中，自组装多肽为rada-16肽。光交联水凝胶为甲基丙烯酰化丝胶蛋白冻干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
194.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
195.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
196.实施例10。
197.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
198.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
199.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
200.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
201.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
202.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至65℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
203.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1，5h，得到水相溶液。
204.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
205.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
206.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.75:10.00:0.30。
207.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为250mg/ml。
208.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为2:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比70：100。
209.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
210.其中，自组装多肽为rada-12肽衍生物。光交联水凝胶为甲基丙烯酰化丝胶蛋白冻干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
211.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
212.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
213.实施例11。
214.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
215.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
216.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
217.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
218.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
219.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至65℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
220.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1，5h，得到水相溶液。
221.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
222.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
223.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.75:20.00:0.20。
224.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为300mg/ml。
225.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为2:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比70：100。
226.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
227.其中，自组装多肽为ieik-13肽衍生物。光交联水凝胶为聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
228.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
229.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
230.实施例12。
231.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
232.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
233.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
234.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
235.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
236.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至63℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
237.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1.0h，得到水相溶液。
238.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
239.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
240.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为0.25:10.00:0.10。
241.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为30mg/ml。
242.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为0.5:9。水相溶液与油相溶液相对压力值比50：140。
243.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
244.其中，自组装多肽为自组装kldl-12肽。光交联水凝胶为聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
245.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
246.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
247.实施例13。
248.一种自组装多肽微球的微流控制备方法，步骤如下：
249.步骤(1)、分别制备水相溶液和油相溶液；
250.步骤(2)、将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，得到自组装多肽微球。
251.其中，水相溶液含有自组装多肽、光交联水凝胶、光引发剂和功能性药物。油相溶液含有司班80和矿物油。
252.本发明的水相溶液的制备步骤包括如下：
253.步骤a1、将自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂，分别加入预热至63℃去离子水中，搅拌45min，得到成胶前体水溶液。
254.步骤a2、将功能性药物与成胶前体水溶液混合，通过滤膜过滤，静置1.0h，得到水相溶液。
255.本发明的油相溶液的制备为将司班80加入到矿物油中混合，静置1.5h得到油相溶液。
256.其中，步骤(2)具体为将步骤(1)的水相溶液和油相溶液分别注入微流控芯片对应管道口，在芯片管道末端施加紫外光，调节水相溶液相对压力和油相溶液相对压力，然后通过气压的将水相溶液和油溶液相一起挤入微流控芯片的孔道，汇聚后形成“油包水”结构，得到自组装多肽微球。
257.在所述水相溶液中，自组装多肽、光交联水凝胶和光引发剂的质量百分比为1.25:15.00:0.20。
258.功能性药物在所述成胶前体水溶液中的浓度为500mg/ml。
259.在所述油相溶液中，司班80和矿物油的体积比为0.1:8。水相溶液与油相溶液相对压力值比100：80。
260.其中，滤膜为0.22μm滤膜；微流控芯片为流动聚焦管道微流控芯片。
261.其中，自组装多肽为自组装rada-16肽衍生物。光交联水凝胶为聚乙二醇二丙烯酸酯冻干粉。功能性药物为成骨诱导骨髓间充质干细胞外泌体。光引发剂为lap蓝光引发剂。
262.本发明的成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液的提取：选取处于对数生长期的间充质干细胞，然后对间充质干细胞进行7-14天的成骨分化诱导，在诱导过程中始终使用含10％(w/t)无外泌体血清的培养基，诱导完毕后收集细胞培养上清，采用差速离心法提取成骨分诱导间充质干细胞外泌体溶液。
263.经实验验证，本实施例的自组装多肽微球的微流控制备方法在实施例1范围中，能较好长时间及稳定地制备出自组装多肽微球，且得到的形状更加均一的微球。
264.实验及验证。
265.1、水相溶液性能测试
266.选用基质金属蛋白酶1敏感型自组装多肽(kldl-mmp1)，将200μg kldl-mmp1溶解于20μl去离子水中，配制成10mg/ml的原液，取20μl加入1.5ml的ep管中；加入180μl无菌蒸馏水，总共200μl溶液，吹打混匀获得多肽水凝胶。
267.通过将上述多肽水凝胶滴加到20毫米平行板上，用流变仪进行的成胶点以及剪切变稀特性的测试。在25℃室温下，以1hz的频率和1％的应变监测多肽水凝胶的凝胶化时间1小时，储存模量(g
′
)和损失模量(g
″
)的交点代表成胶点，如图2，其中多肽水凝胶的成胶点为25-30分钟。
268.同样使用流变仪在室温下，从0.1到100s-1
的剪切速率，测量上述多肽水凝胶的粘度和剪切应力，如图3。
269.实验结果表明，本发明的自组装多肽能够满足微流控芯片运行至少30分钟的时长，从而能长时间及稳定地制备出自组装多肽微球。而且本发明多肽水凝胶具备剪切变稀的特性，能够满足微流控芯片将水相挤入孔道的要求。
270.2、自组装多肽微球粒径实验
271.将实施例6-11制备得到的自组装多肽微球分别置于显微镜下观察，统计每个微球的粒径，如图4所示。
272.在图4中，可见实施例6-11所制备的自组装多肽微球的直径均在100μm～200μm范围内。
273.3、自组装多肽微球微观形态实验
274.将实施例6制备得到的自组装多肽微球在室温下风干过夜，随后使用镀金仪器给自组装多肽微球表面喷镀厚度为10纳米金箔。然后用电子扫描显微镜观察微球的微观形态，如图5所示。
275.在图5中，可见实施例6所制备的自组装多肽微球大小均一，表面光滑，且经过处理形态稳定，因此是良好的药物载体。
276.4、自组装多肽微球流变学性能实验
277.将实施例6-11制备得到的自组装多肽微球分别在室温下通过流变仪的动态扫频测试进行流变学特性的检测，测试频率范围为0.1rad/s～10rad/s。
278.所用的应变幅度是在线性粘弹性区域，由水凝胶微球样品的动态振幅扫频测试确定，频率为6.28rad/s，剪切振幅范围为0.1％～10％，得到图6。
279.可见本发明制备得到的自组装多肽微球力学性质稳定，不易发生波动，因此是良好的药物载体。
280.5、自组装多肽微球体外释放实验
281.将pkh67标记的外泌体在水相中混合，用实施例6的方法制备自组装多肽荧光微球。将2μl微球加入到2ml的模拟体液或含有0.7mg/ml mmp酶的模拟体液中，观察单个微球。
282.在0d、3d、6d、9d、12d和15d，用共聚焦激光扫描显微镜观察和跟踪每组的荧光，如图7，包裹于缓释微球中的外泌体释放速度较为较慢，直到第15天仍然有外泌体的释放，而处于含有mmp酶的模拟体液中的自组装多肽荧光微球快速降解，实现了酶响应性药物释放，具有极大的临床应用潜能。
283.从图7可见，本发明所制备的自组装多肽荧光微球能有效减缓外泌体在体外释放，具有延长外泌体半衰期的作用，并且能通过改变自组装多肽的序列，赋予材料递送体系更多的功能。
284.6、自组装多肽微球治疗应用验证实验
285.为了评价自组装多肽微球的治疗治疗潜能，利用实施例6制备的自组装多肽微球进行sd大鼠颅骨缺损模型的治疗，具体为：
286.将sd大鼠分为假手术组、外泌体治疗组和普通微球组，实施例6制备的自组装多肽微球组，除了假手术组都给予对应药物治疗。于给药后7天,14天各处死一半大鼠，收集大鼠颅骨样品。经过脱钙后将样品石蜡包埋并切片。切片经过脱蜡，水化，抗原修复，封闭。然后用抗骨钙素抗体作为一抗过夜孵育，二抗孵育1小时后使用dab显色，最后用苏木精复染，冲洗后进行脱水、透明、封片，最后用骨钙素识别新骨形成中的成熟成骨细胞，如图8。
287.其中假手术组是指仅切开颅部表层皮肤，不做骨缺损；外泌体治疗组则仅使用实施例6所搭载的外泌体进行注射；普通微球组为不含外泌体的实施例6微球。普通微球的制备方法与实施例6相同，区别仅水相中不加入外泌体。
288.实验结果表明被微球包裹并缓释的干细胞来源的外泌体，可以更好的促进骨组织的修复，存在更多的成熟骨细胞，也就是说本发明得到的自组装多肽微球能有效促进骨修复。
289.最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。