一种藠头植物外泌体的制备方法及应用与流程

1.本发明涉及外泌体类生物制剂技术领域，尤其涉及一种藠头植物外泌体的制备方法及应用。


背景技术：

2.外泌体是由细胞分泌而来的纳米级小囊泡，具有磷脂双分子层结构，内含dna、小rna、蛋白质等物质，携带蛋白质和核酸，参与细胞间的通讯。外泌体是作为天然的胞间信息载体，分子结构较小且生物相容性好，具有将其开发成具有治疗效果的生物制剂或者药物的潜能。
3.1983年，在绵羊网织红细胞中首次发现了外泌体，动物细胞外囊泡通过其特定的蛋白质标记和来源被分为外泌体、微囊泡和凋亡小体，目前对于动物来源的外泌体的研究已较成熟。目前研究发现了植物分泌外泌体，同时用透射电子显微镜得到了关于植物外泌体的部分数据。植物外泌体的直径约40～150nm，与动物外泌体形态结构相类似，具有磷脂双分子层结构，是由大多数细胞分泌的纳米级小囊泡，呈茶托状或杯状，由大量脂质、包括微小rna和蛋白质组成，植物细胞外囊泡目前研究较缺乏，相关的具体机制仍不明确。
4.腱骨结合部位于肌腱和骨之间，是力学过渡的关键结构，但是腱骨结合部由于组织结构复杂，损伤后难以恢复到正常组织结构和正常功能。特别是，在前叉、后叉韧带损伤后的手术治疗中通常会以肌腱替代韧带，并通过构建骨髓道将肌腱与骨连接起来，替代韧带作用，但是肌腱与骨髓道之间的愈合困难。因此，如何促进早期腱骨愈合强度是急需解决的关键问题，目前尚缺少具有上述功能且具有良好生物相容性和生物利用度的药物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种藠头植物外泌体的制备方法及应用，旨在解决缺少具促进腱骨愈合功能且具有良好生物相容性的药物的问题。
6.为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种藠头植物外泌体的制备方法，包括以下步骤：
7.将藠头榨汁后过滤，得到藠头原液；
8.对所述藠头原液进行离心提取，得到外泌体；
9.使用蔗糖垫法对所述外泌体进行纯化，得到藠头外泌体。
10.其中，所述将藠头榨汁后过滤，得到藠头原液的具体方式为：
11.将2.5斤藠头洗净去皮后与切片器械一起通过酒精消毒；
12.将消毒后的藠头通过消毒后的所述切片器械切成小块；
13.在切成小块的藠头中加入pbs后榨汁，得到榨汁液；
14.使用无菌纱布对所述榨汁液进行过滤，得到藠头原液。
15.其中，所述对所述藠头原液进行离心提取，得到外泌体的具体方式为：
16.将所述藠头原液取出进行预处理后移动至离心管内进行离心10min，得到第一离
心液；
17.将所述第一离心液的上清液移至新的离心管中再次离心30min，得到第二离心液；
18.将所述的第二离心液的上清取出进行过滤，得到过滤液；
19.将所述过滤液移至新的离心管中离心70min，得到第三离心液；
20.去除所述第三离心液的上清进行重悬后离心70min，得到第四离心液；
21.去除所述第四离心液的上清，再次进行重悬，得到外泌体。
22.其中，所述使用蔗糖垫法对所述外泌体进行纯化，得到藠头外泌体的具体方式为：
23.用预冷的1
×
pbs将外泌体的体积补至1ml，得到混合液；
24.将所述混合液加到蔗糖垫离心70min；
25.取出250μl位于下层30％的蔗糖垫，再次离心70min，去除上清沉淀后进行重悬，得到藠头外泌体。
26.第二方面，一种藠头植物外泌体的应用，采用于权利要求1-4中所述的一种藠头植物外泌体的制备方法，
27.所述藠头外泌体应用于预防和缓解骨质疏松及促进腱骨愈合的药物中。
28.本发明的一种藠头植物外泌体的制备方法及应用，将藠头榨汁后过滤，得到藠头原液；对所述藠头原液进行离心提取，得到外泌体；使用蔗糖垫法对所述外泌体进行纯化，得到藠头外泌体，本方案使用新鲜藠头榨汁获得藠头原液，并通过梯度超速离心的方法获取外泌体，上述外泌体具有有效促进腱骨愈合以及促进成骨的作用，从而解决缺少具促进腱骨愈合功能且具有良好生物相容性的药物的问题。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明提供的一种藠头植物外泌体的制备方法的流程图。
31.图2是chon-exos的电镜图片。
32.图3是chon-exos的大小分布图。
33.图4是体外实验细胞茜素红染色实验对照组结果图。
34.图5是体外实验细胞茜素红染色实验实验组结果图。
35.图6是小鼠腱骨愈合模型手术中的取肌腱的示意图。
36.图7是小鼠腱骨愈合模型手术中的植入肌腱示意图。
37.图8是microct实验结果图。
38.图9是显示腱骨愈合骨髓道模型成骨效果。
39.图10是对照组番红o固绿染色示意图。
40.图11是实验组番红o固绿染色示意图。
具体实施方式
41.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终
相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
42.请参阅图1-图3，第一方面，本发明提供一种藠头植物外泌体的制备及鉴定方法包括以下步骤：
43.s1将藠头榨汁后过滤，得到藠头原液；
44.s11将2.5斤藠头洗净去皮后与切片器械一起通过酒精消毒；
45.具体的，2.5斤藠头洗净去皮，和所有器械一起酒精消毒。
46.s12将消毒后的藠头通过消毒后的所述切片器械切成小块；
47.具体的，超净台中进行，将藠头切成小块。
48.s13在切成小块的藠头中加入pbs后榨汁，得到榨汁液；
49.具体的加入适量pbs后榨汁，得到500ml左右榨汁液。
50.s14使用无菌纱布对所述榨汁液进行过滤，得到藠头原液。
51.具体的，500ml左右榨汁液，经无菌纱布过滤得到藠头原液。
52.s2对所述藠头原液进行离心提取，得到外泌体；
53.s21将所述藠头原液取出进行预处理后移动至离心管内进行离心10min，得到第一离心液；
54.具体的，样本取出进行预处理，将样本移动至一个新的离心管内，2000
×
g，4℃，10min离心。
55.s22将所述第一离心液的上清液移至新的离心管中再次离心30min，得到第二离心液；
56.具体的，小心的将上清液移至新的离心管中，10，000
×
g，4℃，30min再次离心。
57.s23将所述的第二离心液的上清取出进行过滤，得到过滤液；
58.具体的，取上清，经0.45μm滤膜过滤，收集过滤液。
59.s24将所述过滤液移至新的离心管中离心70min，得到第三离心液；
60.具体的，将过滤液移至新的离心管中，选择超速转子，4℃，100，000
×
g离心70min。
61.s25去除所述第三离心液的上清进行重悬后离心70min，得到第四离心液；
62.具体的，去除上清，用10ml预冷的1
×
pbs重悬后，选择超速转子，再次4℃，100，000
×
g，超速离心70min，得到所述第四离心液。
63.s26去除所述第四离心液的上清，再次进行重悬，得到外泌体。
64.具体的，去除上清，用200μl预冷的1
×
pbs重悬，得到所述藠头外泌体。
65.s3使用蔗糖垫法对所述外泌体进行纯化，得到藠头外泌体。
66.s31用预冷的1
×
pbs将外泌体的体积补至1ml，得到混合液；
67.具体的，用预冷的1
×
pbs将外泌体体积补至1ml，得到所述混合液。
68.s31将所述混合液加到蔗糖垫离心70min；
69.具体的，将1ml外泌体样本缓慢加到250μl30％蔗糖垫(重水配制)上，100，000
×
g离心70min。
70.s32取出250μl位于下层30％的蔗糖垫，再次离心70min，去除上清沉淀后进行重悬，得到藠头外泌体。
71.具体的，取出250μl位于下层的30％蔗糖垫，用pbs稀释至3ml，100，000
×
g离心
70min，去上清，沉淀用200μl预冷pbs重悬，取20μl电镜检测，10μl粒径检测，10μl提蛋白检测，10μl无菌检测，剩余外泌体于-80℃保存。
72.请参阅图4-图9，第二方面，一种藠头植物外泌体的应用，采用于权利要求1-4中所述的一种藠头植物外泌体的制备方法，
73.所述藠头外泌体应用于预防和缓解骨质疏松及促进腱骨愈合的药物中。
74.具体的，本案首次发现了藠头外泌体具有成骨及促进腱骨愈合的作用。外泌体药物相对于传统药物具有显著优势，其体现在：外泌体是作为天然的胞间信息载体，分子结构较小且生物相容性好；相对于普通药物，外泌体的生物利用度高且靶向性好。本方案研发的促进腱骨愈合和促进成骨的藠头外泌体类生物制剂，具有理想的应用前景。
75.有益效果：
76.本方案使用新鲜藠头榨汁获得藠头原液，并通过梯度超速离心的方法获取外泌体，上述外泌体具有有效促进腱骨愈合以及促进成骨的作用。该外泌体可以作为一种促进腱骨愈合和预防骨质疏松的生物制剂应用于医疗实践中。
77.一、构建腱骨愈合模型
78.构建骨髓道：0.5％的戊巴比妥钠麻醉小鼠，然后将足后肢跟腱前方皮肤切开，显露并游离跖肌腱，将取下的跖肌腱放在藠头外泌体溶液中保存。然后在后肢膝盖前方做纵切口，用1ml的注射器针头垂直于胫骨轴，从胫骨干近端前内侧向后外侧钻孔，构建骨髓道，将前期剥离的跖肌腱植入其中，植入前骨髓道中注射50ul藠头外泌体。对照组将外泌体替换为pbs。
79.药物治疗：每周每只小鼠腹腔注射2次藠头外泌体，每只每周500ug。对照组注射等量pbs溶液。
80.一、组织切片染色实验
81.造模后28天，收集胫骨样本，用4％多聚甲醛固定48小时，然后用edta脱钙液脱钙10天，并制作石蜡切片。
82.番红固绿染色：通过番红固绿染色观察骨小梁面积，用0.1％番红溶液浸泡3min，然后在0.1％固绿溶液中浸泡10秒，然后用1％醋酸溶液分色，洗去多余溶液后封片观察。
83.microct实验
84.造模后28天，收集胫骨样本，用4％多聚甲醛固定24小时后拍摄胫骨microct，进行相关分析。
85.以上所揭露的仅为本发明一种藠头植物外泌体的制备方法及应用较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，本领域普通技术人员可以理解实现上述实施例的全部或部分流程，并依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于发明所涵盖的范围。