一种靶向膀胱癌的MRI对比剂及其制备方法和应用

一种靶向膀胱癌的mri对比剂及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及生物试剂领域，特别是涉及一种靶向膀胱癌的mri对比剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.膀胱癌是全球第11位最常见的癌症。在疾病的早期诊断膀胱原位癌具有重要价值，因为未经治疗的患者肌肉侵犯的风险高达80％，疾病特异性死亡率可达60％。然而，原位癌的检测仍然是临床工作中的一个挑战。传统的膀胱癌诊断方式是膀胱镜检查，但由于膀胱原位癌通常难以与炎症区分开来，或者根本不可见，从而导致膀胱镜检查和镜下切除时的误诊。
3.无创检测是诊断膀胱癌的理想方法，mri则被认为是膀胱癌诊断中最准确的无创方式。然而，根据eau的指南，原位癌的诊断不能仅靠mri完成。传统的mri由于信噪比的限制使得其在膀胱癌分期诊断的准确度不足。弥散加权成像(dwi)可在膀胱癌和正常组织之间提供出色的对比度。然而，dwi的体素尺寸范围为1.5-2.0mm，很难识别出膀胱原位癌。对比增强mri拥有更好的空间分辨率，但传统的mri对比剂缺乏肿瘤特异性，正常组织在临床成像中也会得到增强。针对非肿瘤组织增强成像的问题，已有许多研究设计了肿瘤特异性靶向的对比剂，在传统对比剂的基础上嵌合抗体、小分子药物、多肽和核酸适体等靶向分子可以在减少剂量的情况下实现肿瘤富集的效应，提升肿瘤辨识度和成像时间的同时又可以降低毒性。值得注意的是，目前还未有针对膀胱癌的靶向对比剂。
4.另外，由于商业化的gd基造影剂会随尿液排出，在注射对比剂后不久膀胱就会充满对比剂并持续一段时间，导致检测小或扁平病灶的时间窗狭窄，限制了重复注射对比剂以提高cis信噪比的可行性。此外，在随访期间重复使用mri造影剂也有可能导致肾源性系统性纤维化。
5.核酸适体(aptamer)是一类能特异性与靶标结合的寡核苷酸片段，在生化传感、药物开发等多方面具有潜在应用。相较于其他的靶向分子，核酸适体由于其易修饰、高特异性、高组织渗透性的特性被广泛应用于靶向对比剂的设计。然而，目前还未报道过核酸适体对比剂在膀胱癌靶向成像中的应用。主要在于核酸适体对比剂存在半衰期短和易降解的固有弊端。常规的策略通过将核酸适体修饰在纳米材料表面的方式来提升其在体内的分布，但这无疑会增加对比剂合成的成本和难度，同时纳米材料本身存在许多活体应用的弊端。因此，开发更为安全高效的核酸适体对比剂对于膀胱癌的靶向成像及原位癌的诊断具有重要的临床价值。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种靶向膀胱癌的mri对比剂及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该mri对比剂合成简单高效，通过膀胱灌注方式避免了核酸适体循环降解的问题，提升肿瘤靶向结合的效果，减少背景的干扰，可以实现低成本高效早期诊
断膀胱癌的目的。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种靶向膀胱癌的mri对比剂，所述靶向膀胱癌的mri对比剂是以核酸适体作为靶向分子，与磁共振顺磁性钆偶联而成；其中，所述核酸适体特异性靶向膀胱癌高表达蛋白，所述磁共振顺磁性钆以大环配体为载体。
9.优选的是，所述膀胱癌高表达的蛋白包括epcam、pd-l1和her2。当然，本发明膀胱癌高表达的蛋白不限于此。
10.优选的是，靶向所述膀胱癌高表达的蛋白的核酸适体包括syl3c、mj5c和2-2(t)；其中，所述syl3c的核苷酸序列为：5
′‑
cactacagaggttgcgtctgtcccacgttgtcatggggggttggcctg-3
′
，seq id no:1；所述mj5c的核苷酸序列为：5
’‑
tacaggttctggggggtgggtggggaacctgtt-3’，seq id no:2；所述2-2(t)的核苷酸序列为：5
’‑
gcagcggtgtgggggcagcggtgtgggggcagcggtgtgggg-3’，seq id no:3。本发明可以针对选择的膀胱癌高表达的蛋白更换靶向分子，实现本发明的合成策略，并获取相应的技术效果。
11.本发明还提供一种所述的靶向膀胱癌的mri对比剂的制备方法，包括以下步骤：
12.(1)核酸适体syl3c的5’端用dbco修饰后，与大环配体-叠氮在室温下进行点击化学反应，获取中间物；
13.(2)将中间物与gdcl3混合于naac-hac缓冲溶液中，水浴加热反应，获取靶向膀胱癌的mri对比剂。
14.上述制备方法的反应式如图1所示。
15.优选的是，步骤(1)中，5’端用dbco修饰核酸适体syl3c与大环配体-叠氮的摩尔比为1:(12-25)；反应条件为：150-200rpm反应8-12h。
16.优选的是，步骤(1)中，点击化学反应完成后，还包括过滤纯化，去除过量大环配体-叠氮的步骤。
17.优选的是，步骤(2)中，中间物与gdcl3的摩尔比为1:(3-6)，所述中间物的浓度为100μm。
18.优选的是，步骤(2)中，水浴条件为：80℃水浴加热反应3-6h。
19.更优选的是，水浴反应完成后，还包括如下步骤：将反应液加入95％乙醇-氯化钠饱和溶液中析出产物，离心富集析出的沉淀，再用超纯水溶解所述沉淀后透析，冷冻干燥透析液，得到所述靶向膀胱癌的mri对比剂。
20.本发明还提供所述的靶向膀胱癌的mri对比剂在提升膀胱癌成像效果方面的应用。
21.优选的是，所述靶向膀胱癌的mri对比剂采用膀胱灌注方式进行早期原位膀胱癌诊断。
22.本发明公开了以下技术效果：
23.本发明公开的靶向膀胱癌的mri对比剂，由于核酸适配体的高特异性和高亲和力，使得该mri对比剂syl3c-gd(iii)-dota拥有良好的膀胱癌靶向性，检测灵敏度显著高于现在的临床mri检测方案，有望应用于后续的早期原位膀胱癌的临床诊断。
24.本发明还公开了一种简易的靶向膀胱癌的mri对比剂的合成方法，通过点击化学将核酸适体与对比剂偶联，简单高效，合成效率高达97％。常用的核酸适体对比剂通常需要
偶联纳米材料，加大合成难度和成本的同时又会带来潜在的毒副风险。
25.本发明还公开了靶向膀胱癌的mri对比剂的用途，具体用于膀胱癌成像的给药策略，通过静脉注射核酸适体对比剂的方案存在易降解，半衰期短，剂量大的问题。本发明采用膀胱灌注可以避免核酸适体循环降解的问题，提升肿瘤靶向结合的效果，同时膀胱内灌洗操作还可除去游离未结合的对比剂从而减少背景的干扰。此外，膀胱灌注所需对比剂剂量较小，并且不易于进入全身组织分布，降低成本的同时又可以减轻毒副作用的风险。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为核酸适体对比剂合成示意图；
28.图2为syl3c-gd(iii)-dota的质谱结果图；
29.图3为syl3c-gd(iii)-dota与膀胱癌细胞结合的激光共聚焦荧光成像图；
30.图4为syl3c-gd(iii)-dota用于小鼠膀胱癌的活体mri成像；
31.图5为syl3c-gd(iii)-dota膀胱灌注后的组织残留；
32.图6为mj5c-gd(iii)-dota和2-2(t)-gd(iii)-dota注射前后小鼠膀胱癌的活体mri成像比对结果。
具体实施方式
33.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
34.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
35.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
36.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
37.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
38.实施例1膀胱癌靶向的mri对比剂合成(合成方法示意图见图1)。
39.(1)针对膀胱癌细胞高表达的靶标蛋白进行核酸适体的结合测试，筛选出高亲和力的核酸适体，本发明以膀胱癌组织高表达的上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)为例，选用高亲和力的核酸适体syl3c作为靶向分子，由上海生工生物有限公司合成5’端修饰有dbco的syl3c，序列为：5
′‑
cac tac aga ggt tgc gtc tgt ccc acg ttg tca tgg ggg gtt ggc ctg-3
′
。
40.(2)通过叠氮基团与dbco之间的点击化学反应，将dbco-syl3c与大环配体-叠氮(dota-n3)以1:12的摩尔比在室温下进行连接，150rpm振荡反应8h后，用3kd的超滤管进行离心纯化，除去过量的dota-n3，并收集syl3c-dota。
41.(3)将100μm syl3c-dota与gdcl3以1:3的摩尔比混合于naac-hac缓冲溶液(ph5.5)中，80℃水浴加热反应3h。
42.(4)反应后的溶液加入到95％乙醇-氯化钠饱和溶液中，于-80℃冰箱中过夜以析出syl3c-gd(iii)-dota，次日10000rpm离心富集析出的产物。沉淀用超纯水溶解后再通过1000da的透析袋透析除去残留的gdcl3，透析后的溶液冷冻干燥制得syl3c-gd(iii)-dota粉末。
43.合成好的syl3c-gd(iii)-dota用lc-ms验证分子量大小，目标分子量为17493.5da，纯度约为96.4％。以电感耦合等离子体质谱检测gd(iii)的浓度，每个syl3c-gd(iii)-dota偶联物含1个gd(iii)。
44.(5)合成好的对比剂粉末用5mm mgcl2的dpbs溶液稀释至1μm的终浓度即可用于活体成像。
45.(6)活体成像前用荧光共聚焦成像验证syl3c-gd(iii)-dota与膀胱癌的靶向结合。
46.200nm修饰了cy3荧光染料的偶联体与epcam高表达的ht1376膀胱癌细胞在室温孵育30min后进行荧光共聚焦成像，可见细胞膜表面出现特异性结合的荧光，结合效果与同等条件的gd非偶联的aptamer无明显差异，表明对比剂分子的偶联不影响核酸适体的靶向性。
47.(7)体外表征aptamer的偶联对gd(iii)的弛豫影响
48.装有同样gd(iii)浓度的偶联分子与商业对比剂钆喷酸葡胺的ep管进行t
1-mri成像并分析弛豫时间，两者弛豫时间相当，表明aptamer的偶联对gd(iii)的弛豫无明显影响。
49.实施例2膀胱癌靶向的mri对比剂合成
50.(1)针对膀胱癌细胞高表达的靶标蛋白进行核酸适体的结合测试，筛选出高亲和力的核酸适体，本发明以膀胱癌组织高表达的上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)为例，选用高亲和力的核酸适体syl3c作为靶向分子，合成5’端修饰有dbco的syl3c。
51.(2)通过叠氮基团与dbco之间的点击化学反应，将dbco-syl3c与大环配体-叠氮(dota-n3)以1:20的摩尔比在室温下进行连接，180rpm振荡反应12h后，用3kd的超滤管进行离心纯化，除去过量的dota-n3，并收集syl3c-dota。
52.(3)将100μm syl3c-dota与gdcl3以1:5的摩尔比混合于naac-hac缓冲溶液(ph5.5)中，80℃水浴加热反应4h。
53.(4)反应后的溶液加入到95％乙醇-氯化钠饱和溶液中，于-80℃冰箱中过夜以析出syl3c-gd(iii)-dota，次日10000rpm离心富集析出的产物。沉淀用超纯水溶解后再通过
1000da的透析袋透析除去残留的gdcl3，透析后的溶液冷冻干燥制得syl3c-gd(iii)-dota粉末。
54.合成好的syl3c-gd(iii)-dota用质谱验证分子量大小，目标分子量为17493.5da，纯度约为97％，见图2。以电感耦合等离子体质谱检测gd(iii)的浓度，每个syl3c-gd(iii)-dota偶联物含1个gd(iii)。
55.(5)合成好的对比剂粉末用5mm mgcl2的dpbs溶液稀释至1μm的终浓度即可用于活体成像。
56.(6)活体成像前用荧光共聚焦成像验证syl3c-gd(iii)-dota与膀胱癌的靶向结合。
57.200nm修饰了cy3荧光染料的偶联体与epcam高表达的ht1376膀胱癌细胞在室温孵育30min后进行荧光共聚焦成像，可见细胞膜表面出现特异性结合的荧光，结合效果与同等条件的gd非偶联的aptamer无明显差异，表明对比剂分子的偶联不影响核酸适体的靶向性，见图3。
58.(7)体外表征aptamer的偶联对gd(iii)的弛豫影响
59.装有同样gd(iii)浓度的偶联分子与商业对比剂钆喷酸葡胺的ep管进行t
1-mri成像并分析弛豫时间，两者弛豫时间相当，表明aptamer的偶联对gd(iii)的弛豫无明显影响。
60.实施例3膀胱癌靶向的mri对比剂合成
61.(1)针对膀胱癌细胞高表达的靶标蛋白进行核酸适体的结合测试，筛选出高亲和力的核酸适体，本发明以膀胱癌组织高表达的上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，epcam)为例，选用高亲和力的核酸适体syl3c作为靶向分子，合成5’端修饰有dbco的syl3c。
62.(2)通过叠氮基团与dbco之间的点击化学反应，将dbco-syl3c与大环配体-叠氮(dota-n3)以1:25的摩尔比在室温下进行连接，200rpm振荡反应12h后，用3kd的超滤管进行离心纯化，除去过量的dota-n3，并收集syl3c-dota。
63.(3)将100μm syl3c-dota与gdcl3以1:6的摩尔比混合于naac-hac缓冲溶液(ph5.5)中，80℃水浴加热反应6h。
64.(4)反应后的溶液加入到95％乙醇-氯化钠饱和溶液中，于-80℃冰箱中过夜以析出syl3c-gd(iii)-dota，次日10000rpm离心富集析出的产物。沉淀用超纯水溶解后再通过1000da的透析袋透析除去残留的gdcl3，透析后的溶液冷冻干燥制得syl3c-gd(iii)-dota粉末。
65.合成好的syl3c-gd(iii)-dota用质谱验证分子量大小，目标分子量为17493.5da，纯度约为95.9％。以电感耦合等离子体质谱检测gd(iii)的浓度，每个syl3c-gd(iii)-dota偶联物含1个gd(iii)。
66.(5)合成好的对比剂粉末用5mm mgcl2的dpbs溶液稀释至1μm的终浓度即可用于活体成像。
67.(6)活体成像前用荧光共聚焦成像验证syl3c-gd(iii)-dota与膀胱癌的靶向结合。
68.200nm修饰了cy3荧光染料的偶联体与epcam高表达的ht1376膀胱癌细胞在室温孵育30min后进行荧光共聚焦成像，可见细胞膜表面出现特异性结合的荧光，结合效果与同等
条件的gd非偶联的aptamer无明显差异，表明对比剂分子的偶联不影响核酸适体的靶向性。
69.(7)体外表征aptamer的偶联对gd(iii)的弛豫影响
70.装有同样gd(iii)浓度的偶联分子与商业对比剂钆喷酸葡胺的ep管进行t
1-mri成像并分析弛豫时间，两者弛豫时间相当，表明aptamer的偶联对gd(iii)的弛豫无明显影响。
71.实施例4核酸适体偶联的mri对比剂经膀胱灌注成像
72.1、小鼠膀胱癌模型的制备
73.注射麻醉剂待裸鼠进入深度麻醉期摆置仰卧位，腹部靠下部分消毒后用眼科剪剪开一个1.0cm的纵行切口，暴露肌肉层，然后在肌肉上剪开一个约1.0cm的小口，可观察到一脂肪垫，用一眼科弯镊夹取脂肪组织，深处可观察到膀胱；用另一眼科弯镊轻轻夹住膀胱，置于脂肪组织之上。调整好进针角度，用注射器(事先吸好20μl细胞悬液，细胞量为1
×
106)，轻挑起膀胱包膜，缓慢向里进针，确保针尖全部进入薄膜后，再缓慢推注细胞悬液，推注完毕，轻快抽出针头，可多点接种。用医用缝合线缝合腹壁肌肉层和皮肤层，将小鼠放置于加热垫上，待小鼠苏醒后回笼。接种后需培养3天等待成瘤。
74.2、将荷人膀胱癌裸鼠模型(n＝5)用于mri实验
75.小鼠麻醉后用导尿管先引流原有尿液，待排空原有尿液，再进行药物(以实施例2为例)灌注。每只控制灌注量100μl(注意尽量避免输尿管逆流，放缓注射速度，死腔的药品可加少量dpbs注入，但需尽量避免药品浓度被稀释)。
76.3、灌注药品后静置20min后再将药品进行引流。用等体积dpbs进行冲洗后引流，重复2遍。
77.4、冲洗完毕即可进行mri成像，每隔3min进行一次mri成像。尽量收集全膀胱的mri信号，分别收集dwi、t1、t2序列的信号。
78.如图4所示，在t1序列成像中，未种瘤的小鼠进行syl3c-gd(iii)-dota灌注后成像未见明显的膀胱壁高信号，膀胱整体呈现低信号，表明syl3c-gd(iii)-dota无明显的非特异性吸附。不带靶向性的random-gd(iii)-dota组同样未见肿瘤部位的高信号，而syl3c-gd(iii)-dota组则在肿瘤部位有明显的高信号，大小约1-2mm，信号持续时间达20min，表明syl3c-gd(iii)-dota能特异性的结合活体的膀胱癌组织。商业化对比剂钆喷酸葡胺处理组则显示整个膀胱壁的高亮信号，膀胱原位肿瘤区域难以与正常膀胱壁组织区分。综上，syl3c-gd(iii)-dota在膀胱癌的成像方面具有高特异性，高灵明度，高信噪比的特征，成像时间窗长，是膀胱原位癌mri成像分析的有力工具。
79.5、对比剂的组织残留分析
80.待完成mri信号收集后，分别取膀胱对比剂灌注后15min、30min、60min的小鼠重要器官，经组织消解后用icp-ms测定组织中的gd(iii)浓度。
81.如图5所示，syl3c-gd(iii)-dota灌注后15min小鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉和血液中均未见明显的gd(iii)残留，gd(iii)主要聚集在膀胱中，少量随尿液代谢。表明syl3c-gd(iii)-dota无明显的脱靶效应，生物安全性良好。
82.上述实验结果可见，本发明将核酸适体对比剂通过膀胱灌注的方式注入到荷瘤小鼠的膀胱内。由于早期膀胱癌具备腔内生长的特征，通过膀胱灌注可允许核酸适体对比剂与肿瘤的充分接触并结合。这种膀胱灌注的方式使得核酸适体对比剂无需进入血液循环从而避免了核酸适体的降解，同时也降低了对比剂全身分布所带来的毒副作用风险。经过核
酸适体对比剂与肿瘤组织的特异性结合之后，可进行膀胱冲洗的操作以除去未结合的对比剂，从而进一步提升肿瘤成像的信噪比。得益于核酸适体的高组织渗透特征，肌层浸润的肿瘤也有望被检测。由于核酸适体在尿液中的半衰期较长，结合后的核酸适体可以有效的滞留在肿瘤组织，从而显著提升肿瘤成像的时间窗。
83.另外，本发明合成策略还具有普适的特点，更换核酸适体序列可制得针对不同靶标的对比剂。发明人还以膀胱癌高表达的pd-l1和her2蛋白为例，选取相应的靶向核酸适配体：mj5c(5
’‑
tacaggttctggggggtgggtggggaacctgtt-3’)和2-2(t)(5
’‑
gcagcggtgtgggggcagcggtgtgggggcagcggtgtgggg-3’)，按照上述的合成方法，分别合成mj5c-gd(iii)-dota和2-2(t)-gd(iii)-dota；经过活体成像时可观察到明显的肿瘤部位高信号，见图6。
84.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。